Tài liệu Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

Phần I : Cơ sở lý thuyết HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng . Phần I : Cơ sở lý thuyết 1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) . 2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo . Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion . Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết . Phần I : Cơ sở lý thuyết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động . Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác . Cháút phán têch A +B+C F1 Pha ténh F2 F3 Pha âäüng Phần I : Cơ sở lý thuyết Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược lại . Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột . Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột . ( như hình dưới đây ) Phần I : Cơ sở lý thuyết : Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký Pha động Thời gian A B Phần I : Cơ sở lý thuyết 3 - Phân loại sắc ký : Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau : 3.1 Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực . + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực . Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau .... Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi. Phần I : Cơ sở lý thuyết Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau : L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH2,CN . . vv Phần I : Cơ sở lý thuyết 4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên Phần I : Cơ sở lý thuyết To : Thời gian lưu chết tr2 t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 tr1 : Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B t’r1 to t’r2 Phần I : Cơ sở lý thuyết Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để dánh giá một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc ký. 4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố : + Bản chất sắc ký của pha tĩnh. + Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan + Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động . Phần I : Cơ sở lý thuyết Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày . 4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng . K’ = ( tR - t0)/ t0 Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’ lớn thì Peak bị doãng . Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 - Độ chọn lọc  : Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách .,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc  .  = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng = 1.02 = 1.16 = 1.20 Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồìng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động . Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố : + Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh + Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động + Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột . Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau : N = 5,54 ( tR / W0,5)2 Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân tích . W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak . Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Độ phân giải R : ( Resolution ) Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau : R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB) Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp + Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cách sau: * Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôíi cường độ ion nếu là IE - HPLC ....) * Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Độ phân giải R : ( Resolution ) * Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động . + Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi . Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak ta phân tích . Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên sắc ký đồ thu được . T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak : T = a/b a b Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T, Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) * Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận * Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân đối hơn theo các cách sau : + Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ cột đêïn Detector . + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu . Phần I : Cơ sở lý thuyết 5 Phân loại sắc ký và ứng dụng : + Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các loại sau đây : Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố - sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu . 5.1 Sắc ký hấp phụ : * Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) cuả pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ .Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ: Phần I : Cơ sở lý thuyết + Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực . + Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực pha động phân cực . Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau .......