Tài liệu Nghiên cứu bán định lượng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phương pháp hptlc

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, xin cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới những ngƣời đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và luôn ở bên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đầu tiên tới TS. Nguyễn Thị Thuận, giảng viên bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn cho tôi thực hiện đề tài này. Cùng với tri thức và tâm huyết của mình, cô đã truyền đạt cho tôi vốn kiến thức quý báu, lòng say mê công việc, tác phong làm việc nghiêm túc, khoa học... Em xin cảm ơn cô! Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị trong khoa Vật lý đo lƣờng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đƣợc khóa luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè là những nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao, đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, 5/2014 Sinh viên Phạm Kim Anh MỤC LỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Trang Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu. ......................................................... 2 1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B6, B12 ....................................................... 2 1.1.1.1. Vitamin B1 (Thiamin) .................................................................... 2 1.1.1.2. Vitamin B6 (Pyridoxin) .................................................................. 2 1.1.1.3. Vitamin B12 (Cobalamin) ............................................................... 3 1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B1, B6, B12 trên thị trƣờng ................. 4 1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử dụng hiện nay ................................................................................................. 5 1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ............. 6 1.2.1. Nguyên lý chung của TLC ................................................................... 6 1.2.2. Pha tĩnh trong TLC .............................................................................. 7 1.2.3. Pha động trong TLC............................................................................. 7 1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC .......................................... 8 1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng ........................................................................ 8 1.2.4.2. Đƣa mẫu phân tích lên bản mỏng .................................................. 8 1.2.4.3. Khai triển sắc ký với pha động phù hợp ........................................ 8 1.2.4.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ ..................................................... 9 1.2.5. Ứng dụng của TLC ............................................................................ 10 1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ............................................... 10 1.4. Vài nét về bán định lƣợng (Semiquantitative) ......................................... 12 1.4.1. Khái niệm bán định lƣợng ................................................................. 12 1.4.2. Bán định lƣợng bằng HPTLC với phần mềm VideoScan ................. 12 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất và dụng cụ. ........................... 14 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. ....................................................................... 14 2.1.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử. .......................................................... 15 2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị. ...................................................................... 16 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện phát hiện .............................. 16 2.2.2. Đánh giá phƣơng pháp ....................................................................... 17 2.2.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu .............................................................. 17 2.2.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ............................................. 17 2.2.2.3. Độ lặp lại ...................................................................................... 18 2.2.2.4. Độ đúng ........................................................................................ 18 2.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp trên một số chế phẩm thuốc lƣu hành trên thị trƣờng ........................................................................................................... 19 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. .......................... 21 3.1. Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn và thử. ......................................... 21 3.1.1. Pha mẫu trắng và dung dịch chuẩn gốc ............................................. 21 3.1.2. Pha dung dịch chuẩn .......................................................................... 21 3.1.3. Pha dung dịch thử .............................................................................. 22 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 22 3.2.1. Khảo sát thành phần pha động ........................................................... 22 3.2.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ........................................................... 24 3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên bản mỏng và các điều kiện sắc ký khác. .................................................................................................. 24 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ............................................................. 26 3.3.1. Bán định lƣợng B1 và B6 .................................................................... 26 3.3.1.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc................................................................. 26 3.3.1.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính. .............................................. 27 3.3.1.3. Độ lặp lại và độ đúng. .................................................................. 29 3.3.2. Bán định lƣợng B12 ............................................................................ 32 3.3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc................................................................. 32 3.3.2.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính ............................................... 33 3.3.2.3. Độ lặp lại và độ đúng ................................................................... 35 3.4. Ứng dụng bán định lƣợng vitamin trong một số chế phẩm thuốc ........... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT AOAC : Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists) CT CPDP : Công ty cổ phần dƣợc phẩm CT TNHH : : Công ty trách nhiệm hữu hạn EtOH : Ethanol HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC : Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography) Pyridoxin .HCl : Pyridoxin hydroclorid r : Hệ số tƣơng quan Rf : Hệ số lƣu giữ RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation). Thiamin .HCl : Thiamin hydroclorid TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography). USP : Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoea). UV : Tử ngoại (Ultra Violet). VIS : Khả kiến (Visible). DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B thƣờng dùng và ƣu nhƣợc điểm............................................................................. 5 Bảng 1.2: So sánh một số tham số của TLC và HPTLC........................... 11 Bảng 2.1: Các chế phẩm đƣợc nghiên cứu trong khóa luận...................... 14 Bảng 2.2: Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích............... 15 Bảng 3.1: Kết quả phân tích vitamin B1, B6 trên dãy dung dịch chuẩn..... 28 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B1, B6.......................................... 30 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đúng – B1, B6............................................ 31 Bảng 3.4: Kết quả phân tích vitamin B12 trên dãy dung dịch chuẩn.......... 34 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B12............................................... 