1
LỜI CÁM ƠN
Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang đến nay cm đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp
đại học. Em xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực
phấm đã tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu chuyên môn của mình.
Lời cám ơn chân thành tới TS. Huỳnh Nguyền Duy Bảo đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian làm
thực tập tốt nghiệp.
Xin chân thành cám ơn quỷ thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phấm trường Đại học Nha Trang đã tận tình
giúp đỡ giải đáp những thắc mắc khó khăn tạo điều kiện cho cm hoàn thành đồ án.
Cám ơn cán bộ phòng thí nghiệm các bộ môn Công nghệ Chế biến, Công nghệ Thực phấm, Công nghệ Sinh học,
Hóa- Vi sinh, viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài của mình.
Cám ơn sự giúp đỡ của gia đình và bạn bò đã động viên, khích lệ trong thời gian vừa qua.
Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên thực hiện Đặng Kim
Chung
MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN.....................................................i
MỤC LỤC..........................................................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH............................................................................................................V
LỜI MỞ ĐẦU....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỐNG QUAN...............................................................................................2
1.1. Tổng quan chitin-chitosan.................................................................................2
1.1.1...........................................................................................................................Nguồn gốc, cấu tạo phân tử của
chitin-chitosan .................................................................................................2
1.1.1.1........................................................................................................................Nguồn gốc chitin, chitosan
2
1.1.1.2........................................................................................................................Công thức cấu tạo chitin, chitosan
..........................................................................................................................2
1.1.1.3 Độ deacetyl của chitin và chitosan........................................................................3
1.1.1.4........................................................................................................................Phân tử lượng của chitosan
4
2
1.1.2.........................................................................................Tính chất của chitosan
4
1.1.2.1........................................................................................................................ Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
của chitosan......................................................................................................5
1.1.2.2........................................................................................................................ Khả năng tạo màng của chitosan
..........................................................................................................................5
1.1.2.3........................................................................................................................Các tính chất khác của chitosan
..........................................................................................................................6
1.1.3.........................................................................................ứng dụng của chitosan
6
1.1.3.1.
ứng............................................................dụng chitosan trong thực phẩm
6
1.1.3.2.
ứng......................................dụng chitosan trong nông nghiệp và thủy sản
7
1.1.3.3.
ứng..................................................dụng chitosan trong xử lý môi trường
8
1.1.3.4.
ứng...............................dụng chitosan trong y học và công nghệ sinh học
8
1.2. Chitosan thủy phân............................................................................................8
1.2.1.........................................................................Giới thiệu về chitosan thủy phân
8
1.2.2...........................................................................................................................Đặc điểm tính chất chitosan thủy
phân...................................................................................................................9
1.2.3...........................................................................................................................Một số phương pháp thuỷ phân
chitosan có khối lượng phân tử thấp................................................................9
1.2.4...........................................................................................................................ứng dụng chitosan thủy phân 10
1.2.4.1........................................................................................................................Trong công nghiệp thực phẩm
..........................................................................................................................10
1.2.4.2........................................................................................................................ứng dụng trong mỹ phẩm
1.2.4.3.......................................................................................Trong lĩnh vực y dược
10
10
1.2.5...............................................................................................................Thủy phân chitosan bằng H2 S04
13
1.2.5.1............................................................................................................Cơ chế thủy phân chitosan bằng H2S04
...............................................................................................................13
1.2.5.2............................................................................................................Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng cắt
mạch chitosan bằng H2SO4.................................................................13
1.3. Quá trình oxy hóa ..................................................................................14
3
1.3.1....................................................................................................Gốc tự do 14
1.3.2............................................................................................................... Định nghĩa chất chống oxy hóa
14
1.3.3............................................................................................................... Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể 14
1.3.4....................................................................................Chất chống oxy hóa 16
1.3.5...............................................................................................................Cơ chế chống oxy hóa của chitosan 19
1.3.6.
Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hoá của chitosan trên thế giới và
Việt Nam.................................................................................................................20
1.3.6.1.
Tình
hình
nghiên
cứu
khả
năng
chống
oxy
hóa
chitosan
trên thế giới............20
1.3.6.2.
Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của
Việt
Nam..22
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.......................24
2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................24
2.1.1.....................................................................................Chitosan 24
2.1.2.....................................................................................Hóa chất 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................26
2.2.1..............................................................................................Thí nghiệm thủy phân chitosan bằng H 2 SƠ4
..............................................................................................26
2.2.2..............................................................Phương pháp phân tích 29
2.2.2.1...................................................................................Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi
.....................................................................................29
2.2.2.2...................................................................................Phương pháp xác định độ ẩm và độ
deacetyl........................................................................29
2.2.2.3.Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH 30
2.2.2.4.....................Phương pháp xác định tổng năng lực khử 31
2.3. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................32
CHƯƠNG III. KÊT QƯẢ NGHIÊN cúư VÀ THẢO LUẬN...............................33
3.1. Hiệu suất thu hồi của chitosan thủy phân bằng H2 SƠ4 ........................33
3.2. Độ ẩm của chitosan thủy phân bằng H2 SƠ4 ..........................................34
3.3. Độ deacetyl của chitosan thủy phân bằng acid H2 SƠ4 ..........................35
3.4. Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và độ deacetyl của chitosan thủy
4
3.5. phân bằng H2SO4.................................................................................................37
3.6. Đe xuất quy trình sản xuất chitosan có hoạt tính chống oxy hóa bằng phương
pháp thủy phân bởi acid H2SO4........................................................................................................... 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIÉN..................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHÁO....................................................................................................45
V
PHỤ LỤCDANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế tác động của gốc tự do đến tế bào
..............................................................................15
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan....................................................................24
Hình 2.2. Chitosan nguyên liệu........................................................................................25
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thủy phân chitosan bằng acid H2SO4.........................27
Hình 2.4. Đường chuẩn DPPH.........................................................................................31
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân bằng acid H2SO4...................................33
Hình 3.2. Độ ẩm của chitosan thủy phân bằng acid H2SO4.............................................34
Hình 3.3. Độ deacetyl của chitosan thủy phân bằng H2SO4.............................................35
Hình 3.4. Quá trình deacetyl hóa và thủy phân cắt mạch chitosan thủy phân bằng
H2SO4..............................................................................................................................37
Hình 3.5. Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan thủy phân bằng H2SO4.............38
Hình 3.6. Tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và độ deacetyl của
chitosan thủy phân bằng H2SO4......................................................................................39
Hình 3.7. Tổng năng lực khử của chitosan thủy phân bằng acid H2SO4.........................40
Hình 3.8. Tương quan giữa tổng năng lực khử và độ deacetyl của chitosan thủy
phân bằng acid H2SO4........................................................................................................................ 41
Hình 3.9. Quy trình sản xuất chitosan có hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp
thủy phân bằng H2SO4......................................................................................................42
Hình 3.10. Chitosan thủy phân (1) và chitosan kết tủa bằng NaOH (2).........................43
6
Hình 3.11. Chitosan thủy phân bằng H2SO4 sau khi sấy
43LỜI MỞ ĐẦU
Chitin là một polymer sinh học tồn tại phổ biến trong vỏ các loài giáp xác như tôm
cua, mực, một số loại vi khuẩn,... Dần xuất của chitin là chitosan co nhiều tính chất đặc biệt
như khả năng tạo màng, tạo gel, kháng khuẩn, kháng nấm,... được ứng dụng nhiều vào các
ngành công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thài, công nghệ sinh học và y dược,... Các tính
chất này phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử và độ deacetyl của chitosan.
Chitosan mạch ngắn và chitooligosaccharide là sản phẩm thu được từ quá trình
phân cắt chitosan bằng các tác nhân: vật lý (chiếu tia bức xạ[21]); hóa học (sử dụng H202,
các loại acid H2S04, HC1, HNO3...). Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan mạch ngắn, khối
lượng phân tử thấp, độ deacetyl cao có hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan được sản
xuất theo quy trình thông thường. Một trong số những tính chất đó là hoạt tính chống oxy
hóa.
Chitosan và chitosan mạch ngắn giữ vai trò là chất chống oxy hóa, ngăn ngừa sự hư
hỏng thực phẩm do các tác nhân oxy hóa gây ra. Điều này đã được ứng dụng tạo màng bảo
quản thực phẩm như các loại trái cây, thịt bò, cá trích, ... Hơn nữa, chitosan và chitosan
mạch ngắn còn ngăn chặn, giảm thiểu tác hại của các tác nhân oxy hóa cơ thể, hủy hoại tế
bào bằng cách liên kết với các phân tử có hại, làm giảm và phá hủy hoạt tính của chúng.
Đe tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl đến hoạt tính chong oxy hóa của
chitosan thủy phân hằng H2SO4” nhằm tìm ra điều kiện thủy phân thích hợp( thời gian thủy
phân và nồng độ acid), ảnh hưởng của độ deacetyl với hoạt tính chống oxy hóa của
chitosan thủy phân dưới tác nhân là acid suliùric để có cơ sở thiết lập quy trình sản xuất
chitosan có hoạt tính chống oxy hóa.
