Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân, lá và rễ của loài lan sơn thủy tiên(dendrobium chrysotoxum) giai đoạn invitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- HOÀNG THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN THÂN, LÁ VÀ RỄ CỦA LOÀI LAN SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Sư phạm Sinh học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- HOÀNG THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN THÂN, LÁ VÀ RỄ CỦA LOÀI LAN SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Sư phạm Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ của ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ để em nghiên cứu và thực hiện khóa luận này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hướng dẫn TS.Trần Trung Kiên đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và động viên em hoàn thành khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Trung tâm nghiên cứu công nghệ sinh học, trường Đại học Hùng Vương đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo giúp em hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, tháng 5 năm 2018 Sinh Viên Hoàng Thị Thùy Linh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận là trung thực.Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép công bố. Phú Thọ, ngày … tháng 5 năm 2018 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Thùy Linh iii MỤC LỤC Trang phụ bìa………………………………………………………………….i Lời cảm ơn……………………………………………………………………ii Lời cam đoan………………………………………………………………....iii Mục lục………………………………………………………………………iv Danh mục bảng………………………………………………………………vi Danh mục hình………………………………………………………………vii Danh mục chữ viết tắt……..……………………………………..………….iv CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài: ........................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài:.............................................................................................................. 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn: ............................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................... 2 CHƯƠNG II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU..................................................................... 2 PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 1.1. Tình hình nghiên cứu .................................................................................................. 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước: ..................................................................... 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới: .................................................................. 3 1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chysotoxum): .................................................................................................... 5 1.2.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại: ................................................................................. 5 1.2.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học:................................................................. 5 1.3. Môi trường nuôi cấy.................................................................................................... 6 1.3.1. Thành phần môi trường:........................................................................................ 6 1.3.2. pH của môi trường: ................................................................................................. 8 1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng:................................................................................. 8 1.4.1. Nhóm Auxin:.............................................................................................................. 8 iv 1.4.2.Nhóm Cytokinin: ........................................................................................................ 8 PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 10 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:...................................................................... 10 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 10 2.3. Phương pháp nghiên cứu: ....................................................................................... 11 2.3.1 Phương pháp luận ................................................................................................... 11 2.3.2. Phương pháp bố thí nghiệm ............................................................................... 11 2.3.3. Phương pháp thu thập số liê ̣u ......................................................................... 13 2.3.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liê ̣u ........................................................ 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 15 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) ........................................................................................ 15 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum ). ......................... 17 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) ..................................................................... 17 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) .............................................................. 20 3.2.3. Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum )............................................... 