36 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng – B12................................................ 37 Bảng 3.7: Phần trăm hàm lƣợng các vitamin trong các chế phẩm so với nhãn............................................................................................................ 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC................................................ 11 Hình 3.1: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 1................................. 23 Hình 3.2: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 2................................. 23 Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu trên bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 kích thƣớc 20 x 10 cm............................................................................... 25 Hình 3.4: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B1, B6 khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 366 nm...................................................................................... 26 Hình 3.5: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B1 và B6 thu đƣợc với phần mềm VideoScan................................................................................ 27 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn vitamin B1........................................................... 28 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn vitamin B6........................................................... 29 Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B1 và B6 ở bƣớc sóng 366 nm............................................................................................... 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B12 khi quan sát dƣới ánh sáng khả kiến...................................................................................................... 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B12 thu đƣợc với phần mềm VideoScan......................................................................................... 33 Hình 3.11: Đƣờng chuẩn vitamin B12....................................................... 34 Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B12 ở ánh sáng khả kiến...................................................................................................... 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trên thị trƣờng có rất nhiều loại thuốc chứa hỗn hợp các vitamin, hay gặp là dạng kết hợp các vitamin nhóm B. Theo thống kê từ danh mục thuốc đã đƣợc cấp số đăng ký của Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam, từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2014 có gần 500 chế phẩm thuốc multivitamin đã đƣợc cấp số đăng ký lƣu hành trên thị trƣờng, trong đó khoảng 150 thuốc có thành phần kết hợp 3 loại vitamin: B1, B6, B12 [2]. Vitamin là nhóm chất rất dễ bị phân hủy bởi nhiều tác nhân lý hóa (nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, các ion kim loại...) làm giảm hàm lƣợng trong thuốc theo thời gian và điều kiện bảo quản. Vì vậy, công tác kiểm tra chất lƣợng của các thuốc chứa vitamin nói riêng và các thuốc nói chung rất cần đƣợc quan tâm. Các phƣơng pháp hay đƣợc dùng để định lƣợng hỗn hợp vitamin hiện nay là HPLC [3], quang phổ UV – VIS [4], [13]. Phƣơng pháp TLC mới chỉ đƣợc sử dụng chủ yếu với mục đích định tính, thử tinh khiết. Tuy nhiên, từ khi xuất hiện HPTLC, một kỹ thuật cải tiến của TLC thì việc sử dụng HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng hoạt chất đã trở nên phổ biến hơn. Áp dụng kỹ thuật HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng các vitamin trong hỗn hợp có một số ƣu điểm nhƣ: tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều vitamin trong hỗn hợp, tiết kiệm thời gian, hóa chất. Vì vậy, để đóng góp thêm một phƣơng pháp kiểm tra sơ bộ chất lƣợng thuốc hỗn hợp vitamin cho các nhà sản xuất, kinh doanh thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bán định lƣợng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phƣơng pháp HPTLC” với các mục tiêu: 1. Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng các vitamin B1, B6, B12 trong hỗn hợp bằng HPTLC. 2. Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu. Mặc dù trên thị trƣờng có rất nhiều các chế phẩm multivitamin mà thành phần là hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí có chế phẩm chứa tới 9 – 10 loại vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu bán định lƣợng các vitamin B1, B6, B12 trong các chế phẩm thuốc chứa 3 loại vitamin này. 1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B6, B12 [6], [13]. 1.1.1.1. Vitamin B1 (Thiamin) - Trên thị trƣờng hiện nay, thiamin thƣờng đƣợc dùng dƣới dạng muối hydroclorid và nitrat, 2 dạng muối này có tính chất tƣơng tự nhau. Công thức: H3C N S NH2 N CH2CH2OH .Cl-.HCl (NO3-) N CH3 - Tính chất: Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, vị đắng, dễ tan trong nƣớc (1g/1ml), khó tan trong EtOH (1g/315ml cồn tuyệt đối), không tan trong ether, benzen và chloroform. Độ ổn định: thiamin hydroclorid ổn định trong dung dịch nƣớc (có pH từ 2 – 3,5). Do chứa dị vòng thơm nên thiamin hấp thụ mạnh bức xạ UV. - Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri – beri, phối hợp với B6, B12 điều trị các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh lƣng, hông, dây thần kinh sinh ba, dùng trong trƣờng hợp mệt mỏi, kém ăn, suy dinh dƣỡng. 1.1.1.2. Vitamin B6 (Pyridoxin) - Vitamin B6 là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở vị trí nhóm chức số 4 là: pyridoxol, piridoxal, pyridoxamin (1). Chế phẩm dƣợc 3 dụng là dạng muối pyridoxol hydroclorid, thƣờng gọi là pyridoxin hydroclorid (2). N R=CH2NH2: Pyridoxamin R= CHO: Pyridoxal N R= CH2OH: Pyridoxol OH HOH2C CH3 R (1) HOH2C CH3 OH . HCl CH2OH (2) - Tính chất: Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong EtOH (1g/90ml), không tan trong chloroform, ether. Pyridoxin hydroclorid hấp thụ mạnh bức xạ UV, ổn định trong môi trƣờng nƣớc với pH từ 2 – 4,5. - Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh thiếu vitamin B6, biểu hiện: tổn thƣơng ở mắt, mũi, miệng, gây co giật, sƣng đỏ khớp cổ tay, thiếu máu, phòng chống viêm dây thần kinh ngoại vi do dùng isoniazid, điều trị quá liều isoniazid. 1.1.1.3. Vitamin B12 (Cobalamin) - Dạng dƣợc dụng thƣờng đƣợc dùng hiện nay ở Việt Nam của vitamin B12 là cyanocobalamin, công thức: - Tính chất: Cyanocobalamin là những tinh thể màu đỏ tối hoặc bột vô định hình, tan đƣợc trong nƣớc (1g/1,3ml), EtOH (1g/1,3ml), không tan trong chloroform và ether. Cyanocobalamin hấp thụ mạnh cả bức xạ vùng tử ngoại 4 và khả kiến, dễ bị phân hủy bởi các tác nhân nhƣ oxi, ánh sáng mặt trời, độ ẩm, các ion kim loại, khi ở trong dung dịch nƣớc có mặt các chất khác nhƣ vitamin B1, C, PP... - Tác dụng: Điều trị các bệnh thiếu máu ƣu sắc hồng cầu to do thiếu vitamin B12, phòng thiếu máu khi phẫu thuật cắt dạ dày hoặc hồi tràng, viêm đau dây thần kinh... 1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B1, B6, B12 trên thị trƣờng [2]. Trên thị trƣờng hiện nay có rất nhiều loại chế phẩm chứa B1, B6, B12 với công dụng chung là: Điều trị các bệnh liên quan đến thiếu vitamin nhóm B, suy nhƣợc cơ thể, chán ăn, thiếu máu, ngƣời mới ốm dậy, đau nhức do nguyên nhân thấp khớp hay thần kinh, rối loạn thần kinh do nghiện rƣợu mạn tính. Các dạng thuốc thƣờng gặp là: - Dạng phối hợp B1 – B6 – B12 với tỉ lệ các thành phần rất khác nhau: Viên nén, thƣờng có hàm lƣợng B1 – B6 – B12 là 125 mg – 125 mg – 125 µg (Caditrivit – US Pharma, Vitamin 3B – CT CPDP Quảng Bình,...), hoặc 100 mg – 200 mg – 200 µg (Scanneuron – CT TNHH STADA Việt Nam, Betex – CT TNHH The United Drug Thái Lan...)... Dung dịch tiêm (Neurobion H5000 – Merck, Enpovit 3B – CTCP SPM...). Ngoài ra còn có dạng viên nang mềm, dạng cốm. - Dạng kết hợp B1, B6, B12 ở liều nhỏ hơn dạng thuốc 3B nói trên hàng chục lần với các loại vitamin và acid amin khác: viên nang (Moriamin Forte – CT Roussel Việt Nam, Vitacap – CT TNHH Mega Lifesciences Thái Lan...), viên sủi (Sunlife Multivitamin của Đức, Haas Multivitamin của Hungari...), dạng siro uống (Pediakids – Pháp, TGB Kidbaomin Plus – Việt Nam...)... 