7
CHƯƠNG I: TÓNG QU AN
1.1. Tổng quan chitin-chitosan
1.1.1. Nguồn gốc, cấu tạo phân tử của chitin-chitosan [1]
ỉ.1.1.1. Nguồn gốc chitin, chitosan
Chitin là polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose. Chitin ít khi ở dạng
tự do mà luôn liên kết với protein dưới dạng phức họp cacbonat canxi và nhiều họp chất
hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết. Chitin là một polysaccharide được cấu tạo
bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4-glucosid, có công thức phân tứ
là (CsHuOsNX,. Chitin có cấu trúc hóa học giống cellulose và có thể xcm là một dẫn xuất
của cellulose với nhóm acctamido ớ cacbon số 2.
Chitin đóng vai trò là thành phần chính cấu tạo nên độ cứng chắc của vỏ giáp xác.
Chitin được tách chiết lần đầu tiên vào năm 1811 bới nhà dược hóa học người Pháp Henri
Braconnot từ nấm (Braconnot, 1811).
Chitosan là một dần xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá
trình deacetyl hóa chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan
được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thường ở dạng vẩy hoặc
dạng bột có màu trắng ngà. Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và
cellulose chi khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2.
1.1.1.2.
Công thức cấu tạo chitin, chitosan
Chi tin
c=
0
CH3
c=0
ç=0
CH3
CH3
y OH
/OH
8
{ NH2 j
yOH
NH2
NH2
Chitosan
Trong thực tế thưÒTig có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan
khoảng 10%. Vì vậy công thức chính xác của phân tử chitosan là:
CH5OH
H
NH2
Công thức phân tử: ( C6H| 1O4 )n
Phân tử lượng: M=1000-5000 Dalton tùy loại. Trong mồi mắt xích phân tử cúa
chitosan có chứa nhóm amin nên nó là một polyamin). Chitosan có M>= 10 6 Dalton, phải
hòa tan trong môi trường axit acetic loãng 0,5%-l%.
1.1.1.3 Độ deacetyl của chitin và chitosan
Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng, đặc trưng cho tỉ lệ
giữa 2-acetamido-2deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D- glucopyranose trong
phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan thì có độ deacctyl cao,
tức là chứa nhiều nhóm amino.
Ngoài độ deacetyl thì sự phân bố của các nhóm glucosamine cũng ảnh hưởng đen
tính chất của chitosan. Cụ thổ, chitosan phân bố dạng rời rạc dễ tan hơn chitosan phân bố
dạng khối.
D-D-A-D-D-A-A-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-A- Phân bố
dạng random (ròi rạc) của phân tử chitosan
D-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-A-A-A-A-
9
Phân bố dạng block (dạng khối) của phân tử chỉtosan
Trong đó: D: D-glucosamine
A: N-acetyl glucosamine
1.1.1.4. Phân tử lượng của chitosan
Phân tứ lượng của chitosan là một thông sổ cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính
chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu,
đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có độ nhớ
càng cao. Thông thường, phân tử lượng cùa chitosan nằm trong khoáng từ 100000 dalton
đến 1200000 dalton (Li và cộng sự, 1997). Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào
nguồn chitin và điều kiện deacetyl va thường rất khó kiểm soát. Tuy nhicn, chitosan có
phân tứ lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng
trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học, Chitosan có phân tử lượng lớn có khá
năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt cúa chitosan phụ
thuộc và phân tử lượng. Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 32-200cps và có
phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000-4000 cps. Ngoài ra, độ nhớt
cùa chitsosan còn phụ thuộc vào độ dcacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ.
1.1.2.
Tính chất của chitosan
Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic,
acid propionic, acid citric, acid lactic. pKa của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8. Khi hòa
tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương. Đây là một điềm rất đặc biệt
vì đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương sẽ có khá
năng bám dính bồ mắt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các kim loại và
tương tác tốt với các polyme tích điên âm.
Tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khá năng hấp phụ chất màu, kim
loại, kết dính với chất béo, kháng khuấn, kháng nấm, mang DNA... phụ thuộc rất lớn vào
độ deacetyl hóa. Chitosan có độ dcacetyl cao thì có khá năng hấp phụ chất màu, tạo phức
với kim loại tốt hơn. Tương tự, khá năng kháng khuấn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở
các mầu chitosan có độ deacetyl cao. Cụ the, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có
1
0
độ deacetyl trên 90%. Tuy nhiên, khả năng hút nước chỉ chitosan thì giảm đi khi tăng độ
deacetyl. Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy khả năng hút nước của
chitosan có độ deacetyl thấp (75%) đạt đến 659% cao hon nhiều so với chitosan có độ
deacetyl hóa cao (96%) chỉ đạt 486%.
1.1.2.1.
Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan
Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn gram âm, vi khuẩn
gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào độ
deacetyl, phân tử lượng. So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt
hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trị carbon thứ 2 ở pH nhở hơn 6. Chitosan có độ
deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có phân tử
lượng dưới 2000 dalton thì khả năng tức chế vi sinh vật kém. Chitosan có phân tử lượng
trên 9000 dalton có khả năng ức chế vi sinh vật cao (Jeon và cộng sư, 2000). Tuy nhiên,
chitosan có phân tử lượng lớn thì khả năng kháng khuẩn cũng thấp. Chitosan được hòa tan
trong dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn,
kháng nấm.
Chitosan có khả năng ức chế Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia
coli, saccharomyces cerevisỉae, Rhodotoruỉa glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus
stolonifer, Aspergillus niger. Nồng độ ức chế phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật,
điều kiện áp dung, và thường được sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5%. Ngoài ra các
dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt. Ncarboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1-5 mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả
năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus jlavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và
cộng sự, 1999).
1.1.2.2.
Khă năng tạo màng của chitosan
Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt. Tính chất cơ lý của màng chitosan như độ
chịu kéo, độ rắn , độ ngấm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và độ deacetyl hóa
của chitosan. Chitosan độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn cao hon
màng chitosan độ deacetyl thấp; tuy nhiên, chúng có độ trương nở thấp hơn.
1
1
Ngoài ra, tính chất của mang chitosan phụ thuốc rất nhiều vào dung môi sử dụng
hòa tan chitosan để tạo màng, độ ran (crystallinity) của màng chitosan cũng phụ thuộc vào
dung môi sử dụng.
1.1.2.3.
Các tính chất khác của chitosan
Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa. Khả năng
chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào đô deacetyl, phân tử lượng và độ nhót của
chitosan. Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao. Hơn nữa, chitosan
cỏ thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất màu. Do chitosan không tan trong nước nên
chitosan ổn định hơn trong môi trường nước so với các polymer tan trong nước như alginat,
agar. Khả năng tạo phức, hấp phụ với protein, lipid và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân
tử lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến động lớn với
các mẫu chitosan. Chitosan có độ deacetyl cao thì thường hấp phụ màu tốt.
1.1.3.
ủ ng dụng của chitosan
1.1.3.1.
ứng dụng chitosan trong thực phẩm
Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan là hợp chat polymer tự nhiên an toàn với
những tính chất đặc trưng như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tạo
màng, tạo gel, hấp phụ màu,... nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chế biến
vào bảo quản thực phẩm.
Nhiều kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về khả năng kéo dài thời
gian bảo quản cảu nhiều đối tượng rau quả tươi, thịt, nước quả ... của chitosan và các dẫn
xuất của nó (Roller và Covill, 1999; Sagoo và cộng sự, 2002; Shahidi và cộng sự, 1999;
Synowiecki và Ali-Khateeb; 2003). Chitosan cũng được sử dụng để bảo quản quả tươi
(đào, lê, kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho...). Ở Việt nam,
chitosan cũng đã được sử dụng trong bảo quản xúc xích, sản xuất chả giò (Tú và Khánh,
2003; Luyến và Hiền, 2006).
1.1.3.2.
Úng dụng chitosan trong nông nghiệp và thủy sản
+ Trong nông nghiệp
Trong nông nghiệp, chitosan được sứ dụng để tăng cường sự hoạt động của các vi
sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công cứa nấm
trong đất và tăng cường khá năng nẩy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh
1
2
trưởng và tăng năng suất thu hoạch. Đặc biệt, chitosan có đóng vai trò là chất kích thích hệ
miễn dịch của cây (plant dcfence booster) và sự hoạt động cùa enzyme chitinase
(Chandrkrachang, 2002; Dzung và Thang, 2002; Vasudevan và Rcddy, 2002; BautistaBanos và cộng sự, 2005; Luan và công sự, 2006; Dzung, 2009).
Chitosan được nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica campestris sp.).
cho lượng cải thu hoạch tăng lên (Wonggroung và cộng sự, 2002).
Hạt giống ngâm bằng chitosan và phun chitosan lên lá có thể tăng năng suất lên 1,6
lần (New và cộng sự, 2006). Đối với hạt giống lúa mì, khi được xử lý trong dung dịch
chitosan thì tỷ lên nảy chồi hình thành cây con tăng lên 25%, rễ và lá phát triển mạnh hơn
so với mấu không xử lý chitosan (Freepons, 1997).