22 3.2.4. Ảnh hưởng sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum ). .................................. 25 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum). ....................................................................................... 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 33 1. Kết luận .............................................................................................................................. 33 2. Kiến nghị ........................................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 34 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp của Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên 11 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin đến khả năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên……………………… 13 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)………… 15 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)……… 17 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)… 19 Bảng 3.4. Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên 22 (Dendrobiumchrysotoxum) Bảng 3.5. Ảnh hưởng sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium 24 chrysotoxum)…………………………………………………………….. Bảng 3.6.Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium 26 chrysotoxum)……………………. Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)………………….. 27 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)....................................................... 29 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)… 5 Hình 2.1. Các cụm protocom lan Sơn thủy tiên..................................... 10 Hình 2.2. Cây lan Sơn thủy tiên chiều cao 2 – 3 cm............................. 10 Hình 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)………………………. 16 Hình 3.2. Ảnh hưởng của 3 loại môi trường đến sự sinh trưởng chồi lan Sơn thủy tiên……………………………………………………… 17 Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)......................................................................................... 18 Hình 3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)............... 18 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)................................................................... 20 Hình 3.6. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)............... 21 Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)............................................................ Hình 3.8. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng 23 TDZ/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)............................................................ Hình 3.9. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng 23 TDZ/NAA đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)................................................................... Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA 27 vii đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)........................................................................................... 27 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)..................................................................... 28 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển số rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)............................................................................................ 29 Hình 3.13. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)..................................................................... 30 Hình 3.14. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)..................................................................... 30 Hình 3.15. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)................................................................. 31 Hình 3.16. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên( Dendrobium chrysotoxum)................................................... 32 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAP : Benzylamino purine ĐC : Đối chứng IAA : Indole acetic acid KC : Knudson C MS : Murashige & Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid TDZ : Thidiazuz n 1 MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài: Hoa lan là loài hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngoài ra chúng có hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Tính đến hiện nay có hơn 25.000 loài lan khác nhau, ở Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng. Trong số đó, lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, ở Việt Nam có 107 loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và cả trên một số đảo ven biển [3]. Lan Sơn thuỷ tiên (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng của Việt Nam thuộc chi Hoàng thảo, hoa có hình thái đẹp, hương thơm nhẹ nhàng, dễ chăm sóc. Ở Việt Nam, hầu hết các giống lan được đem từ rừng về chăm sóc hoặc nhân giống bằng cách ươm hạt, tách nhánh….nhưng hiệu quả không cao, không đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng. Đứng trước những vấn đề trên cùng với nhu cầu thường thức hoa lan ngày càng cao, ngày nay với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ khoa học thực vật đã làm thay đổi hoàn toàn kỹ thuật nhân giống lan. Với kỹ thuật nhân giống in vitro không những tạo được số lượng cây giống lớn đồng nhất trong một thời gian ngắn mà còn ngăn cản sự thoái hóa giống. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh cơ quan của lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) hiện tại vẫn còn rất ít các công trình nghiên cứu [9], [10]. Trong quá triǹ h nhân giố ng in vitro, các chấ t điề u hoà sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng không nhỏ đế n sự phát sinh cơ quan của loài lan Sơn thủy tiên. Vì vậy, tôi đã lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân, lá và rễ của loài lan Sơn thủy tiên(Dendrobium chrysotoxum) giai đoạn invitro” 2 1.2. Mục tiêu đề tài: - Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đối với sự sinh trưởng chồi của cây in vitro lan Sơn thủy tiên. - Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Sơn thủy tiên. - Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Sơn thủy tiên. 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn: 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân va rễ cây in vitro loài lan Sơn thủy tiên. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đềtài được thực hiện sẽ là cơ sởcho việc hoàn thiện quy trình nhân giống invitro cho loài lan đẹp này. - Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng cũng nhờ hiệu quảkinh tế trong sản xuất giống lan Sơn thủy tiên trên địa bàn tỉnh Phú Thọ. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu về cây lan Hoàng thảo 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước: Ở Việt Nam, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày càng được áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng nói chung và cây hoa lan nói riêng. Nhiều loài lan trong chi Hoàng thảo (Dendrobium) đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [8], như nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và Nguyễn Hữu Lễ (2009) về ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ cây phong lan giã hạt (Dendrobiumanosmum) [4]; nghiên cứu của Vũ Thanh Sắc và cộng sự (2012) về nhân giống invitro lan Hoàng thảo trầm trắng (Dendrobium anosmum var.alba) [7]; nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) về nhân giống in vitro loài Lan bản địa Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc) [2]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới: Với cây hoa lan, việc sử dụng các hình thức sing sinh sản vô tính như ươn, giâm cây keiki rất ít được áp dụng. Phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ra đời đã nhận được nhiều sự quan tâm và được áp dụng vào nhân giống cây hoa lan để tạo số lượng lớn. Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho việc nuôi cấy mô hoa lan được sử dụng chủ yếu là môi trường MS (Murashige – Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949), KC (Knudson’s C medium, 1921), N6 (Chu’s medium, 1975) …[2], [5]. Trong thời gian qua đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng hạt ở các loài lan khác nhau trong chi Hoàng thảo (Dendrobium) như: lan Đơn cam (Dendrobium unicum) được cho nảy mầm từ hạt 180 ngày tuổi; cho nảy mầm Hoàng thảo đùi gà (Dendrobium nobile), lan Trúc phật bà (Dendrobium pendulum) từ hạt trưởng thành; lan Tam bảo sắc (Dendrobium devonianum) được cho nảy mầm từ hạt giống ở các lứa tuổi khác nhau, lan Vảy rồng 4 (Dendrobium aggregatum) được cho nảy mầm từ hạt 3-4 tháng tuổi sau thụ tinh nhân tạo,...[8]. Gần đây nhất (năm 2015) một bài báo tổng quan về nuôi cấy in vitro từ hạt quả của chi hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) đã chỉ ra một số môi trường để khử trùng quả lan được sử dụng nhiều nhất là: EtOH (cồn) và HgCl2 (28,3%), EtOH và NaOCl (15,1%), EtOH và đốt nhanh trên ngọn lửa đèn cồn (15,1%) [10]. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trường nuôi cấy hạt lan được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu là: MS (30,2%), ½ MS (13,2%),KC(11,3%), N6 (11,3%) [8]. Sơn thủy tiên là một loài lan đẹp, tuy nhiên trên thế giới cũng chưa có nhiều công trình nghiên cứu. Roy và cộng sự (2007) nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ đỉnh chồi sử dụng môi trường Knudson’s C (KC) sửa đổi, có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như Thidiazuron (TDZ), N6benzylaminopurine (BAP) and α-Naphthaleneacetic acid (NAA) ở các nồng độ khác nhau [9]. Nhóm tác giả người Ấn Độ (2014) nghiên cứu sự nảy mần của hạt lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) trong môi trường Mitra (M) có bổ sung với nồng độ khác nhau của auxins và cytokinins. Nghiên cứu chỉ ra rằng, sự nảy mầm hạt lan tốt nhất khi môi trường M có bổ sung 0.4% than hoạt tính (AC), 2 mg/l 6-benzyl amino purine (BAP), và 2 mg/l indole-3acetic acid (IAA) [10]. 5 1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chysotoxum): 1.2.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại: Hình 1.1. Hình thái lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum) Cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) thuộc họ Orchidaceae- bộ Orchidales - phân lớp Ngọc lan Magnoliidae - lớp Ngọc lan Magnoliopsida - Ngành hạt kín Magnoliophyta [1]. 1.2.