Tài liệu Nghiên cứu bào chế và đánh giá tương đương sinh học viên phóng thích kéo dài chứa acid valproic và natri valproat (tóm tắt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH PHÙNG CHẤT NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN PHÓNG THÍCH KÉO DÀI CHỨA ACID VALPROIC VÀ NATRI VALPROAT Chuyên ngành:Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2017 Công trình được hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ HẬU Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH vào hồi ……..giờ……….ngày…….tháng……..năm ………. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TPHCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Acid valproic (AV) và natri valproat (NV) đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị các thể động kinh đơn giản và phức tạp. Với những ưu điểm nổi trội trong điều trị như giảm liều dùng, tăng hiệu quả kiểm soát bệnh động kinh, dạng bào chế phóng thích kéo dài (PTKD) của AV và NV đã được các Thầy thuốc chỉ định nhiều trong điều trị động kinh và rối loạn cảm xúc lưỡng cực. Với những tính chất đặc biệt của 2 loại dược chất (AV có dạng lỏng; NV có dạng rắn nhưng rất háo ẩm) cho nên việc bào chế dạng thuốc viên đi từ 2 thành phần này là khó khăn thách thức cho các nhà sản xuất dược phẩm. Vì vậy, cho đến hiện tại chưa có nơi nào trong nước sản xuất được dạng viên phối hợp 2 thành phần này. Đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tương đương sinh học viên phóng thích kéo dài chứa hoạt chất natri valproat và acid valproic” đã được chọn nghiên cứu với mục đích là tạo ra một sản phẩm thuốc có chất lượng và hiệu quả điều trị tương đương để cung cấp nhu cầu điều trị bệnh động kinh. Để thực hiện thành công đề tài này, cần tập trung giải quyết được các mục tiêu như sau : 1. Xây dựng công thức, quy trình bào chế viên PTKD chứa AV và NV ở qui mô phòng thí nghiệm. 2. Nâng cấp qui mô sản xuất 20.000 viên, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và theo dõi độ ổn định sản phẩm. 3. Xác định tương đương sinh học so với thuốc đối chiếu Depakine Chrono 500 mg. 2. Ý nghĩa khoa học và tính cấp thiết của đề tài Bệnh động kinh là một bệnh lý mạn tính của hệ thần kinh. Theo WHO, tỷ lệ mắc bệnh động kinh tại Việt Nam chiếm khoảng 2 % 2 dân số, trong đó gần 60% là trẻ em. Bệnh động kinh gây ra những ảnh hưởng sâu sắc đến chất lượng cuộc sống và làm giảm đáng kể năng suất lao động của người bệnh. Dạng thuốc PTKD chứa 2 dược chất AV và NV có nhiều ưu điểm hơn về hiệu quả điều trị so với các dạng bào chế cổ điển. Vì vậy, hiện nay nhu cầu sử dụng dạng thuốc này ngày càng tăng cao, trong khi nguồn cung ứng lệ thuộc hoàn toàn vào nhập khẩu. Việc nghiên cứu sản xuất trong nước một chế phẩm có chất lượng và hiệu quả trị liệu tương đương thuốc nhập khẩu sẽ góp phần giảm sự lệ thuộc vào nguồn cung ứng, giảm giá thành, nhờ đó giúp giảm đáng kể chi phí điều trị cho người bệnh. Mặt khác, về khía cạnh khoa học, sự thành công của đề tài sẽ góp phần thúc đẩy phát triển ngành kỹ thuật bào chế dạng thuốc PTKD, một công nghệ còn mới mẻ và đang được khuyến khích phát triển tại Việt Nam. 3. Những đóng góp mới của luận án Đóng góp mới về kỹ thuật bào chế thuốc viên PTKD chứa dược chất AV và NV Luận án đã thành công trong nghiên cứu bào chế thuốc viên PTKD kết hợp hai dạng hóa học của cùng một dược chất, trong đó có một thành phần là dạng lỏng (AV) chỉ bằng các kỹ thuật đơn thuần và sử dụng một loại tá dược hút phổ biến (Aerosil). Đây là công trình nghiên cứu bào chế kết hợp giữa 2 dược