Đe mở rộng ứng dụng cùa chitin, chitosan cần phát triển nghiên cứu thử nghiệm
trên các đối tượng cây trồng khác nhau, thử nghiệm nhiều loại chitosan, tìm ra loại
chitosan, lương sự dụng cho từng loại cây và từng giai đoạn phát triển của cây. Phát triển
lợi thế đa chức năng, đa tác dụng khi sử dụng chitosan như báo vệ hạt giống, bảo vệ cây
trồng, tăng năng suất ...
+ Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản
1.1.3.3.
Chitosan được nghiên cứu bô sung vào thức ăn cho tôm, cá đề kích
thích sinh trưởng, tăng miền dịch và cái thiện môi trường ao nuôi (Anderson và
Siwicki, 1994; Wanichpongpan và Chandrkrachang, 2002). Thức ăn bổ sung
chitosan có khả năng làm tăng sự phát triển và tỷ lệ sống của cá so với thức ăn
bình thường. Ngoài ra chitosan cũng được ứng dụng làm màng bao, làm chất kết
dính đế làm tăng độ ổn định của thức ăn tôm (Trung và Phượng, 2005; Phượng
và cộng sự, 2008).Ứng dụng chitosan trong xử lý môi trường
Chitosan được ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trường nhờ khả năng hấp
phụ, tạo phức với các ion kim loại (Pb, Hg, Cd, Fe, Cu ...), các chất màu, khả năng keo tụ,
tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ. Do đó, chitin, chitosan được sử dụng như là một trong
các tác nhân chình đc xử lý nước thải (Hirano, 1996; Mattheus, 1997; Synowiecki và AliKhateeb, 2003).
1.1.3.4.
Úng dụng chitosan trong y học và công nghệ sinh học
Chitosan và dẫn xuất có các tính chất quan trọng như tương thích sinh học cao, tự
phân hủy sinh học, khá năng tạo màng, không độc, có khả năng làm lành vết thương, kháng
khuẩn, kháng nấm và kháng vi rút nên chúng được nghicn cứu và triển khai ứng dụng nhiều
trong y học. Hiện nay, chitin và chitosan đã được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực kiêm
soát quá trình giải phóng thuốc (drug release control), vận chuyến làm chất mang DNA
trong liệu pháp gene, thuốc giảm béo, thuốc chữa khớp, trị bỏng, da, chỉ nhân tạo, kháng
viêm ... (Hirano, 1996; Dpdame và Vilivalam, 1998; Kumar , 2000; Rinaudo, 2006). Tượng
tự, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chitin, chitosan và dẫn xuất được ứng dụng trong
công nghệ nuôi cấy mô tế bào động thực vật, cổ định enzyme, cố đinh tế bào, làm chất
mang DNA.
1.2. Chitosan thủy phân (chitoolỉgosaccharỉde-COS)
1.2.1.
Giói thiệu về chitosan thủy phân
1
4
Chitosan thủy phân là quá trình khử nhóm (-CO-CH3) tách khỏi phân tứ chitin,
chitosan, ờ điều kiện thích hợp làm cho trọng lượng giảm, độ nhớt giảm, độ dcacetyl tăng
lên. Chitosan được nghiên cứu thủy phân bằng nhiều phương pháp, có thể sử dụng phương
pháp sinh học hoặc hoá học. Có hơn 30 loại enzyme có thể được sử dụng đc cắt mạch
chitosan. Tuy vậy phương pháp này vẫn còn những hạn chế khi sản xuất ở quy mô lớn.
Chitosan có trọng lượng phân tử thấp đạt được bằng việc depolymer bởi enzyme đã được
nghiên cứu bởi Nagasawa và cộng sự. Acid hydrochloric đã được dùng để thuỷ phân
chitosan và sau đó những nồ lực khác trong việc sử dụng acid nitrous, acetic acid, acid
sulfuric và acid hydrofluoric đế cat mạch chitosan cũng đã được tiến hành. Các tác giả
Allan, Chang, Tanioka, và cộng sự, 1995, đã sản xuất thành công chitosan có trọng lượng
phân tử thấp bằng việc cắt mạch bới các tác nhân oxy hóa như ozone, Natri nitrite và
hydroperoxit.
1.2.2.
Đặc điểm tính chất chitosan thủy phân
+ Đặc điểm:
- Khả năng hòa tan trong acid cao
- Có trọng lượng phân tử thấp, có độ nhớt thấp, độ deacetyl cao.
