Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung của các chất hữu cơ đến sự phát sinh cơ quan của loài lan hoàng thảo kèn (dendrobium lituiflorum) giai đoạn in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------ NGUYỄN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT BỔ SUNG HỮU CƠ ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LOÀI LAN HOÀNG THẢO KÈN (Dendrobium lituiflorum) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Sinh học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- NGUYỄN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT BỔ SUNG HỮU CƠ ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LOÀI LAN HOÀNG THẢO KÈN (Dendrobium lituiflorum) GIAI ĐOẠN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Trần Trung Kiên đã hƣớng dẫn tận tình, quan tâm và động viên em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, ngày tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thùy Linh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là của tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và đƣợc phép công bố. Phú Thọ, ngày tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thùy Linh iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC : Than hoạt tính BAP : Benzylamino purine ĐC : Đối chứng IAA : Indole acetic acid KC : Knudson C NAA : Naphthalen acetic acid MS : Môi trƣờng Murashige & Skoog MT : Môi trƣờng PLSs : Protocorom iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến hệ số nhân, đặc điểm chồi của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .................................... 27 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 28 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................................................................... 30 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 32 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 35 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 36 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 39 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 41 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................................................................... 43 v DANH MỤC BẢNG Hình 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến hệ số nhân chồi..................... 28 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chuối đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 29 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của chuối đến chiều cao của thân ............................... 29 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của chuối đến số rễ. ..................................................... 30 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của chuối đến số lá. ..................................................... 31 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 33 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến chiều cao của thân.......................... 33 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến số rễ. ............................................... 34 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến số lá. ............................................... 35 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của khoai tây đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 37 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của khoai tây đến chiều cao của thân ........................ 37 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của khoai tây đến số rễ. ............................................. 38 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của khoai tây đến số lá. ............................................. 39 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pepton đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 41 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pepton đến chiều cao của thân ............................ 42 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pepton đến số rễ. ................................................. 42 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pepton đến số lá. ................................................. 43 vi MỤC LỤC Phần I: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2 Phần II: NỘI DUNG ......................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................. 3 1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) ................................. 3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố ...................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3 1.1.3. Lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .................................................... 5 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........................... 6 1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 6 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật .............................................................................................................. 7 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ................................. 8 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro ................................... 9 1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro ............................................................. 11 1.2.6. Môi trƣờng nuôi cấy in vitro ................................................................. 12 1.2.7. Tầm quan trọng của phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........ 16 1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hoàng Thảo .................................................... 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.......................................................... 18 1.4. Các chất bổ sung hữu cơ .......................................................................... 20 1.4.1. Chuối ..................................................................................................... 20 1.4.2. Nƣớc dừa ............................................................................................... 20 1.4.3. Khoai tây ............................................................................................... 21 vii 1.4.4. Peptone .................................................................................................. 21 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .................. 22 NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22 2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 22 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 22 2.3.1. Phƣơng pháp luận.................................................................................. 22 2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 22 2.3.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu ................................................................ 25 2.3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu..................................................................... 26 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 27 3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến khả năng nhân nhanh cụm chồi cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................... 27 3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 28 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 28 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 30 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 32 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .......................................... 32 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 34 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 36 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .......................................... 36 viii 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 38 3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của peptone lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 40 3.5.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 40 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 45 1.Kết luận ........................................................................................................ 45 2.Kiến nghị ...................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 46 Tài liệu tham khảo tiếng việt........................................................................... 46 Tài liệu tham khảo nƣớc ngoài........................................................................ 47 1 Phần I: MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Họ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất với khoảng trên 35.000 loài phân bố rộng rãi trên toàn thế giới (Dressler1993). Đây là họ hoa đẹp và thƣờng có hƣơng thơm nên rất đƣợc ƣa chuộng. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì Việt Nam có 137 - 140 chi với trên 1000 loài [3]. Trong những năm gần đây, đời sống vật chất bớt khó khăn, nhu cầu thƣởng thức hoa của ngƣời Việt ngày càng đƣợc chú trọng và phát triển, chính vì vậy việc cung cấp lan giống cho thị trƣờng càng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, các giống hoa lan phổ biến trên thị trƣờng nƣớc ta hiện nay chủ yếu là do nhập ngoại từ Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc.., việc tự nhân giống để cung cấp cho thị trƣờng trong nƣớc vẫn còn nhiều hạn chế. Lan rừng tuy không rực rỡ sắc màu nhƣ những giống lan ngoại nhập nhƣng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hƣơng thơm vì vậy luôn đƣợc ƣa chuộng đối với những ngƣời chơi lan. Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại trong đó lớn nhất phải kể đến chi Dendrobium (còn gọi là Hoàng Thảo). Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) là loại hoa rất đẹp và quý hiếm. Hoàng Thảo Kèn là loại lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ cao khoảng 300 - 1600 m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng. Tại Việt Nam, cây có mặt ở miền Bắc. Hoàng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7 cm, mọc từng chùm 2 - 3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn. Hiện nay, Hoàng Thảo Kèn rất ít đƣợc tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo riết. Ngƣời chơi hoa ai cũng muốn đƣợc sở hữu Hoàng Thảo Kèn trong vƣờn khiến giá thành của Hoàng Thảo Kèn tự nhiên bị đẩy lên rất cao và trở thành loài ngày càng bị săn lùng khai thác nhiều hơn đến cạn kiệt.Việc nhân giống Hoàng Thảo Kèn theo phƣơng pháp truyền thống rất chậm không đáp ứng đủ nhƣ cầu ngƣời chơi [1]. 2 Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân giống (in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm. Trong nhân giống in vitro, ngoài môi trƣờng nuôi cấy cơ bản, ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy các vitamin, các chất điều hòa sinh trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa quả nhƣ: chuối, nƣớc dừa, khoai tây…chúng có ảnh hƣởng rất lớn đến hệ số nhân và chất lƣợng của chồi, cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng phát sinh cơ quan. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng trong việc nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo Kèn, tuy nhiên các công trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất bổ sung hữu cơ hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới rất ít và chƣa đầy đủ. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài:: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất bổ sung hữu cơ đến sự phát sinh cơ quan của lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) giai đoạn in vitro”. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ các chất bổ sung hữu cơ đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum). 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học làm cơ sở đánh giá những tác động của các chất bổ sung hữu cơ đến khả năng phát sinh cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum). 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô loài lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum), góp phần sản xuất giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên địa bàn tỉnh Phú Thọ 3 Phần II: NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố Giới: Plantae Bộ: Asparagales Họ: Orchidaceae Phân họ: Epidendroideae Chi: Dendrobium Giống lan Dendrobium đƣợc đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium có nguồn gốc từ Hy Lạp, Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống. Dendrobium rất phong phú về chủng với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Châu Úc [3]. Trên thế giới chi lan Hoàng Thảo có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển. Các đại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, chúng thƣờng mọc ở nơi ẩm, với độ cao 500 - 1500 m so với mực nƣớc biển, cũng có khi gặp chi lan này mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000 m so với mực nƣớc biển. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Lan Dendrobium có thể chia thành hai nhóm theo dạng thân của chúng: - Dạng thòng (Nobile) là dạng thân mền thƣờng ở vùng có khí hậu mát mẻ, hoa đƣợc tạo ra từ chồi sơ khởi của giả hành đã trƣởng thành, gồm: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng… - Dạng đứng (Phalaenopsis) là dạng thân cứng thƣờng sống ở vùng khí hậu nóng hơn, hoa đƣợc mọc ở giả hành cú lẫn giả hành mới. Ở giả hành mới, 4 chồi non nhất ở ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa, gồm: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên… Chi Hoàng thảo có một số đặc điểm sau: - Thân: Chi lan Hoàng Thảo là cây thân thảo mọc cụm, thẳng đứng hoặc rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số ít các loài sống bám trên đá, trong rừng ẩm. Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhƣng lại chứa diệp lục, dự trữ nƣớc và nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới. Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp [3]. Thân của các đại diện chi Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy...Có chiều dài từ 2 - 3cm đến 120 cm. Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, đôi khi hình 4 cánh thay đổi từ 0,3 - 1,5 cm. Phần gốc, nơi xuất phát của rễ thƣởng nhỏ mảnh nhƣng cũng có thể phình to [4]. - Rễ: Rễ của các đại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thƣờng ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống. Ở một số loài đƣợc bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó có ánh lên màu xám bạc. Chiều dài rễ từ 0,1 - 0,3 cm; rễ thƣờng mọc từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân một vài loài. - Lá: Lá mọc thành hai dãy so le, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm lấy thân. Lá thƣờng cứng, dạng đa bóng, bề mặt thƣờng nhẵn, đôi khi bề mặt và bẹ lá (thƣờng khi lá non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng [4]. - Cụm hoa: Cụm hoa chùm thƣờng nhiều hoa hoặc ít hoa. Cụm hoa dài thƣờng rũ thõng xuống, nhiều loài hoa có giá trị làm cảnh [4]. - Hoa: Hoa lƣỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số có loài có hƣơng thơm. Bao hoa chia hai vòng. Vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên. Vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi [4]. 5 - Cằm: Là một bộ phận đƣợc hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên dính nhau và dính với chân cột. Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều [4]. - Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thƣớc và trang trí. Trang trí đa dạng trên cánh môi nhƣ đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đƣờng sống, lông phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại. Nhiều loài có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa [4]. - Quả: Quả nang thƣờng hình chạy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Hạt rất nhỏ, hầu nhƣ không trọng lựợng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió [4]. - Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt lan có kích thƣớc rất nhỏ, phôi hạt chƣa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng hạt chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tƣơng thích trong điều kiện phù hợp hạt sẽ nảy mầm [4]. 1.1.3. Lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) Hoàng Thảo Kèn tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum. Phong lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây có độ cao khoảng 300 -1600 m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng, loài Kèn có khả năng chịu lạnh xuống đến 1,2 ºC. Chúng cần ánh sáng trung bình, không ƣa ánh nắng trực tiếp. Thân cây dài 50 - 80 cm mềm mại rủ xuống, hình trụ,căng tròn, nhẳn bóng, thon nhọn dần về phía đầu ngọn, đôi khi đốt thân thắt hình thoi rất nhẹ. Lá hẹp, thuôn dài, dẻo dai rụng vào mùa thu. Hoa mang sắc tím quyến rũ biến thiên từ nhạt đếm sậm, môi hoa hình chiếc kèn, vành môi trắng. Hoàng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7 cm, mọc từng chùm 2 - 3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn, phát sinh từ thân cây trụi lá cũ. Cây nở hoa từ cuối mùa đông đến mùa xuân, rất thơm và lâu tàn. Hoàng Thảo Kèn cần nhiều ẩm và phân bón trong lúc phát triển thân non, chỉ để khô 6 khi cây đã ngừng phát triển. Kèn thuộc loại dễ trồng, nhƣng điều đó còn phụ thuộc vào thời tiết vùng miền. Hoàng Thảo Kèn nhìn xa rất giống với Den.anosmum vì màu tím trầm na ná nhƣng thực tế so sánh nhau thì hình dáng khác biệt hoàn toàn, Giả Hạc kiêu sa, Kèn quyến rũ. Hoàng Thảo Kèn là một trong những loại lan tuyệt đẹp và quý hiếm. Ngoài tự nhiên bây giờ rất khó còn tìm thấy do bị săn lùng quá nhiều vì vẻ đẹp của chúng. Ở một số nơi trên thế giới nó còn đƣợc đƣa vào diện đƣợc bảo vệ nghiêm ngặt. Nƣớc ta may mắn là một trong những vùng đất đƣợc tạo hóa ban cho loài Hoàng Thảo Kèn, nếu không có biện pháp bảo vệ kịp thời có thể lâm vào nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Ngƣời ta đã tính đến chuyện nuôi cấy mô đại trà cho loài này để giảm tải sự săn lùng chúng trên rừng... 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trƣởng. Trƣớc kia ngƣời ta dùng phƣơng pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào nhƣ sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật nhƣ sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thƣơng mại trong đời sống hàng ngày của con ngƣời. 7 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật Năm 1902, nhà thực vật học ngƣời Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mô mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia đƣợc [10]. Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô). Hai tác giả đã nuôi đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trƣờng lỏng có chứa đƣờng glucozơ và muối khoáng thu đƣợc hệ rễ nhỏ [10]. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (ngƣời Mỹ) đã duy trì đƣợc sinh trƣởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên môi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men [10]. Trong thời gian 1941 - 1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin đƣợc nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic (NAA), axit 2,4 D - dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…Năm 1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trƣởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá. Một năm sau, chất đó đƣợc tổng hợp thành công và đƣợc Skoog gọi là kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối của auxin/cytokinin và từ đó đƣa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy, đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến nay [10]. Trong khoảng thời gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã đƣợc phát triển và hoàn 8 thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp...Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính địa lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và đã tạo ra đƣợc các protocom từ địa lan. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa. Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dƣợc. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả ngƣời Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tƣợng lý tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [10]. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã đƣợc phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật… 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học ngƣời Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đƣa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn 9 chỉnh” [10]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phản hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong những điều kiện môi trƣờng thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ nhƣ tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó đƣợc gọi là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình điều hoà hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, quá trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó. 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro Quá trình nuôi cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn: * Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trƣởng của mẫu cấy in vitro. 10 * Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy. * Giai đoạn 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lƣợng thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính. Phải xác định đƣợc môi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Nếu môi trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Điều kiện nuôi cấy thƣờng là 25 - 27 0C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tƣợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối. * Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi trƣờng tạo rễ. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trƣờng không chứa chất điều hòa sinh trƣởng. * Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờm ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao