Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ loài lan trầm (dendrobium nestor) giai đoạn in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN TRẦM (Dendrobium nestor) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sư phạm Sinh học Phú Thọ, 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN TRẦM (Dendrobium nestor) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sư phạm Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. CAO PHI BẰNG Phú Thọ, 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Cao Phi Bằng đã hƣớng dẫn tận tình, quan tâm và động viên em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Khoa học Tự nhiên, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, ngày 15 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Thúy ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn.......................................................................................... 2 NỘI DUNG...........................................................................................................3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Trầm (D. nestor) ...... 3 1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium ................................................................... 3 1.1.1.1. Về phân loại ......................................................................................... 3 1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái........................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Trầm (D. nestor) ..................................................... 4 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật.............................. 5 1.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 5 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật ...................................................................................................................... 6 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật .................................... 8 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào.................................................................... 8 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa ............................................................ 8 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro ...................................... 9 1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro................................................................ 10 1.2.5.1. Điều kiện vô trùng .............................................................................. 10 1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ. ......................................................................... 11 1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro ................................................................... 11 1.2.6.1. Thành phần của môi trường ............................................................... 11 1.2.6.2. pH của môi trường ............................................................................. 15 1.2.6.3. Tính thẩm thấu của môi trường ......................................................... 15 1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật............ 15 1.3. Tình hình nghiên cứu ................................................................................. 16 1.3.1.Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro ....... 16 1.3.1.1. Vai trò của auxin trong nhân giống in vitro ...................................... 16 1.3.1.2. Vai trò của cytokinin trong nhân giống in vitro ................................ 17 iii 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo ...................... 18 1.3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................... 18 1.3.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước....................................................... 18 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 21 2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 21 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 21 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 21 2.3.1. hương pháp ố trí thí nghiệm ............................................................... 21 2.3.1.1. hương pháp luận .............................................................................. 21 2.3.1.2. hương pháp ố trí thí nghiệm .......................................................... 21 2.3.2. hương pháp thu thập số liệu ................................................................. 24 2.3.3. hương pháp ph n tích và ử l số liệu .................................................. 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 25 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor)......................................... 25 3.1.1. Ảnh hưởng của BA đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) .............................................................................................................. 25 3.1.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) ....................................................................................................... 29 3.1.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa BA và Kinetin đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) ............................................................. 32 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) ...................................... 35 3.2.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor).............................................................................................................. 35 3.2.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor).............................................................................................................. 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 41 1. Kết luận ....................................................................................................... 41 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 42 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAP : Bezylamino purine IBA : Indole butyric acid MS : Môi trƣờng Murashige & Skoog MT : Môi trƣờng NAA : Axit napthalen axetic v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) ......................................................................... 25 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) .............................................................................................................. 28 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) ............................................................. 29 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor).............................................................................................................. 31 Bảng 3.5. Ảnh hưởng sự phối hợp của BAP và Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) ............................. 33 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor).............................................................................................................. 34 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor).............................................................................................. 36 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor).............................................................................................. 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi...................................... 26 Hình 3.2. Chồi c y in vitro trên các môi trường có bổ sung BAP và ............. 26 trên môi trường đối chứng............................................................................. 26 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA đến sự phát triển thân .................................. 27 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BA đến số lá .................................................... 28 Hình 3.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi .............................. 30 Hình 3.6. Chồi c y in vitro trên các môi trường có bổ sung BAP và trên môi trường đối chứng................................................................................... 30 Hình 3.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân ........................... 31 Hình 3.8. Ảnh hưởng của BA đến số lá .................................................... 32 Hình 3.9. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến hệ số nhân chồi ....... 33 Hình 3.10. Chồi c y in vitro trên môi trường có bổ sung kết hợp BAP với Kinetin và trên môi trường đối chứng ......................................................... 33 Hình 3.11. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến sự phát triển thân ............................................................................................................... 34 Hình 3.12. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến số lá ............... 35 Hình 3.13. Rễ c y in vitro trên các môi trường có bổ sung IBA................. 37 Hình 3.14. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ ................................... 36 Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây ................................... 38 Hình 3.16. Rễ c y in vitro trên các môi trường có bổ sung NAA ............... 39 Hình 3.17. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ .................................. 40 Hình 3.18. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây ................................... 40 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Phong lan đƣợc biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa đƣợc mọi ngƣời ƣa chuộng. Phong lan thƣờng đƣợc dùng làm cảnh, trang trí, và một số loài có tác dụng chữa bệnh [14]. Họ Lan có số lƣợng thành phần loài không những phong phú trong tự nhiên mà còn đa dạng bởi các loài lan đƣợc lai tạo. Tính đến hiện nay, có đến hơn 25.000 loài Lan khác nhau. Ở Việt Nam, theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng [5]. Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan (Orchidaceae), có khoảng 1400 loài, ở Việt Nam có 107 loài và một thứ phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển [17]. Trong chi này, có nhiều loài có hoa đẹp và đƣợc nhiều ngƣời yêu thích. Tuy nhiên do nhiều nguyên nhân tác động khác nhau mà hiện nay nhiều loài đã bị khai thác quá mức dẫn đến bị đe dọa hoặc biến mất [6]. Năm 1893, Veitch đã đăng kí tên cho 1 loài lan đƣợc lai tạo giữa cây D. anosmum - Phi điệp và cây D. parishii - Song hồng, đƣợc gọi là Lan Trầm (Dendrobium nestor). Hoa của lan Trầm có mùi thơm nhẹ nhàng, dễ chịu giống nhƣ mùi hƣơng trầm chứ không quá hắc. Hoa gần giống hai cây cha mẹ nhƣng có màu tím hồng hoặc màu trắng, rất đẹp nên đƣợc nhiều ngƣời yêu thích. Hiện nay số lƣợng loài này trong tự nhiên còn khá ít và khó nhân giống [3]. Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân giống (in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm. Nhân giống in vitro là một phƣơng pháp nhân giống mang lại nhiều ƣu điểm nhƣ: hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, đồng thời có tiềm năng sinh học cao mà lại không tốn diện tích nhân giống. Trong nhân giống in vitro, ngoài môi trƣờng nuôi cấy cơ bản, ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy các vitamin, các chất điều hòa sinh trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nƣớc ép các loại hoa quả nhƣ: chuối, nƣớc 2 dừa, khoai tây…Trong đó, các chất điều hòa sinh trƣởng có ảnh hƣởng rất lớn đến hệ số nhân và chất lƣợng của chồi, cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng ra rễ của cây. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ loài lan Trầm (Dendrobium nestor) giai đoạn in vitro”. Đề tài này đƣợc thực hiện sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài lan quý này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát triển thân cây in vitro Lan Trầm. Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro Lan Trầm. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hƣởng của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát triển thân và rễ cây in vitro loài lan Trầm. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đƣợc thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài lan đẹp này. Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ hiệu quả kinh tế trong sản xuất giống lan Trầm trên địa bàn tỉnh Phú Thọ. 3 NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Trầm (D. nestor) 1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium 1.1.1.1. Về ph n loại Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay, chi này bao gồm hơn 1200 loài đƣợc chia thành 40 nhóm thuộc dòng Dendrobiinae. Chi Dendrobium đƣợc phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia, NewZealand, riêng ở Việt Nam có trên 110 loài [5, 10]. Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có ngƣời gọi là Hoàng lan, có ngƣời gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính:  Dạng đứng (D. phalaenopsis) thƣờng mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và ra nhiều hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…  Dạng thòng (D. mobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng… 1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật đƣợc bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. Rễ của lan Dendrobium không chịu đƣợc lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết [4]. Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nƣớc và dự trữ chất dinh dƣỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp đƣợc. Hình dạng và kích thƣớc 4 của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [8]. Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nƣớc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung nhƣ cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa nhƣ hình chữ V [4]. Các loài thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mƣa thì cho chồi mới [1]. Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa đƣợc tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1]. Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số loài khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát. Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thƣớc rất nhỏ nên phôi hạt chƣa phân hóa. Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [3]. 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Trầm (D. nestor) Lan Trầm có tên khoa học là D. nestor thuộc: chi Dendrobium, họ Lan: Orchidacea, bộ Lan : Orchidales, lớp Một lá mầm: Monocotyledone, ngành Ngọc Lan: Mangoliophyta [5, 23]. Lan trầm (D. nestor) là một giống lai lan lai tạo giữa cây D. anosmum (Giã hạc, Phi điệp) và cây D. parishii (Song hồng, Hoàng thảo tím) đƣợc Veitch đăng kí vào năm 1893 với tên D. nestor. Thân cây chỉ từ 20 - 40 cm, không quá dài cũng không quá mập, lên thẳng nhƣ cây D. parishii chứ không dài và buông thõng nhƣ D. anosmum. Lan trầm đa số là trồng trong chậu chứ không trồng bó vào thân gỗ giống nhƣ lan Long tu hay Giả hạc. Lan Trầm ƣa sáng, thoáng gió, nhƣng cần tránh ánh nắng trực tiếp, tiếp xúc nhiều sẽ gây cháy lá và lan chậm lớn. Nhiệt độ sống thích hợp từ 18 đến 250C, độ ẩm từ 70 đến 90% là tốt nhất. Nhiệt độ để lan trầm ra hoa 5 phải từ 13 đến 150C và kéo dài liên tục từ 4 – 6 tuần lễ. Mùa nắng cần phải tƣới nƣớc thƣờng xuyên để cây luôn giữ đƣợc ẩm độ cần thiết, để lan không bị khô và bị rụt lại do thiếu nƣớc. Đến mùa thu khoảng từ tháng 10 trở đi, lá cây bắt đầu úa vàng và rụng, vào thời gian này cần giảm việc tƣới nƣớc lại, tƣới một tuần một lần. Cuối mùa đông, đầu mùa xuân, cây bắt đầu nhú nụ, chuẩn bị cho thời kỳ nở hoa. Hoa của lan Trầm khá giống 2 cây cha mẹ, môi hoa có nhiều lông, mùi thơm nhẹ nhàng dễ chịu nhƣ hƣơng trầm, không quá hắc và có màu sắc rất đẹp. Khi hoa đã tàn, các cây con mọc ra ở gốc cây. Một số cây con mọc ra ở các đốt gần ngọn hay ở phía dƣới các đốt đã ra hoa đƣợc gọi là cây keiki. Những cây con mọc ra ở gốc thƣờng mọc ra sớm hơn và chúng có thể ra hoa vào mùa tới, còn các cây keiki phải đợi đến mùa sau chúng mới có thể ra hoa. 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trƣởng. Trƣớc kia ngƣời ta dùng phƣơng pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào nhƣ sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật nhƣ sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thƣơng mại trong đời sống hàng ngày của con ngƣời. 6 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật Năm 1902, nhà thực vật học ngƣời Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mô mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia đƣợc [19]. Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô). Hai tác giả đã nuôi đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trƣờng lỏng có chứa đƣờng glucozơ và muối khoáng thu đƣợc hệ rễ nhỏ [19]. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (ngƣời Mỹ) đã duy trì đƣợc sinh trƣởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên môi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men [19]. Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin đƣợc nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic (NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)… Năm 1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trƣởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá. Một năm sau, chất đó đƣợc tổng hợp thành công và đƣợc Skoog gọi là kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối của auxin/cytokinin và từ đó đƣa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy, đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. 7 Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến nay [19]. Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã đƣợc phát triển và hoàn thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp... Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính địa lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và đã tạo ra đƣợc các protocom từ địa lan. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa. Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dƣợc. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả ngƣời Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tƣợng lý tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [19]. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã đƣợc phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật… 8 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học ngƣời Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đƣa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” [19]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.2.3.2. Sự ph n hóa và phản ph n hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong những điều kiện môi trƣờng thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ nhƣ tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó đƣợc gọi là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình điều hoà hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, quá trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó. 9 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro Quá trình nuôi cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn: * Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trƣởng của mẫu cấy in vitro. * Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy. * Giai đoạn 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lƣợng thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính. Phải xác định đƣợc môi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Nếu môi trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Điều kiện nuôi cấy thƣờng là 25-27oC và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000-4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tƣợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối. 10 * Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi trƣờng tạo rễ. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trƣờng không chứa chất điều hòa sinh trƣởng. * Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờm ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc nhƣng tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dƣỡng. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc. Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờm ƣơm, cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [13]. 1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.2.5.1. Điều kiện vô trùng Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu trong quá trình nuôi cấy không đảm bảo điều kiện vô trùng thì mẫu sẽ bị nhiễm nấm, khuẩn. * Vô trùng dụng cụ và môi trường: Để vô trùng dụng cụ và môi trƣờng nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau: - Khử trùng khô: Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trƣớc khi đem sấy phải đƣợc gói kín bằng giấy nhôm và chỉ đƣợc mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết bị dùng khử trùng khô là lò sấy, tủ sấy, nhiệt độ thƣờng dùng là 1210C – 1800C, trong 90-120 phút. - Khử trùng ƣớt: Là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thƣờng dùng ở 1210C. 11 - Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thƣớc 0,025-10µm khỏi môi trƣờng nuôi cấy, nƣớc cất... Đây là phƣơng pháp phù hợp với các môi trƣờng mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao. * Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhƣng ở các vị trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau. Phƣơng pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật nhƣ cồn 70o, các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít ảnh hƣởng mẫu thực vật [19]. 1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ. Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trƣờng hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhƣng quá trình nhân giống của chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thƣờng đƣợc duy trì từ 25-28oC nhờ các máy điều hoà nhiệt độ. 1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro 1.2.6.1. Thành phần của môi trường Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhƣng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trƣờng nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản. Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng môi trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: * Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lƣợng và vi lƣợng) đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. 12 - Trong muối khoáng đa lƣợng, các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ, phospho, kali và sắt. + Nitơ vô cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm lƣợng ≈ 25mM và amon (NH4+) với hàm lƣợng từ 2-20mM. + Phospho thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng muối phosphat, hai loại hợp chất hay đƣợc dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lƣợng phospho trong môi trong môi trƣờng nuôi cấy từ 0,15-0,40 mM. + Kali đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy dƣới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2-25 mM [Vũ Văn Vụ]. - Yêu cầu về muối khoáng vi lƣợng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 30ppm, chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme. + Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhƣng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia. + Bo: thiếu Bo trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gây lên biểu hiện thừa Auxin. Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhƣng thƣờng là mô xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh... * Thành phần hữu cơ - Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol: + Vitamin: Các vitamin hay đƣợc sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngoài ra môi trƣờng nuôi cấy còn sử dụng một số vitamin khác nhƣ vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các nồng độ khác nhau. + Myo-inositol là một loại đƣờng – rƣợu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, tham gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi hydratcacbon. Hàm lƣợng sử dụng là 100 mg/l môi trƣờng [12]. + Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trƣờng phải đƣợc bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của