Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Luận văn nghiên cứu phương pháp phân tích nồng độ estriol ở người bằng phương ph...

Tài liệu Luận văn nghiên cứu phương pháp phân tích nồng độ estriol ở người bằng phương pháp huỳnh quang

.PDF
58
449
86

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI ĐÀM THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NỒNG ĐỘ ESTRIOL Ở NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HUỲNH QUANG Chuyên ngành: Hóa học phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Tạ Văn Thạo HÀ NỘI, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Hà Nội, tháng 6 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Hóa Phân tích- Khoa Hóa họcTrường Đại học Sư phạm Hà Nội. Bằng tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Tạ Văn Thạo – người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Hoá Phân tích - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin chân thành cảm ơn các em sinh viên trong phòng thí nghiệm tổ bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ em. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn cao học K25 Hóa Phân tích, bạn bè và người thân đã ủng hộ và động viên em hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 6 năm 2017 Học viên Đàm Thị Hà 2 MỞ ĐẦU I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Estriol (E3), hoặc oestriol, còn được gọi là 16α-hydroxyestradiol hoặc estra-1,3,5 (10) -triene-3,16α, 17β-triol; là một estrogen steroid tự nhiên và là một trong ba dạng estrogen chính trong cơ thể con người. Ở phụ nữ không mang thai buồng trứng gần như không sản xuất Estriol, tuy nhiên lại tăng cao ở phụ nữ mang thai. Estriol có thể đo được trong máu hoặc nước tiểu của phụ nữ mang thai và có thể được sử dụng như một dấu hiệu của sức khỏe của thai nhi . Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra mối liên hệ giữa hàm lượng của Estriol và các dị tật bẩm sinh của thai nhi liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể (như bệnh Down, Edwards, Patau). Việc sàng lọc các dị tật bẩm sinh (DTBS) cho thai nhi trước khi sinh thông qua định lượng chỉ số Estriol đã được tiến hành thường quy ở các nước tiên tiến, cho thấy vai trò quan trọng của Estriol đối với người mang thai. Trong những thập niên gần đây, phân tích hóa sinh đã trở thành một trong những lĩnh vực nghiên cứu bùng nổ, minh chứng rõ nhất là các báo cáo khoa học liên quan đến lĩnh vực này luôn có số lượng lớn nhất. Các nghiên cứu cũng chỉ ra những tiến bộ vượt bậc trong việc nâng cao độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu của phép phân tích từ cấp độ nguyên tử, phân tử, đại phân tử đến tế bào, cho phép ứng dụng không chỉ trong lĩnh vực y học mà còn có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác như hóa học, môi trường hay thực phẩm. Trong đó, protein chip là một hướng nghiên cứu mới, có tiềm năng trong tương lai, giúp các phép phân tích trở nên đơn giản, gọn nhẹ, tiết kiệm mà vẫn chính xác. Các Protein chip đang sẵn sàng trở thành một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong lĩnh vực sinh học quy mô lớn vì tiềm năng to lớn của chúng trong nghiên cứu cơ bản, chẩn đoán và khám phá dược phẩm. Việc chế tạo các Protein chip phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật cố định các phân tử thu lên bề mặt đế (điện cực, màng hay các giếng polymer), các kỹ thuật này quyết định trực tiếp đến độ nhạy, độ bền, độ lặp lại của phép