chất của AV và NV dưới dạng viên PTKD lần đầu tiên được công bố tại Việt Nam. Đóng góp mới về phương pháp định lượng AV và NV trong huyết tương. Phương pháp định lượng AV và NV trong máu bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (UHPLC-MS/MS) là một công trình mới, lần đầu tiên được thực hiện và công bố tại Việt Nam. Kết quả 3 đã tạo ra một phương pháp mới có tính ứng dụng thực tiễn, để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học cho các chế phẩm chứa AV, NV hoặc hỗn hợp của cả 2 thành phần này. Đóng góp mới về nghiên cứu tương đương sinh học thuốc chứa AV và NV Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế phẩm viên PTKD chứa AV và NV cũng là một công trình mới, lần đầu tiên thực hiện trên người tình nguyện tại Việt Nam. 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 4 chương, 94 bảng, 12 hình, 2 sơ đồ và 32 biểu đồ, 118 tài liệu tham khảo, 11 Phụ lục. Luận án gồm 149 trang chính : Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (26 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (39 trang), kết quả (65 trang), bàn luận (14 trang), kết luận và kiến nghị (3 trang). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đã tập hợp và trình bày một cách có hệ thống các tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài, gồm: tổng quan về hệ thống trị liệu PTKD đường uống và hệ thống PTKD khung matrix; tính chất lý hóa của các dược chất AV, NV; đặc điểm sinh học và tác dụng trị liệu của chế phẩm chứa AV, NV; các nghiên cứu về kỹ thuật bào chế viên PTKD chứa hoạt chất AV và NV; các phương pháp kiểm nghiệm hoạt chất trong chế phẩm và trong dịch sinh học; các nghiên cứu về dược động học và hiệu quả trị liệu các thuốc chứa AV và NV; tổng quan về nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học thuốc. CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu - Nguyên liệu AV (lô VA/12/002) và NV (lô SV/13/006) của 4 Nhà sản xuất Chempifine, đạt tiêu chuẩn BP; chất chuẩn AV đạt tiêu chuẩn USP, chất chuẩn NV đạt tiêu chuẩn BP. Các hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu kiểm nghiệm và nghiên cứu tương đương sinh học đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo qui định của DĐVN IV. - Các tá dược sử dụng trong bào chế đều đạt các tiêu chuẩn dược điển BP, USP, JP và DĐVN IV và có phiếu kiểm nghiệm.. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Xây dựng và thẩm định định lượng hoạt chất trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC, dựa trên sự chuyển đổi NV thành AV tự do trong môi trường pha động. - Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất hòa tan trong môi trường HCl 0,1N và các môi trường pH 1,2; 4,5; 5,5 và 6,8. Trên cơ sở này, khảo sát độ hòa tan và động học GPHC của viên đối chiếu, làm cơ sở xây dựng chỉ tiêu độ hòa tan và thiết kế bào chế sản phẩm nghiên cứu. - Khảo sát ảnh hưởng của polyme tạo khung và xây dựng công thức bào chế cơ bản, tối ưu hóa công thức bằng bố trí thí nghiệm bậc 1 và phương pháp tối ưu hóa tiến theo Gradient. - Xây dựng quy trình bào chế viên nhân qui mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp thực nghiệm. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố qui trình sản xuất (độ cứng viên) lên độ GPHC của sản phẩm. - Nâng cấp qui mô sản xuất lên cỡ lô 20.000 viên, đánh giá các thông số qui trình bằng thực nghiệm, kết hợp thẩm định bằng thống kê để kiểm soát sự ổn định của qui trình sản xuất. - Nghiên cứu chọn polyme và tỷ lệ sử dụng bao phim chống ẩm bằng thực nghiệm. Đánh giá sự ổn định các thông số qui trình bao phim bằng phương pháp thống kê. - Nghiên cứu tương đương hòa tan in vitro trong 3 môi trường 5 pH 1,2; 4,5 và 6, 8 dựa trên so sánh hệ số f2 44, 109. - Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm dựa trên các kết quả thực nghiệm và tham khảo các tài liệu chung về thuốc PTKD. - Nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ được tiến hành theo hướng dẫn theo dõi độ ổn định của Aesan 31. - Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AV trong huyết tương theo hướng dẫn của EMEA 47 và FDA 108. - Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học in vivo theo mô hình thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn và 2 trình tự, đánh giá trong cả 02 tình trạng no và đói 4, 30. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng công thức, quy trình bào chế viên PTKD chứa AV và NV qui mô phòng thí nghiệm. 3.1.1. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng hoạt chất trong chế phẩm bằng HPLC. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất trong chế phẩm. Phương pháp đã được áp dụng vào tiêu chuẩn để kiểm nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm (phụ lục 1). 3.1.2. Khảo sát độ GPHC của thuốc đối chiếu - Đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất hòa tan trong các môi trường thử (phụ lục 2,3,4 và 5), trên cơ sở đó đã khảo sát độ hòa tan của viên đối chiếu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2. (chi tiết trong phụ lục 6.1). - Đã xác định được mô hình động học GPHC từ viên đối chiếu, tuân theo mô hình Higuchi, có phương trình ŷ = 29,37 t - 17,69 - Đã dự kiến được tiêu chuẩn độ hòa tan của chế phẩm dựa trên kết quả khảo sát độ hòa tan của viên đối chiếu và tham khảo tài liệu qui định chung về tiêu chuẩn độ hòa tan thuốc PTKD 62, gồm: 6 + Môi trường HCl 0,1N :  10 % hoạt chất hòa tan sau 45 phút; + Môi trường pH 5,5: Từ 10 - 35 % hoạt chất hòa tan sau 2 giờ; 3565 % hoạt chất hòa tan sau 6 giờ và ≥ 75 % hoạt chất hòa tan sau 12 giờ. Phương pháp thử và chỉ tiêu độ hòa tan đã được đưa vào tiêu chuẩn cơ sở và áp dụng để đánh giá sản phẩm nghiên cứu. Bảng 3. 2. Độ hòa tan của viên đối chiếu Depakine Chrono 500 mg. Thời gian Độ hòa tan SD % Ghi chú Môi trường HCl 0,1 N (n = 18) 45 phút 3,55 0,58 Giờ 1 13,32 1,00 Giờ 2 22,58 1,28 Giờ 4 38,79 2,36 Giờ 6 54,84 3,22 Môi trường đệm pH Giờ 8 66,30 3,77 5,5 Giờ 10 77,5 5,61 Giờ 12 82,11 5,45 3.1.3. Nghiên cứu xây dựng công thức viên nhân. - Đã khảo sát chọn được các polyme tạo khung GPHC với các tỷ lệ cơ bản là 15% HPMC K15M , 2,5 % và 5,0% với HPMC 615. - Đã xây dựng công thức cơ bản gồm các tá dược tạo khung HPMC K15 M, HPMC 615 và các tá dược khác (aerosil, PVP K30, dicanxi phosphat, talc và magnesi stearat). - Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng với 2 biến độc lập là hàm lượng HPMC K15M (x1) và HPMC 615 (x2), biến phụ thuộc là y (độ hòa tan hoạt chất tại điểm 8 giờ) bằng phương pháp bố trí thực nghiệm bậc 1, mô hình 22 (2 biến x 2 mức). Kết quả đã xác định được yếu tố ảnh hưởng là hàm lượng HPMC K15M và phương trình bậc 1 biểu 7 diễn sự phụ thuộc giữa x1 và y là : ŷ = 76,43 - 60,64 x1 (R2 = 0,99) - Đã tiến hành các thực nghiệm tiến đến vùng tối ưu theo phương pháp tiến theo Gradient, với bước nhảy Sb1  - 0,72 (gồm các thực nghiệm TN6, TN7, TN8, TN 9 và TN 10). - Đã xác định được điểm tối ưu tại x1 = 17,16 % (hàm lượng HPMC K15 M là 120 mg/viên), tương ứng hàm lượng HPMC 615 được chọn là 20 mg/viên (TN 9), độ hòa tan so với thuốc đối chiếu đạt f2 = 82,2 (Chi tiết trong các phụ lục 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 và 6.6). - Đã kiểm chứng công thức tối ưu (TN 9) bằng thực nghiệm (TN 11). Kết quả độ hòa tan của sản phẩm kiểm chứng (TN 11) không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với công thức tối ưu (TN 9). Ngoài ra, sản phẩm kiểm chứng (TN 11) cũng đạt tương đương hòa tan so với thuốc đối chiếu, với hệ số f2 = 79,1 (chi tiết trong phụ lục 6.7). - Đã xác định được mô hình động học của viên nhân (TN 11) theo mô hình Higuchi, phương trình ŷ = 29,06 t -14,79 hệ số R2 = 0,998. 3.1.4. Bao phim chống ẩm cho viên nhân 3.1.4.1. Khảo sát lựa chọn loại tá dược bao chống ẩm Nghiên cứu so sánh khả năng chống ẩm của 3 polyme là ethyl cellulose (tỷ lệ dùng 1 % so với khối lượng viên nhân), Eudragit E 100 (tỷ lệ 2 % so với khối lượng viên nhân) và Opadry AMB (tỷ lệ 4 % so với khối lượng viên nhân) bằng thực nghiệm. Kết quả đã chọn được Eudragit E 100 để bao phim chống ẩm cho sản phẩm. 3.1.4.2. Khảo sát chọn tỷ lệ eudragit E 100 bao chống ẩm Đã đánh giá khả năng chống ẩm của màng phim theo các tỷ lệ eudragit E 100 lần lượt là 2 mg/cm2, 4 mg/cm2 và 6 mg/cm2 (tương ứng với 1,1 %; 2,2 % và 3,3 % so với khối lượng viên nhân). Kết quả đã xác định được tỷ lệ phù hợp là 4 mg/cm2 để bao phim chống ẩm. 3.1.5. Xây dựng qui trình bào chế viên nhân ở qui mô thí nghiệm 8 3.1.5.1. Thăm dò các thông số trọng yếu của qui trình Thời gian sấy bột nguyên liệu (t1) Đã xác định được thời gian sấy bột nguyên liệu (t1) từ 80 - 90 phút trên tủ sấy tĩnh, nhiệt độ sấy 700C (hàm ẩm bột yêu cầu  0,5%). Thông số trộn hỗn hợp bột nguyên liệu (t2) Kết quả đã xác định được thời gian trộn đồng nhất hỗn hợp bột nguyên liệu (t2) từ 10 - 20 phút trên máy trộn lập phương, tốc độ quay 30 vòng/phút (độ phân tán hàm lượng với CV % < 2 %). Thời gian trộn bột kép (t3) Kết quả đã xác định được thời gian trộn bột kép (t3) từ 2 - 4 phút trên máy trộn siêu tốc với tốc độ cánh trộn 150 v/phút và cánh đảo 1500 v/phút (có độ phân tán hàm lượng với CV % < 2 %). Thời gian sấy cốm (t4) Kết quả đã xác định được thời gian sấy cốm (t4) từ 90 - 100 phút trên tủ sấy tĩnh ở nhiệt độ sấy 700C (hàm ẩm cốm đạt yêu cầu  1,5%). Thông số trộn hoàn tất (t5) Kết quả đã xác định được thời gian trộn hoàn tất (t5) từ 10 - 20 phút trên máy trộn lập phương, với tốc độ quay 30 vòng/phút (có độ phân tán hàm lượng với CV % < 2 %). Độ trơn chảy Kết quả khảo sát cho thấy cốm đạt yêu cầu về độ trơn chảy từ tốt đến rất tốt, phù hợp để dập viên. Đánh giá tính chất hạt Kết quả khảo sát cho thấy tỷ trọng hạt (cốm) ít có sự khác biệt, phân bố cỡ hạt phù hợp cho dập viên. Đánh giá tính chất viên Viên nhân đạt yêu cầu về khối lượng viên (KLVTB  5 %), độ cứng viên (120 + 20 N), độ mài mòn (< 0,3 %), độ hòa tan đạt tương 9 đương so với viên đối chiếu (f2 = 70,5) Hàm lượng hoạt chất đạt trung bình 497,5 mg, nằm trong khoảng hàm lượng dự kiến của tiêu chuẩn (475 – 525 mg). 3.1.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố qui trình lên độ GPHC Đã chứng minh được bằng số liệu thực nghiệm với khoảng độ cứng trung bình của viên nhân từ 100 – 140 N cho thấy không gây ảnh hưởng lên độ GPHC của viên. 3.2. Nghiên cứu nâng cấp cỡ lô, xây dựng tiêu chuẩn và theo dõi độ ổn định. 3.2.1. Nâng cấp cỡ lô 3.2.1.1. Các kết quả từ lô thăm dò ở qui mô nâng cấp Nâng cấp qui mô sản xuất lên cỡ lô 20.000 viên dựa trên các kết quả khảo sát ở qui mô phòng thí nghiệm đã xác lập. Kết quả khảo sát từ lô sản xuất thăm dò đã xác định