Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân và rễ loài lan hoàng thảo vôi trắng (dendrobiumcretaceum var alba )” giai đoạn in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN HOÀNG THẢO VÔI TRẮNG (Dendrobium cretaceum var alba ) GIAI ĐOẠN IN VITRO’’. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành sư phạm Sinh học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN HOÀNG THẢO VÔI TRẮNG (Dendrobium cretaceum var alba ) GIAI ĐOẠN IN VITRO’’. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành sư phạm Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới giảng viên hƣớng dẫn thầy giáo TS. Trần Trung Kiên đã quan tâm hƣớng dẫn tận tình và động viên em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầ c gi o trong rung tâm nghiên cứu C ng nghệ inh h c – trƣờng ih c ng ƣơng c ng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Khoa h c Tự Nhiên- rƣờng i h c Hùng ƣơng đã t o điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, b n bè, những ngƣời đã lu n bên c nh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Rất mong nhận đƣợc sự chỉ bảo, góp ý từ phía quý Thầ (C ) để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện đầ đủ hơn. Em xin chân thành cảm ơn! ii LỜI CAM ĐOAN i xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực. M i sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận nà đã đƣợc cảm ơn và c c thông tin trích dẫn trong khóa luận đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và đƣợc phép công bố. Phú Thọ, ngày … tháng 5 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Hồng Hạnh iii MỤC LỤC Trang MỞ ẦU 1. ính cấp thiết của đề tài 01 2. Mục tiêu đề tài 02 3. Ý nghĩa khoa h c và thực tiễn 02 3.1. Ý nghĩ khoa h c 02 3.2. Ý nghĩa thực tiễn 02 C ƢƠNG 1: ỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Hoàng thảo 03 vôi trắng(Dendrobium creataceum var alba) 1.1. Một số nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Hoàng thảo 03 vôi trắng(Dendrobium creataceum var alba) 1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium 03 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium 04 creataceum var alba) 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô- tế bào thực vật 05 1.2.1. Khái niệm 05 1.2.2. Lịch sử ph t triển của kỹ thuật nhân giống bằng nu i cấ m - 05 tế bào thực vật 1.2.3. Cơ sở khoa h c của nu i cấ m - tế bào thực vật 07 1.2.4. C c giai đo n trong kỹ thuật nhân giống in vitro 08 1.2.5. C c điều kiện nu i cấ in vitro 09 1.2.6. M i trƣờng nuôi cấy in vitro 11 1.2.7. Tầm quan tr ng của phƣơng ph p nu i cấy mô - tế bào thực vật 15 1.3. Tình hình nghiên cứu 15 1.3.1.Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng trong nhân giống in vitro. 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo 17 C ƢƠNG 2: ỐI ƢỢNG, NỘI DUNG À P ƢƠNG P ÁP NG IÊN CỨU iv 2.1. ối tƣợng và ph m vi nghiên cứu 20 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu 20 C ƢƠNG 3: KẾ QUẢ NG IÊN CỨU À ẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi Lan 24 hoàng thảo v i trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp của C tokinin/Auxin đến sự ph t triển của thân, l câ lan 26 oàng thảo v i trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự ph t triển của thân, l 26 câ lan oàng thảo v i trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá 28 cây lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.2.3. Ảnh hƣởng của sự phối hợp giữa BAP và NAA đến sự phát triển 29 của thân, lá cây lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.2.4.Ảnh hƣởng của sự phối hợp Kinetin và NAA đến sự phát triển 31 của thân, lá cây lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây lan 33 Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan 33 Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ cây lan 35 Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 3.3.3. Ảnh hƣởng của sự phối trộn NAA và IAA đến khả năng ra rễ 37 cây lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) KẾ LUẬN À KIÊN NG Ị 39 1. Kết luận 39 2.Kiến nghị 39 ÀI LIỆU AM K ẢO v DANH MỤC VIẾT TẮT BAP C : Benzylamino purine : ối chứng IAA : Indole acetic acid KC : Knudson C MS : Murashige & Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid TDZ : Thidiazuzon vi DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển của thân, lá Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của Trang 24 26 28 thân, lá Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa BAP và NAA đến sự 30 phát triển của thân, lá Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA 32 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ 33 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ 35 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến khả 37 năng ra rễ vii DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang ình 3.1.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi 24 ình 3.1.2. 25 ồ thị về ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi ình 3.1.3. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến tỉ lệ ra chồi 25 ình 3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển thân và lá 27 ình 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển thân và lá 27 ình 3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá. 29 ình 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá 29 ình 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá 31 ình 3.4.2 Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá 31 ình 3.5.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA 32 ình 3.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA 32 Hình 3.6.