phân tích. Trong 3 kỹ thuật cố định phổ biến hiện nay gồm: 1) liên kết hóa học, 2) tương tác sinh học và 3) hấp phụ vật lý thì kỹ thuật thứ 2 có các ưu điểm hơn hai phương pháp 2 còn lại là đơn giản. Hơn nữa, việc lựa chọn kỹ thuật dò trong chế tạo Protein chip cũng đóng vai trò quan trọng quyết định đến độ nhạy của chip. Phương pháp đo phổ huỳnh quang được xem là phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao, các nghiên cứu gần đây cho phép việc ứng dụng các phân tử phát huỳnh quang trong đánh dấu các phân tử thu trở nên dễ dàng và thuận lợi hơn nhiều. Vì vậy việc áp dụng phổ huỳnh quang trong phân tích sinh hóa ngày càng được các nhóm nghiên cứu quan tâm. Với những lí do trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phân tích nồng độ Estriol ở ngƣời bằng phƣơng pháp huỳnh quang”. II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Mục đích của đề tài này bao gồm: 1) Tìm ra điều kiện tối ưu để cố định kháng thể Estriol lên bề mặt giếng polystyren theo phương pháp hấp phụ vật lý. 2) Ứng dụng phân tích uE3 trên các mẫu chuẩn và mẫu thật dựa trên việc đo tín hiệu huỳnh quang của kháng thể dò. III. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Kháng thể Estriol và bề mặt giếng polystyrene. - Mẫu máu của thai phụ ở thai kỳ hai. IV. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp thu thập, phân tích số liệu: Tổng quan, phân tích các tài liệu khoa học có liên quan đến vấn đề nghiên cứu. - Phương pháp thực nghiệm: Phương pháp thu thập mẫu, tách triết mẫu; phương pháp đo phổ huỳnh quang… - Phương pháp quan sát: Được vận dùng thường xuyên trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. - Phương pháp phân tích tổng hợp và đánh giá. V. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 3 - Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể lên bề mặt polystyren của giếng. - Xây dựng quy trình phân tích nồng độ kháng thể được cố định dựa trên phương pháp huỳnh quang. - Ứng dụng phân tích nồng độ Estriol ở thai phụ. 4 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN I.1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN CHIP I.1.1. Khái niệm và vài nét lịch sử Một microarray protein (hoặc protein chip) là một phương pháp thông lượng cao được sử dụng để theo dõi các tương tác và hoạt động của protein, và để xác định, định lượng và phân tích chức năng của protein trong nghiên cứu cơ bản và trên quy mô lớn[19] . Ưu điểm chính của nó là ở chỗ số lượng lớn các protein có thể được theo dõi song song. Chip bao gồm một bề mặt hỗ trợ như một tấm kính trượt, màng nitrocellulose, hạt hoặc tấm microtitre, mà một mảng protein được gắn cố định ràng buộc. [17] Các phân tử protein, thường được dán nhãn với thuốc nhuộm huỳnh quang, được thêm vào mảng. Bất kỳ phản ứng nào giữa đầu dò và protein cố định phát ra tín hiệu huỳnh quang được đọc bởi máy quét laze. [18] Các phân tử protein cực nhanh, tự động, tiết kiệm, và rất nhạy cảm, tiêu thụ một lượng nhỏ các mẫu và thuốc thử. [20] Khái niệm và phương pháp của các mô hình protein chip lần đầu tiên được giới thiệu và minh hoạ trong các mô hình kháng thể - kháng thể (còn gọi là ma trận kháng thể) vào năm 1983 trong một ấn bản khoa học [3] và một loạt các bằng sáng chế. [24] Công nghệ thông lượng cao đằng sau protein chip tương đối dễ phát triển vì nó được dựa trên công nghệ phát triển cho các mô hình ADN, [7] đã trở thành các vi phân được sử dụng rộng rãi nhất. I.1.2. Cấu tạo