được các thông số cho qui trình ở qui mô nâng cấp, bao gồm : + Thời gian sấy hỗn hợp bột nguyên liệu : t1 = 80 phút + Thời gian trộn đồng nhất bột nguyên liệu : t2 = 10 phút + Thời gian trộn bột kép : t3 = 2 phút + Thời gian sấy cốm : t4 = 90 phút + Thời gian trộn hoàn tất cốm : t5 = 10 phút Các thông số này sẽ được áp dụng trên 3 lô nâng cấp. Xây dựng các biểu đồ kiểm soát quá trình dập viên của lô thăm dò. Kết quả đã xác lập được các giới hạn kiểm soát về khối lượng viên nhân (biểu đồ X) từ 694,61 mg - 705,42 mg, giới hạn cạnh báo khoảng từ 696,41 mg - 703,62 mg. Đối với giới hạn phạm vi quan sát (biểu đồ R) là khoảng từ 3,91 – 31,19 (chi tiết trong phụ lục 7.1). 3.2.1.2. Các kết quả từ các lô nâng cấp Kết quả đánh giá các thông số của qui trình trên 3 lô sản xuất thử 10 qui mô nâng cấp đã thu được các kết quả cụ thể như sau : Kết quả hàm ẩm hỗn hợp bột nguyên liệu sau khi sấy Hàm ẩm bột nguyên liệu đạt yêu cầu ( 0,5 %) sau khi sấy với thời gian t1 = 80 phút, ở nhiệt độ 70oC trên tủ sấy tĩnh. Kết quả độ phân tán hàm lượng trong hỗn hợp bột nguyên liệu Độ phân tán hàm lượng hoạt chất đạt yêu cầu (CV % < 2 %) và không khác biệt có ý nghĩa thống kê trên 3 lô ( p > 0,05) sau thời gian trộn t2 = 10 phút trên máy trộn lập phương, tốc độ 30 vòng/phút. Kết quả độ phân tán hàm lượng của khối bột kép sau trộn Độ phân tán hàm lượng đạt yêu cầu (CV % < 2 %) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) sau thời gian trộn kép t3 = 2 phút trên máy trộn siêu tốc, tốc độ cánh trộn 150 vòng/phút, cánh đảo 1500 vòng/phút. Kết quả hàm ẩm cốm sau khi sấy Hàm ẩm cốm của 3 lô đều đạt yêu cầu qui định ( 1,5 %) và khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) sau khi sấy cốm với thời gian t3 = 90 phút trên tủ sấy tĩnh, ở nhiệt độ sấy 700C. Kết quả khảo sát độ đồng đều hàm lượng trong cốm trộn hoàn tất. Kết quả cho thấy độ phân tán hàm lượng đạt yêu cầu (CV % < 2 %) và không khác biệt có ý nghĩa thống kê trên 3 lô ( p > 0,05) sau thời gian trộn t5 = 10 phút trên máy trộn lập phương, tốc độ quay 30 vòng/phút. Kết quả xác định các thông số hạt Các kết quả đánh giá các thông số hạt trên 3 lô nâng cấp là : + Tỷ trọng giữa 3 lô tương đồng nhau ( p = 0,302 > 0,005). + Độ trơn chảy của cốm đạt rất tốt và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 lô ( p > 0,05). + Phân bố cỡ hạt tập trung chủ yếu từ 0,42 - 0,84 mm, phù hợp để dập viên và giữa 3 lô không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 11 Kiểm soát thống kê khối lượng viên trong quá trình dập viên Các kết quả thống kê cho thấy khối lượng trung bình viên ở các giai đoạn trong cùng 1 lô, cũng như khối lượng trung bình viên giữa 3 lô đều không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (chi tiết trong phụ lục 7.2, 7.3 và 7.4). Các biể u đồ kiể m soát pha ̣m vi và kiể m soát khố i lươ ̣ng viên của các lô P010214, P 020214 và P030214 đã thể hiện được sự ổn định của khối lượng viên trong quá trình dập viên, không có giai đoạn nào vượt ra khỏi vùng giới hạn cảnh báo. Các thông số kỹ thuật viên nhân của 3 lô nâng cấp Độ cứng, độ mài mòn của viên nhân 3 lô đều đạt các yêu cầu qui định và không có khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 lô (p > 0,05). Kết quả định lượng và thử độ hòa tan của viên nhân 3 lô nâng cấp Hàm lượng của các lô P 010214. P020214 và P030614 lần lượt là 103,8 %; 102,4 % và 99,3 %, đều đạt yêu cầu tiêu chuẩn. Độ hòa tan của 3 lô được trình bày trong bảng 3.48 (Chi tiết trong các phụ lục 6.9, 6.10 và 6.11) Bảng 3. 