- Dc hấp phụ các ion kim loại nặng như: Cu, Hg, Cr, Pb, Ni, Cd
+ Tính chất:
- Tính chống oxy hóa cao kéo dài được thòi gian bảo quản, tính diệt khuẩn, chống
lại sự oxy hoá, giữ mùi cho sản phấm, chổng ung thư.
- Chitosan thủy phân điều có tính kháng khuẩn, như ức chế hoạt động của một số
loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng
trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bcn ngoài.
- Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng khí thực phấm,
chống oxy hóa gừa rau quả tưoi lâu hơn.
1
5
1.2.3.
Một số phưong pháp thuỷ phân chitosan có khối lượng phân tử
thấp
Đe sản xuất chitosan có khối lượng phân từ thấp, các nhà khoa học đã nghiên cứu
nhiều phương pháp thủy phân cắt mạch chitosan như: sử dụng các acid mạnh H2S04 [8],
HC1 [9,10,12], NaN02 [11], sử dụng các loại enzyme khác nhau để thuỷ phân cắt mạch.
- Lấy 2g chitosan hoà tan trong 100ml dung dịch acid acetic, sau đó sấy khô đến
khối lượng không đổi thu được dạng keo. Sau đó lay 100ml dung dịch HCl(đđ) 37% bổ sung
vào khuấy đều và nâng lên nhiệt độ 72°c trong 30 phút khuấy đảo. Phản ứng được kết thúc
bằng cách cho vào trong nước đá. Phần lớn các dung môi và acid HC1 bay hơi trong điều
kiện hút chân không. Bã còn lại hoà tan trong nước và cô đặc, sau cùng tách ra làm hai,
phần cặn hoà tan trong nước điều chỉnh pH=6,5 bang NaOH 10M. Dịch thuỷphân sau khi
trung hoà được kết tủa bằng metanol 90% và tách rửa sạch, sấy khô chân không thì thu
được chitosan hoà tan trong nước [12].
- Lấy 0,25g chitosan trộn với 25ml dung dịch acid H2S04 có 72, 216, 360mM
trong bình thủy tinh lOOml đậy kín đun
120°c trong 5-240 phút. Hỗn hợp làm nguội
bằng nước đá và điều chỉnh pH về 8-10 bằng dung dịch NaOH 30ml ( 150, 450, 750mM)
kết tủa chitosan được tách ra và rửa bằng nước cho đến trung tính. Sau đó lọc tách chitosan
rửa về trung tính và sấy chân không thăng hoa [8].
1.2.4.
ứng dụng chitosan thủy phân [18]
1.2.4.1.
Trong công nghiệp thực phẩm
Ở Mehico, các loại bánh bắp thường được bảo quản nhân tạo không đảm bảo sức
khỏe con người. Trong một nghiên cứu sử dụng khả năng kháng nấm của
chitooligosaccharide để bảo quản bánh bắp. Người ta tiến hành phân cắt chitosan bằng
chitosanase trong 2, 4, 8 và 14h. Ket quả cho thấy khả năng kháng nấm Aspergilỉus của
chitooligosaccharide được phân cắt sau 4h là tốt nhất.Vì thế, chitooligosaccharide có thể
được dùng thay thế các chất bảo quản nhân tạo trong bảo quan bánh bắp cũng như các thực
phẩm khác. Đối với thực phẩm chức năng, chitooligosaccharide có thể sử dụng làm thành
phần trong thực phẩm tốt hơn chitosan và chitin do khả năng tan hoàn toàn trong nước.
Chất này có độ ngọt thấp, năng lượng thấp, không gây ra phản ứng phụ, có khả năng hạ
1
6
thấp lượng mỡ và đường trong máu và tăng cường khả năng của hệ miễn dịch.
Chitooligosaccharide không chỉ kích thích sự phát triển của nhóm bacillus mà còn kìm hãm
quá trình sinh sản của vi sinh vật gây bệnh và nắm gây độc trong một người.
1.2.4.2.
ứng dụng trong mỹ phẩm
Chitooligosaccharide phát huy tính năng giữ ẩm hiệu quả trong lĩnh vực này. Chất
này được sử dụng trong các sản phẩm sữa rửa mặt và kem. Chitooligosaccharide trong
thành phần mỹ phẩm không những ngăn ngừa được sự mất đi độ ẩm của sản phẩm trước và
sau khi sử dụng trên da mà còn dễ dang thâm sâu vào da, mang theo các thành phần chăm
sóc da khác trong sản phẩm và tăng tuần hoàn máu.
1.2.4.3.