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học: Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng Việt Nam. Chúng có giả hành hình dùi bắp, hẹp ở đáy, lớn mập ở giữa rồi thon lại, có nhiều sóng dọc thấp, màu vàng khi già, cao đến 30cm, mập ú to 3–5cm đường kính; mang 6-7 lá ở đỉnh, dài 8–15cm, rộng 2.5-3cm. Chùm hoa mọc mạnh, nghiêng xéo ra rồi cong xuống, dài đến 20cm với nhiều hoa thưa. Hoa to cỡ 5cm, thơm, màu vàng đậm, ánh như sáp, trung tâm môi vàng cam, có lông và rìa mép. Loài này có hoa khoảng tháng 2 (âm lịch), tái sinh bằng chồi và hạt, mọc bám trên các cây gỗ lớn trong rừng, ở độ cao 600-1200m. Do có hoa đẹp nên được dùng làm cảnh, ngoài ra còn có giá trị về dược phẩm. 6 Trên thế giới, lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào. Còn ở Việt Nam chúng phân bố chủ yếu ở Nghệ An (Vinh), Kontum (Đắklei, Đắk Uy), Gia Lai (Chư Pah), Đắk Lắk (Buôn Ma Thuột), Lâm Đồng (Đà Lạt). Loài có khu phân bố và nơi cư trú chia cắt. Hiện đã bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác để trồng, bán chủ yếu làm cây cảnh, đôi khi làm thuốc và chặt phá rừng hủy hoại nơi cư trú. 1.3. Môi trường nuôi cấy 1.3.1. Thành phần môi trường: Thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất, nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:  Thành phần hữu cơ - Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzym và cofactor của các phản ứng sinh hóa. Quan trọng nhất là các vitamin nhóm B. + Thiamin cần cho trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp một số aminoaxit, hàm lượng sử dụng 0,1 – 5mg/l. + Axit nicotinic tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1 - 5mg/l. + Pyridoxin là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử dụng 0,1 – 1mg/l. - Myo-inositol: là một loại đường - rượu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống trong màng tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường và trao đổi hydratcacbon. Ngoài ra còn tham gia vào tích trữ vận chuyển và giải phóng auxin. - Các aminoaxit amit: có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái. - Các thành phần hữu cơ phức tạp: Cazein thủy phân, dịch chiết nấm men, nước ép hoa quả… cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất. 7 Thành phần vô cơ Gồm các muối khoáng, các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho, kali và sắt. - Nitơ được đưa vào môi trường ở 2 dạng: nitrat (NO3-) và amon (NH4+) với hàm lượng nitrat là 25 mM. - Phospho được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphate và 2 loại muối được sử dụng nhiều nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. - Kali được cung cấp dưới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Hàm lượng kali trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 2 – 25 mM. - Sắt là nguyên tố vi lượng được đưa vào môi trường ở dạng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3..nhưng cây rất khó hấp thụ, phải cho vào môi trường Na2EDTA để tạo ra muối phức NaFeEDTA để cây dễ dàng hấp thụ.  Nguồn cacbon Loại hydratcacbon được sử dụng để đưa vào môi trường nuôi cấy phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng 6% (W/v). Những loại đường khác như: fructozơ, glucozơ, maltozơ, lactozơ,..chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt. Hàm lượng đường thấp được sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần, ngược lại các hàm lượng đường cao hơn có thể dùng cho nuôi cấy hạt phấn, phôi [9].  Các thành phần khác -Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar; Hàm lượng sử dụng của agar 0,5 – 10% (W/v). - Than hoạt tính: được dụng để hấp thụ các chất màu các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Than hoạt tính cũng hút các chất hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm... Hàm lượng sử dụng của than hoạt tính là 0,2-0,3 % (W/v). 8 1.3.2. pH của môi trường: pH của đa số các môi trường nuôi cấy đều được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 – 6. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ[11] 1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng: 1.4.1. Nhóm Auxin: Nhóm Auxinđược đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính ... (Epstein&cs, 1989). Các loại Auxin thường sử dụng cho nuôi cấy: + IAA (Indole acetic acid) + IBA (Indole butyric acid) + NOA (Naphthoxy acetic acid) + α - NAA (α- Naphthaleneacetic acid) + 2,4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)... IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lượng cao 1,0 -3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1-2,0 mg/l. 1.4.2.Nhóm Cytokinin: Nhóm Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Các loại Cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô là: + Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine). + Kinetin (6-furfurylamino purine). + BAP (Bezylamino purine). + TDZ (Thidiazuzon). 9 + 2 - ip (isopentenyi adenine) Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau [9]. 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Đối tượng: Các cụm protocom lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) và cây lan Sơn thủy tiên vó chiều cao 2 – 3 cm. Hình 2.1. Các cụm protocom lan Hình 2.2. Cây lan Sơn thủy tiên Sơn thủy tiên chiều cao 2 – 3 cm -Phạm vi nghiên cứu: Cây lan Sơn thủy tiên được thực hiện ở giai đoạn in vitro. -Địa điểm: Các thí nghiê ̣m đươ ̣c thực hiêṇ ta ̣i Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh ho ̣c, Trường Đa ̣i Ho ̣c Hùng Vương – Tp.Việt Trì – Tỉnh Phú Tho ̣. 2.2. Nội dung nghiên cứu -Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đối với sự sinh trưởng chồi của cây in vitro lan Sơn thủy tiên - Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Sơn thủy tiên. - Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Sơn thủy tiên