48. Kế t quả thử độ hòa tan các viên nhân của 3 lô nâng cấp. Thời gian % hoạt chất hòa tan theo thời gian, n = 12 viên (giờ) Lô P010214 Lô P020214 Lô P030214 1 17,06 17,37 16,26 2 25,69 27,35 26,70 4 42,64 44,66 43,45 6 56,94 55,53 57,62 8 72,03 71,41 69,94 10 82,16 79,96 79,14 12 89,91 91,43 87,61 12 Từ bảng 3.48 cho thấy độ hòa tan của viên nhân 3 lô nâng cấp tương đương nhau (hệ số f2 > 75) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Khi so với viên nhân ở qui mô phòng thí nghiệm, độ hòa tan viên nhân các lô nâng cấp cũng không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Các kết quả trên đã cho thấy qui trình nâng cấp thành công. Bao phim và kiểm soát qui trình trong giai đoạn bao phim Kết quả theo dõi các thông số bao được thể hiện ở Biểu đồ 3.21. Thông số 80 70 60 50 Tốc độ nồi 40 tốc độ phun dịch Nhiệt độ mặt viên 30 Nhiệt độ cài đặt 20 10 0 0 30 60 90 120 150 180 Thơi gian (phút) Biểu đồ 3.21. Diễn biến các thông số trong giai đoạn bao phim chống ẩm lô P010214. Qua biểu đồ Biểu đồ 3.21 cho thấy trong 30 phút đầu, các thông số chưa ổn định vì đang trong giai đoạn hiệu chỉnh. Từ phút thứ 30 cho đến kết thúc, các thông số đều ổn định và không cần hiệu chỉnh. Quá trình bao phim của các lô P020214 và P030614 cũng có sự ổn định tương tự. Kết quả đo độ hòa tan viên bao phim các lô P010214, P020214 và P030614 được trình bày ở Biểu đồ 3.24 (chi tiết trong các phụ lục 6.12, 6.13 và 6.14). 13 100 90 % HC giải phóng 80 70 60 50 40 30 20 Lô P010214 Lô P020214 Viên đối chiếu Lô P030614 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Thời gian (giờ) Biểu đồ 3. 24. Đồ thị độ hòa tan viên bao phim của 3 lô nâng cấp. Qua biểu đồ 3.24 cho thấy độ hòa tan của 3 lô đều đạt tiêu chuẩn và tương đương hòa tan so với thuốc đối chiếu. Viên bao phim và viên nhân tương ứng mỗi lô đều đạt tương đương hòa tan, có hệ số f2 > 70. Hàm lượng hoạt chất của 3 lô nâng cấp cũng đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn qui định. Với chất lượng đã xác định và cỡ lô đã sản xuất, các sản phẩm từ 3 lô nâng cấp được sử dụng cho nghiên cứu độ ổn định và tương đương sinh học. 3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Đã đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm (chi tiết trong phụ lục 11). Tiêu chuẩn này đã Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương thẩm định và được áp dụng để kiểm nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm trong nghiên cứu và theo dõi độ ổn định. 3.2.3. Đánh giá độ ổn định Các lô theo dõi độ ổn định gồm P 010214; P 020214 và P 030614. Sản phẩm đóng trong chai thủy tinh 40 viên, miệng seal kín, hộp 1 chai. 3.2.3.1. Kết quả đánh giá độ ổn định theo phương pháp lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 + 2oC; độ ẩm tương đối 75 + 5%) Sản phẩm đạt độ ổn định sau 6 tháng theo dõi. Tuy nhiên, không dùng để dự đoán tuổi thọ thực nghiệm do lô P 010214 có sự giảm 14 hàm lượng > 5,0 % so với thời điểm ban đầu (giảm 7,8 %) 31. 3.2.3.3. Kết quả đánh giá độ ổn định trong điều kiện theo dõi thực (nhiệt độ 30 + 2oC; độ ẩm tương đối 75 + 5%) Kết quả đánh giá về cảm quan, hàm lượng của 3 lô sau 18 tháng theo dõi được trình bày trong bảng 3.57. Bảng 3. 