Trong lĩnh vực y dược
1
7
Diệt khuẩn gây hại: Chitooligosaccharide có khả năng tăng
cường hoạt tính diệt khuẩn so với chitosan.Ngăn ngừa ung thư :
chitooligosaccharide đóng góp khả năng ngăn ngừa ung thư bằng cách hoạt hóa các tế
bào lympho trong cơ thể và điều khiển sự tăng sinh và lan rộng của tế bào ung thư.
Ngoài ra cũng theo cách tăng cường hệ thống miễn dịch (gián tiếp) và tính kháng
khuẩn (trực tiếp mà chitooligosaccharide có khả năng giúp cơ thể chống lại ký sinh
trùng gây bệnh).
Tác động tế bào: chitooligosaccharide tăng cường sự sinh sản và tiết ra kháng
thể IgM của tế bào lai HB4C5 ở người in vitro. Còn thử nghiệm in vivo,
chitooligosaccharide có tác dụng tăng mức IgM và IgG trong huyết tương, tăng
cường lượng lectin kích thích phân bào và khả năng tăng cường khả năng phân bào
của chuột.
Bảo vệ gan: trong khi chitosan thường chỉ có tác dụng trong vùng dạ dày và
ruột và không được hấp thụ vào trong hệ thống tiêu hóa, chitooligosaccharide có thể
đi đến một kết và được cắt nhỏ trước khi hấp thụ vào trong cơ thể.
Chitooligosaccharide bảo vệ gan rất hiệu quả. Một ví dụ điển hình là khi uống rượu,
thông thường, sau khi vào cơ thể, rượu sẽ được chia nhỏ và sẽ thành các acetaldehyde
gây ra nhức đầu, mệt mỏi và hại gan. Chitooligosaccharide có thể phân cắt nhanh các
acetaldehyde thành những chất không độc, giảm được độ thấm của rượu và
acetaldehyde, giảm nồng độ rượu trong máu và thúc đẩy quá trình hồi phục trong
những rối loạn sau khi uống rượu. Vì thế, chitooligosaccharide có thể được thêm vào
thức uống có cồn như bia, rượu,...
Tác động đến các chỉ số huyết học: chitooligosaccharide có khả năng giảm lượng mỡ và đường trong máu, hạ cholesterol,
giảm nồng độ uric acid trong máu, điều chỉnh huyết áp, tăng sự hấp thụ canxi vào cơ thể, ngăn ngừa táo bón và
bệnh tim. Hiệu quả chống bệnh tiểu đường của chitooligosaccharide đã được chứng minh dựa trên mô hình chuột
sơ sinh bị tiểu đường không phụ thuộc insulin do kích thích streptozotocin. Hàm lượng đường trong máu giảm
khoảng 19% khi cho chuột uống 0,3% chitooligosaccharide. Sau khi uống chất này trong 4 tuần, hàm lượng
đường trong máu chuột thí nghiệm giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng. Bên cạnh đó, hàm lượng insulin được tạo
thành do sự hiện diện của đường tăng rõ rệt, mức triglycéride
giảm 49% so với nhóm đối chứng. Mức
cholestérol trong máu chuột thí nghiệm giảm khoảng 10%. Các triệu chứng của bệnh tiểu
đường như tạo không bào ti thể, hiện tượng phân tách và thoái hóa cơ giảm hẳn nhờ uống
chito- oligosaccharide.
Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kết hợp với lipid,
ngăn cản sự phát triển của u bướu, là tác nhân miễn dịch và có nhiều các ứng dụng trong y tế.
Chitosan có trọng lượng phân tử thấp (5-20kDa) dường như có tác dụng lên chức năng sinh
hoá so với chitosan có trọng lượng phân tử cao hơn.
Những chitosan có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa ngăn ngừa được sự phát triển
của bệnh đái tháo đường và biểu hiện ái lực cao với lipopolysaccharides hơn là chitosan có
trọng lượng phân tử 140 kDa. Chitosan có trọng lượng phân tử thấp trong khoảng 5-10kDa có
khả năng ức chế mạnh với nhiều loại tác nhân gây bệnh bao gồm Fusarium oxyporum,
Phomopsis fukushi, Altemaria altemata.
Chitosan với trọng lượng phân tử thấp (khoảng 5kDa) ngăn ngừa được sự gia tăng của
cholestérol của chuột khi sử dụng thức ăn đã được bổ sung cholestérol. Suzuki và cộng sự,
1986 đã phát hiện rằng chito-hexamer ngăn chặn sự phát triển của khối u Sarcoma-180 và
Meth-A trong chuột.