5 1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử dụng hiện nay (bảng 1.1). Bảng 1.1: Các phương pháp định lượng hỗn hợp vitamin 3B thường dùng và ưu nhược điểm. Phƣơng pháp định lƣợng Ƣu điểm chính - Tiến hành nhanh. Quang phổ UV-VIS [3]. - Cho kết quả có độ chính xác cao. Nhƣợc điểm chính - Chỉ định lƣợng đƣợc hỗn hợp chứa 2-3 thành phần, không định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều hoạt chất. - Không đặc hiệu. - Dung môi, hóa chất đắt tiền - Đặc hiệu. - Độ lặp lại và độ (dung môi yêu cầu lọc loại khí chính xác cao. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [4], [13]. hoặc dùng loại chuyên dụng, - Định lƣợng đƣợc tốn nhiều dung môi). hỗn hợp nhiều - Thời gian phân tích lâu. thành phần. - Dễ tắc cột, khó bảo dƣỡng thiết bị. Định lƣợng riêng - Có thể áp dụng cho - Cần thực hiện nhiều thao tác, từng vitamin sử dụng hỗn hợp chứa cả tốn công sức và thời gian. kết hợp nhiều phƣơng vitamin tan trong pháp: quang phổ hấp dầu và vitamin tan thụ UV, phƣơng pháp trong nƣớc. hóa học [12]. 6 Ngoài ra, hiện nay phƣơng pháp điện di mao quản cũng đã đƣợc nghiên cứu để định lƣợng hỗn hợp các vitamin tan trong nƣớc [5]. Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của các phƣơng pháp định lƣợng trên, đó là thao tác phức tạp, thời gian tiến hành lâu (HPLC, phƣơng pháp định lƣợng riêng từng thành phần) hoặc không định lƣợng đƣợc mẫu có thành phần phức tạp (UV – VIS). Lý do là HPTLC có thao tác đơn giản, cho phép phân tích đƣợc đồng thời một số lƣợng lớn mẫu thử chứa nhiều hoạt chất nên tiết kiệm thời gian. Ngoài ra nó còn một số ƣu điểm khác nhƣ có độ chọn lọc cao, sử dụng lƣợng nhỏ dung môi cho pha động nên tiết kiệm chi phí, tránh ô nhiễm môi trƣờng... [14], [15]. 1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [1], [14], [19]. 1.2.1. Nguyên lý chung của TLC - Sắc ký lớp mỏng là một trong các kỹ thuật tách sắc ký, trong đó dung dịch chất phân tích đƣợc di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn. Trong quá trình di chuyển, các thành phần trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc chuyển dịch trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau tùy vào bản chất của chúng. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. - Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số lƣu giữ Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf a b 7 Trong đó: a là khoảng dịch chuyển của chất phân tích; b là khoảng dịch chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1. - Trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 – 0,8 sẽ đạt độ phân giải cực trị. 1.2.2. Pha tĩnh trong TLC - Pha tĩnh là một lớp mỏng các chất ở dạng hạt nhỏ có kích thƣớc đồng nhất, đƣợc trải thành lớp mỏng và đƣợc cố định trên một mặt phẳng (thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo). Các pha tĩnh đƣợc sử dụng dựa trên nhiều cơ chế phân tách khác nhau: phân bố, hấp thu, rây phân tử, trao đổi ion, điện di, ái lực... Một số chất thƣờng dùng làm pha tĩnh cho TLC: phổ biến nhất là silica (SiO2) và alumina (Al2O3), ngoài ra còn có dẫn chất siloxan, cellulose, cellulose trao đổi ion, cát biển, gel sephadex… Nhiều khi ngƣời ta còn đƣa thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất cần phân tích. - Khi phân tích vitamin thƣờng dùng pha tĩnh silica, khi đó quá trình sắc ký sẽ dựa trên cơ chế hấp phụ. 1.2.3. Pha động trong TLC - Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn hệ dung môi pha động là độ phân cực và pH của nó. Cách tốt nhất là lựa chọn pha động bằng thực nghiệm dựa trên cơ sở: - Về độ phân cực: nếu chất phân tích có độ phân cực kém, chọn chất hấp phụ phân cực mạnh (silica gel, Al2O3), hệ dung môi khai triển có độ phân cực 8 kém (hexan, toluen, benzen...). Ngƣợc lại chất phân tích dạng ion hay phân cực sẽ đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân cực (methanol, nƣớc...). - Về độ pH của pha động: Nếu thêm một lƣợng nhỏ acid acetic hoặc amoniac vào dung môi chứa nƣớc sẽ làm tăng đáng kể độ tan của base hoặc acid tƣơng ứng, chất phân tích sẽ di chuyển nhanh hơn và vết gọn hơn. 1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC 1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng Đối với bản mỏng silica gel, khi bảo quản trong điều kiện thƣờng, các đơn vị silanol chứa nhóm hydroxyl của silica gel dễ dàng hấp phụ nƣớc trong không khí, làm giảm khả năng hấp phụ chất phân tích của nó. Do vậy, bản mỏng silicagel thƣờng đƣợc sấy ở 100 – 120oC trong 1 – 2h để loại nƣớc hấp phụ, mà không làm mất đi nhóm hydroxyl của đơn vị silica gel. Khả năng hấp phụ của silica gel cao nhất khi đƣợc hoạt hóa ở 105oC trong 2h. Ngoài ra, bản mỏng nên đƣợc rửa sạch trƣớc khi khai triển để loại bỏ bụi bẩn trên bề mặt nếu bảo quản không tốt. Dung môi rửa có thể là methanol, methanol – dicloromethan (1:1) hoặc isopropanol. Cho dung môi chạy hết bản mỏng, sau đó hoạt hóa lại bản mỏng đã rửa trong tủ sấy [10]. 