57. Kết quả theo dõi trong điều kiện thực các lô sản phẩm. Tháng Cảm quan Hàm lượng (%) theo natri valproat P010214 P020214 P030614 P010214 P020214 P030614 0 Đạt Đạt Đạt 103,6 102,0 98,7 3 Đạt Đạt Đạt 102,2 97,5 99,1 6 Đạt Đạt Đạt 104,8 101,2 98,0 9 Đạt Đạt Đạt 102,4 100,4 97,4 12 Đạt Đạt Đạt 101,9 100,5 97,4 18 Đạt Đạt Đạt 101,4 100,8 100,0 Kết quả bảng 3.57 cho thấy sản phẩm đạt chất lượng theo tiêu chuẩn sau 18 tháng theo dõi. Ở thời điểm 3 tháng, lô P020214 có hàm lượng thấp bất thường, nguyên nhân có thể do sai số thô trong kiểm nghiệm mẫu. Với kết quả này, nếu cộng thêm thời gian lưu mẫu (t0) thì độ ổn định của 3 lô sản phẩm đều đã hơn 24 tháng. 3.3. NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC IN VIVO 3.3.1. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng hoạt chất trong huyết tương 3.3.1.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống đã thu được kết quả đáp ứng pic và thời gian lưu của 6 lần phân tích độc lập đều có giá trị RSD % < 2 %, cho thấy hệ thống đã đạt được sự tương thích. 15 3.3.1.2. Độ đặc hiệu Kết quả sắc ký mẫu huyết tương trắng cho thấy tại thời gian lưu của AV và chuẩn nội (IS) không có pic. Mẫu huyết tương thêm AV ở nồng độ LLOQ (1g/ml) và nội chuẩn (5 µg/ml) có các pic đặc trưng của AV và IS, với các đáp ứng pic (so với mẫu trắng) tại thời gian lưu của AV > 5 lần, tại thời gian lưu của IS > 20 lần. Các kết quả này cho phép kết luận phương pháp sắc ký đạt tính đặc hiệu yêu cầu. 3.3.1.3. Độ nhiễm chéo Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo của phương pháp đã thu được kết quả : Tỷ lệ đáp ứng pic của các mẫu LLOQ/mẫu trắng tại thời gian lưu của AV đều có giá trị > 5 lần, tại thời gian lưu của IS đều > 20 lần. Với kết quả trên cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ nhiễm chéo. 3.3.1.4. Ảnh hưởng của nền mẫu Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trên 2 nồng độ LQC và HQC có độ lặp lại về tỷ số MFAV/MFIS ở nồng độ LQC với CV % = 11,9 %, ở nồng độ HQC với CV % = 12,4 % (đều  15 %). Kết luận nền mẫu không ảnh hưởng đến kết quả phân tích. 3.3.1.5. Khoảng tuyến tính Kết quả đã xác định được khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp là từ 1- 100 µg/ml, với hệ số trọng số (weighting) 1/x2. 3.3.1.6. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) Kết quả phân tích cho thấy độ đúng đạt trong giới hạn 80 - 120 % so với nồng độ thực; Độ chính xác có CV % < 20 %; Đáp ứng của mẫu LLOQ > 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại thời gian lưu của AV và lớn hơn 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tại thời gian lưu của IS. Với kết quả trên cho thấy nồng độ 1g/ml là LLOQ của phương pháp. 3.3.1.7. Độ đúng và độ chính xác Kết quả phân tích các mẫu kiểm tra đã cho thấy : 16 - Độ đúng trong ngày và khác ngày đều từ 85 – 115 %. - Độ chính xác (CV %) trong ngày và khác ngày đều  15 %. Với các kết quả trên, cho phép kết luận phương pháp đạt độ đúng và độ chính xác yêu cầu. 3.3.1.8. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp khi pha loãng Các kết quả thực nghiệm cho thấy ở tất cả các nồng độ khảo sát (AC1, AC2 và AC3) đều có độ đúng trong khoảng 85 % - 115% so với giá trị thực, độ lặp lại có CV %  15 %. Với các kết quả trên cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng và độ chính xác khi pha loãng. 3.3.1.9. Độ phục hồi Kết quả khảo sát trên các mẫu LQC, MQC và HQC cho thấy tỷ lệ thu hồi của IS đạt 100,5 %, tỷ lệ thu hồi trung bình của AV ở các nồng độ đều đạt từ 99,6 – 104,8 %. Giá trị CV % của các mẫu xử lý chiết tách và không qua xử lý (pha trong nền mẫu) đều  10 %. Với kết quả trên cho thấy phương pháp đạt độ phục hồi qui định. 3.3.1.10. Độ ổn định Kết quả độ ổn định của các dung dịch và mẫu khảo sát thu được là: - Dung dịch nội chuẩn gốc dài ngày: 33 ngày ở nhiệt độ 2- 80C; - Dung dịch nội chuẩn làm việc: 4 giờ ở nhiệt độ phòng; - Mẫu huyết tương thời gian ngắn: 5 giờ ở nhiệt độ phòng; - Mẫu huyết tương thời gian dài: 53 ngày ở nhiệt độ - 350C+ 50C; -Mẫu huyết tương đông – rã: 3 vòng; - Độ ổn định mẫu trong auto – sampler: 20 giờ ở 200C. 3.3.2. Đánh giá tương đương hòa tan in vitro Tương đương độ hòa tan của chế phẩm nghiên cứu (lô P030614) so với thuốc đối chiếu Depakine Chrono 500 mg (lô 3A780) thực hiện trong 3 môi trường pH 1,2; 4,5 và 6,8 (chi tiết trong các phụ lục 6.15, 17 6.16, 6.17, 6.18, 6.19 và 6.20). Kết quả đều có f2 > 50, cho phép kết luận 2 chế phẩm đạt tương đương hòa tan in vitro. 3.3.3. Đánh giá tương đương sinh học In vivo 3.3.3.1. Thủ tục pháp lý Các thủ tục pháp lý cần thiết đã được hoàn tất trước khi tiến hành quá trình đánh giá tương đương sinh học. 3.3.3.2. Đánh giá tương đương sinh học trong tình trạng đói Xác định các thông số dược động học trung bình tình trạng đói Các thông số DĐH trung bình của 12 NTN uống thuốc thử và thuốc đối chiếu tình trạng đói được trình bày trong bảng 3.65. (Chi tiết trong phụ lục 10.4 và 10.5). Bảng 3. 65. Các thông số dược động học TB của 12 NTN dùng thuốc thử và thuốc đối chiếu tình trạng đói. Thông số Cmax  SD AUC0-72  SD AUC0- SD Tmax (µg/ml) (µg.giờ/ml) (µg.giờ/ml) SD (giờ) Chế phẩm Thuốc thử Thuốc đối chiếu 41,3 6,7 1047,0 250,9 1120,3 289,7 Ke 8,61,3 0,0450,01 37,37,2 1018,0 237,1 1104,4 270,8 10,42,4 0,043 0,09 Kết quả bảng 3.65 cho thấy chỉ có Tmax là có sự khác biệt rõ, các thông số dược động học trung bình còn lại ít khác biệt giữa 2 thuốc. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thông số DĐH tình trạng đói Đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng lên Cmax là trình tự thử, cá thể và thuốc; yếu tố ảnh hưởng lên AUC là cá thể. Các kết quả trên cho thấy yếu tố cá thể có ảnh hưởng nhiều đến sinh khả dụng của AV. Với các giá trị CV % nhỏ, hệ số độ mạnh của phép thử đạt giá trị cao (power > 99 %), dao động trong cá thể không lớn. Điều này phép kết luận các thử nghiệm có độ lặp lại khá tốt. 18 So sánh Cmax , AUC, Tmax của 2 thuốc trong tình trạng đói Kết quả tóm tắt Cmax, AUC của 2 thuốc được trình bày ở bảng 3.69. Bảng 3.69. Tóm tắt Cmax, AUC của 2 thuốc trong tình trạng đói. Thông Giá trị TB* Giá trị TB* số Tỷ lệ giá trị TB*thuốc Khoảng tin thuốc Thử thuốc đối chiếu thử/thuốc đối chiếu (%) cậy 90 % 40,803 36,699 111,2 103,75 % - 119,14 % AUC0-t 1018,556 992,057 102,7 97,04 % - 108,62 % AUC0- 1085,060 1073,094 101,1 95,61 % - 106,94 % Cmax * giá trị trung bình hình học. Kết quả so sánh theo thống kê phi tham số cho thấy Tmax của 2 thuốc trong tình trạng đói khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Kết luận tương đương sinh học tình trạng đói Dựa trên các kết quả thu được (bảng 3.69 và Tmax không khác nhau) cho phép kết luận hai thuốc đạt tương đương sinh học in vivo theo hướng dẫn của ASEAN 2004 trong tình trạng đói (phụ lục 10.13) 3.3.3.3. Đánh giá tương đương sinh học trong tình trạng no Các thông số DĐH trung bình của 12 NTN uống thuốc thử và thuốc đối chiếu tình trạng no được trình bày trong bảng 3.70. (Chi tiết trong phụ lục 10.10 và 10.11). Bảng 3. 70. Thông số DĐH TB của 12 NTN dùng thuốc thử và thuốc đối chiếu tình trạng no. Thông số Cmax  SD AUC0-72  SD AUC0- SD Tmax SD Chế phẩm Thuốc thử Thuốc đối chiếu (µg/ml) (µg.giờ/ml) (µg.giờ/ml) (giờ) Ke 55,512,6 1330,5374,9 1441,8 429,3 7,61,3 0,0410,009 44,97,5 1391,0 337,5 1538,4426,6 10,62,1 0,0370,006 Qua Bảng 3.70 cho thấy thời gian đạt Cmax của thuốc thử sớm