Chitosan oligomer cũng như chitosan thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nhiều
nấm mốc và vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh. Hinaro và Nagao đã nghiên cứu về
mối quan hệ giữa mức độ polymer hoá (DP) của chitosan với hiệu quả kháng khuẩn của
chitosan. Nghiên cứu kết luận rằng chitosan oligome (DP 2-^8), như chitosan trọng lượng
phân tử thấp, thể hiện khả năng ức chế hiệu quả hơn chitosan phân tử lượng cao đối với hầu
hết vi khuẩn gây bệnh như Fusarium oxyporum, Phomopsis fukushi, Altemaria alterna ta và
nhiều chủng khác. Kendra cũng đã giải thích rằng sự hiện diện của một số chitosan oligome
có hoạt tính sinh học trên đậu hà lan đã hạn chế sự phát triển của nấm mốc.
1.2.5.
Thủy phân chitosan bằng H2S04 [2]
1.2.5.1.
Cơ chế thủy phân chitosan bằng H2S04
Trong quá trình thủy phân chitosan bằng H 2S04, liên kiết glucoside 1,4 trong chuỗi
polysaccharide bị bẻ gẫy làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan. Quá trình cắt mạch
chitosan diễn ra theo một loạt các phản ứng hóa học. Chitosan ưu tiên nhận thêm một proton
do H2S04 sinh ra để ion hóa nhóm NH2 trong phân tử thành NH3+ theo phản ứng:
R-NH2 + H+=R-NH3+
H2SO4= H++ SO42-
Hoặc H2S04 + R -NH2 + H+=R -NH3+ + S042 + H+
Trong suốt quá trình phản ứng cấu trúc của chitosan không có sự thay đổi. Mạch
chitosan chỉ bị ngắn lại do liên kết glucoside 1,4 bị cắt đứt, còn các nhóm amino được bảo vệ
bởi axit.
1.2.5.2.
Các yếu tố ảnh hưởng tói khả năng cắt mạch chitosan bằng H2S04
Phản ứng cắt mạch chitosan bằng H 2S04 phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhưng một số
yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng cắt mạch chitosan:
Ảnh hưởng nồng độ H2S04
Khả năng cắt mạch chitosan tăng dần theo chiều tăng nồng độ H 2S04. Nghiên cứu chỉ
ra rằng trọng lượng phân tử của sản phẩm thủy phân chitosan giảm dần khi nồng độ H 2S04
tăng. Một lượng nhỏ H 2S04 cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan. Khi điều
kiện phản ứng được giữ không đổi, nồng độ H 2S04 càng cao thì trọng lượng phân tử càng
giảm.
Ánh hưởng của nhiệt độ và thòi gian
Cũng theo nghiên cứu của Feng Tian Yu Liu và các nhà khoa học trên thế giới cho
biết tốc độ cắt mạch chitosan tăng mạnh khi nhiệt độ và thời gian tăng lên. Ảnh hưởng của
loại chitosan
Tùy vào loại chitosan khác nhau mà thủy phân bàng H 2S04 . Chitosan có độ deacetyl
càng cao thì thủy phân càng nhanh và càng triệt để. Ngoài ra còn phụ thuộc vào môi trường.
1.3. Quá trình oxy hóa [25]
Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng ứng hóa học trong đó electron được
chuyển sang chất oxy hóa.
1.3.1.
Gốc tự do [27]
Theo định nghĩa, gốc tự do ( free radical) là bất cứ phân tử hóa chất nào chỉ cỏ một
điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử.
về khía cạnh hóa học, phần nhỏ nhất của vật thể gọi là nguyên tử. Mỗi nguyên tử có
một nhân với một số chẵn điện tử xoay chung quanh, giống như các hành tinh quay chung
quanh mặt trời. Phân tử gồm một số nguyên tử dính với nhau do tác dụng của các đôi điện tử.
Một vài khi, ưong diễn tiến hỏa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở
thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên rất bất ổn, dễ
tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác,
và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của
tế bào. Trong cuộc đời của một người sống tới 70 tuổi, thì có chừng 17 tấn gốc tự do được tạo
ra như vậy.
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học
gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn
thương cho tế bào.Trước đó, người ta cho là gốc này chỉ có ở ngoài cơ thể.
1.3.2.
Định nghĩa chất chống oxy hóa
Chất chống oxy là chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác.
Làm giảm tác dụng của các quá trình oxy hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau và với
các phân tử có hại, giảm sức mạnh phá hủy của chúng.
Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm
hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng.
1.3.3.
Ảnh hưởng của gốc tự do tói cơ thể ]27|
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sanh ra
và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mồi ngày. Ở
- Xem thêm -