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ 34 Hình 3.6.2. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ 34 Hình 3.6.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ 35 Hình 3.7.1. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến chiều dài của rễ 36 Hình 3.7.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ 36 Hình 3.7.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ 36 Hình 3.8.1. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến 37 chiều dài rễ Hình 3.8.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến 38 khả năng ra rễ Hình 3.8.3. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến chiều dài rễ 38 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Phong lan được biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa được mọi người ưa chuộng. Phong lan thường được dùng làm cảnh và trang trí, và một số loài có tác dụng chữa bệnh. Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) có mùi thơm nhẹ nhàng mùi hoa nhài dễ chịu, rất đẹp nên được nhiều người yêu thích và lựa chọn. Tuy nhiên, hiện nay số lượng loài này trong tự nhiên còn rất hiếm và khó nhân giống bằng phương pháp thông thường [4]. Để hạn chế việc khai thác quá mức lan Hoàng thảo vôi trắng ngoài tự nhiên cũng như để bảo tồn loài lan quý, hiếm này thì ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, vi nhân giống (in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm. Hơn nữa còn rất hiếm các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài lan này và đặc biệt ở Việt Nam hiện chúng tôi chưa tìm thấy công trình nào nghiên cứu về loài lan Hoàng thảo vôi đột biến trắng. Nhân giống in vitro là một phương pháp nhân giống mang lại nhiều ưu điểm như: hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, đồng thời có tiềm năng sinh học cao mà lại không tốn diện tích nhân giống. Trong nhân giống in vitro, ngoài môi trường nuôi cấy cơ bản, người ta thường bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng, đường, than hoạt tính, nước ép các loại hoa quả như: chuối, nước dừa, khoai tây…Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát sinh chiều cao cây, lá cây và chất lượng của cây, cũng như có ảnh hưởng lớn tới khả năng ra rễ của cây. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát sinh thân và rễ loài lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba )” giai đoạn in vitro. 2 Đề tài này được thực hiện sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài lan quý này. 2. Mục tiêu của đề tài Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng của chồi cây in vitro lan Hoàng thảo vôi trắng. Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Hoàng thảo vôi trắng. Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Hoàng thảo vôi trắng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ cây in vitro loài lan Hoàng thảo vôi trắng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài được thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài lan đẹp này. Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế trong sản xuất giống lan Hoàng thảo vôi trắng trên địa bàn tỉnh Phú Thọ. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) 1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium 1.1.1.1. Về phân loại Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay, chi này bao gồm hơn 1200 loài được chia thành 40 nhóm thuộc dòng Dendrobinae. Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia, NewZealand, riêng ở Việt Nam có trên 110 loài [4, 8]. Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hoàng lan, có người gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính:  Dạng đứng (D. phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và ra nhiều hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…  Dạng thòng (D. nobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng… 1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết [3]. Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được. Hình dạng 4 và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [6]. Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V [3]. Các loài thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [1]. Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1]. Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số loài khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát. Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt cha phân hóa. Sau 3- 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [2]. 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) Lan Hoàng thảo vôi trắng có tên khoa học là D.cretaceum var alba thuộc: chi Dendrobium, họ Lan: Orchidacea, bộ Lan: Orchidales, lớp Một lá mầm: Monocotyledone, ngành Ngọc Lan: Mangoliophyta [4, 18]. Lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) có thân to dài 20- 40cm. Lá hình giáo, thuôn ở gốc, nhọn ở đỉnh, dài 7- 8cm, rộng khoảng 1- 2cm, các đốt ngắn, thân phủ nhiều lớp vỏ phấn thường hay bị bong tróc lớp vỏ này, có lẽ vì thế nên gọi là Hoàng thảo vôi, tạo cho thân 1 lớp mốc. Hoa nhiều lông ở cánh và lưỡi, thơm mùi hoa nhài có màu trắng, trên lưỡi hoa có các tia đỏ chạy ra từ họng. Lan Hoàng thảo vôi trắng ưa nắng thường được trồng vào cuối đông khi cây đang nghỉ, các mắt đang ngậm nụ. Phơi nắng trực tiếp từ khi bắt đầu ghép sẽ cho lứa cây con khỏe mạnh.Cây cần rất nhiều nước trong thời gian phát triển, mùa thu bớt tưới cho đến khi cây rụng hết lá thì dừng tưới. Nhiệt độ sống thích hợp từ 18 đến 250C, độ ẩm 5 từ 70 đến 90% là tốt nhất. Nhiệt độ để lan Hoàng thảo vôi trắng ra hoa phải từ 13- 150C và kéo dài liên tục từ 4- 6 tuần lễ. 