1.2.4.2. Đƣa mẫu phân tích lên bản mỏng Lƣợng mẫu đƣa lên bản mỏng ảnh hƣởng lớn tới trị số Rf và hiệu quả tách sắc ký. Nếu lƣợng chất quá lớn, vết sắc ký sẽ lớn và bị kéo dài, khi đó các vết có trị số Rf gần nhau sẽ chồng lên nhau. Nếu lƣợng chất quá nhỏ sẽ không phát hiện đƣợc vết. Vị trí đƣa mẫu lên bản mỏng cần đảm bảo không quá gần bề mặt pha động, các vết cách rìa bản mỏng và cách nhau đủ xa để không bị ảnh hƣởng bởi hiệu ứng bờ và các vết khác khi khai triển. 1.2.4.3. Khai triển sắc ký với pha động phù hợp 9 Khai triển sắc ký trong bình thủy tinh có nắp đậy kín. Để tăng độ bão hòa dung môi trƣớc khi khai triển, thƣờng đặt một tờ giấy lọc áp sát thành bình. Sau khi chấm mẫu, để bay hơi hết dung môi pha mẫu trên bản mỏng rồi đặt vào bình sắc ký đã bão hòa pha động. Mép dƣới bản mỏng đƣợc nhúng vào và cách bề mặt pha động khoảng 1 cm. 1.2.4.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp. Một số kỹ thuật thƣờng gặp: - Phun thuốc thử hiện màu. Thuốc thử chung để nhận biết nhiều chất hữu cơ là acid phosphomolypdic, acid sulfuric đặc, hơi iod. Ngoài ra còn các thuốc thử đặc hiệu với từng chất nhƣ ninhydrin để nhận biết acid amin và các nhóm chức amin, rhodamin B để nhận biết các chất lipid... - Soi dƣới đèn UV: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ sẽ tối đi hoặc phát quang khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 hoặc 366 nm. - Dùng densitometer: Thiết bị này sẽ đo cƣờng độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dƣới đèn UV – VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ đƣợc ghi lại thành pic sắc ký. 1.2.4.5. Định lƣợng các chất trong vết sắc ký Có hai phƣơng pháp định lƣợng các chất trong vết sắc ký: - Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm sạch dịch chiết rồi định lƣợng chất phân tích bằng phƣơng pháp thích hợp. - Định lƣợng trực tiếp trên bản mỏng bằng cách đo diện tích hay cƣờng độ màu của vết sắc ký, sử dụng 2 kỹ thuật: 10 Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cƣờng độ hấp thụ hoặc huỳnh quang. Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, ví dụ camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký, sau đó xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính. 1.2.5. Ứng dụng của TLC TLC đƣợc ứng dụng trong định tính, thử tinh khiết, định lƣợng, bán định lƣợng các chất trong hỗn hợp nhiều thành phần. 1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng thông thƣờng. Điểm khác là kỹ thuật này sử dụng bản mỏng hiệu năng cao có lớp pha tĩnh mỏng hơn, với bột mịn có kích thƣớc hạt nhỏ hơn, độ đồng đều cao hơn [1]. Hiện nay, quá trình chấm sắc ký đƣợc điều khiển và thực hiện bằng máy, số vết, lƣợng dịch chiết sẽ chấm trên bản mỏng đƣợc xác lập trên máy vi tính. Quá trình chấm dịch chiết thực hiện với sự hỗ trợ của máy nén khí hoặc bình khí nén. Sau khi triển khai trong bình triển khai sắc ký tự động, sắc ký đồ đƣợc chụp ảnh qua buồng chụp và kết quả đƣợc đánh giá bằng phần mềm chuyên dụng (Hình 1.1). 11 Máy tính có phần mềm VideoScan Máy chấm mẫu tự động Buồng chụp Bình triển khai sắc ký Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC. Bảng 1.2 sau đây sẽ giúp so sánh một số tham số của TLC và HPTLC: Bảng 1.2. So sánh một số tham số của TLC và HPTLC Tham số HPTLC TLC Bán tự động Thủ công. Kích thƣớc hạt 5 – 6 µm 10 – 12 µm Độ dày lớp pha tĩnh 100 µm 250 µm Chiều cao đĩa lý thuyết 12 µm 30 µm Cao Thấp hơn. Giới hạn phát hiện (sử dụng máy đo độ hấp thụ UV – VIS). 100 – 500 pg 1 – 5 ng Giới hạn phát hiện (sử dụng máy quét huỳnh quang). 5 – 10 pg 50 – 100 ng Công nghệ Hiệu lực tách