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật. Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mô mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia được [14]. Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô). Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trường lỏng có chứa đường glucozơ và muối khoáng kết quả thu được hệ rễ nhỏ [14]. 6 Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên môi trường lỏng có chứa đường, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men [14]. Trong thời gian 1934-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin được nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit Naphthalen axetic (NAA); axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)… Năm 1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trưởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá. Một năm sau, chất đó được tổng hợp thành công và được Skoog gọi là Kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đối của Auxin/Cytokinin và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay [14]. Trong khoảng thời gian từ 1954-1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp... Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính địa lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. 7 Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [14]. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô- tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật… 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào Gottlibeb Haberlant (1902)- nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” [14]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa 8 Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó được gọi là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình điều hoà hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, quá trình hoạt hóa sẽ được xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó. 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro Quá trình nuôi cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn: * Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. * Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, 9 cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể được sử dụng làm mẫu cấy. * Giai đoạn 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính. Phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Nếu môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Điều kiện nuôi cấy thường là 25-27oC và 16 giờ chiếu sáng một ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối. * Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu Cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng. * Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườm ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt được nhưng tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao 5- 7 cm và có từ 3- 4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườm ươm, cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [11]. 1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro. 1.2.5.1. Điều kiện vô trùng 10 Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu trong quá trình nuôi cấy không đảm bảo điều kiện vô trùng thì mẫu sẽ bị nhiễm nấm, khuẩn. * Vô trùng dụng cụ và môi trường: Để vô trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phương pháp sau: - Khử trùng khô: Phương pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trước khi đem sấy phải được gói kín bằng giấy nhôm và chỉ được mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết bị dùng khử trùng khô là lò sấy, tủ sấy, nhiệt độ thường dùng là khoảng 1210C1800, trong 90-120 phút. - Khử trùng ướt: Là phương pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng ở 1210C. - Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025- 10 µm khỏi môi trường nuôi cấy, nước cất... Đây là phương pháp phù hợp với các môi trường mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao. * Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhưng ở các vị trí khác nhau thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau. Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như cồn 70o, các chất làm giảm sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất khử trùng. Một hóa chất được lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít ảnh hưởng mẫu thực vật [14]. 1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ. Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của 11 chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phòng nuôi cấy thường được duy trì từ 25- 280C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ. 1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro 1.2.6.1. Thành phần của môi trường Thành phần môi trường nuôi cấy mô- tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhưng môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: * Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. - Trong muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ, Phospho, Kali và Sắt. + Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm lượng ≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lượng từ 2- 20 mM. + Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphat, hai loại hợp chất hay được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lượng phospho trong môi trong môi trường nuôi cấy từ 0,15- 0,40 mM. + Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2- 25 mM [14]. - Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 30 ppm, chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme. + Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.