chung của protein chip Cấu tạo chung gồm 4 phần cơ bản là bề mặt rắn( chất nền hay giếng), phần cố định, mẫu và đầu dò. 5 Đầu dò Mẫu Phần cố định Chất nền Hình I.1 Cấu tạo của Protein chip a. Chất nền (bề mặt rắn hay giếng) Các protein được bố trí trên bề mặt rắn như các mặt trượt kính hiển vi, màng, hạt hoặc các tấm vi trùng. Chức năng của bề mặt này là giúp protein được cố định trên bề mặt. Nó phải thể hiện tính chất liên kết tối đa, đồng thời duy trì protein trong cấu hình ban đầu để duy trì khả năng ràng buộc. Kính hiển vi slide được làm bằng thủy tinh hoặc silicon là một sự lựa chọn phổ biến vì chúng tương thích với các máy thu thập dữ liệu và máy quét laser đã được phát triển cho công nghệ vi hạt ADN. Tấm giếng Nitrocellulose được sử dụng rộng rãi như chất kết dính protein cao nhất đối với các ứng dụng protein chip. Bề mặt rắn đã được lựa chọn sau đó được phủ một lớp phủ phải đáp ứng các chức năng đồng thời của việc giữ ổn định protein, ngăn ngừa sự biến tính của protein, định hướng protein theo hướng thích hợp để có thể tiếp cận các vị trí liên kết và cung cấp môi trường ưa nước, trong đó phản ứng liên kết có thể xảy ra. Ngoài ra, bề mặt rắn cần phải tương thích với các hệ thống phát hiện khác nhau. Các tác nhân cố định bao gồm các lớp nhôm hoặc vàng, polyme ưa nước, và gel polyacrylamide, hoặc xử lý các amin, aldehyde hoặc epoxy. Các công nghệ màng 6 mỏng như lắng đọng hơi vật lý (PVD) và lắng đọng hóa học (CVD) được sử dụng để phủ lớp phủ lên bề mặt đỡ. Môi trường nước là điều cần thiết ở tất cả các giai đoạn sản xuất mảng và hoạt động để ngăn chặn sự biến đổi protein. Do đó, bộ đệm mẫu chứa một lượng glycerol cao (để hạ điểm đóng băng) và độ ẩm của môi trường sản xuất được điều chỉnh cẩn thận. Microwells có lợi thế kép là cung cấp một môi trường nước trong khi ngăn ngừa sự lây nhiễm chéo giữa các mẫu. Để đạt được sự gắn chặt protein bề mặt chip và bền vững, trong khi giữ lại hoạt động và chức năng của các protein, một số nhóm nghiên cứu đã tạo ra những phản ứng cộng hóa trị trên kính có thể liên kết cộng hóa trị với các protein [29, 15, 30] . Nói chung, một liên kết chéo bifunctional được sử dụng để thay đổi bề mặt chip; những liên kết chéo này có một nhóm chức năng phản ứng với các nhóm hydroxyl trên bề mặt rắn và một chất khác có thể phản ứng trực tiếp với các nhóm amin của các protein mong muốn (ví dụ: aldehyde, epoxy, hoặc NHS-ester nhóm) hoặc có thể thay đổi về mặt hóa học để đạt được độ đặc hiệu tối đa [16, 11]. Một bề mặt chip cụ thể có thể được dẫn xuất bằng một liên kết chéo chức năng hoặc kết hợp các liên kết chéo chức năng khác nhau để cải thiện khả năng liên kết protein, [22] b. Phần cố định Các phần cố định được gắn trên bề mặt rắn có thể là kháng thể, kháng nguyên, aptamers (các phối tử gốc nucleic), các chất affibodies (các phân tử nhỏ được thiết kế để bắt chước các kháng thể đơn dòng) hoặc các protein dài. Các phần cố định này được lựa chọn hết sức cẩn thận để khi gắn lên bề mặt rắn, chúng không bị biến tính và duy trì tính đặc hiệu của protein gắn vào chúng. 7 Protein rất nhạy cảm với những thay đổi trong môi trường vi mô. Điều này thể hiện một thách thức trong việc duy trì mảng protein trong điều kiện ổn định trong một khoảng thời gian dài. Các phương pháp liên quan đến việc tổng hợp các protein trên chip khi được yêu cầu, trực tiếp từ ADN sử dụng các hệ thống biểu hiện protein không có tế bào. Vì ADN là phân tử có độ ổn định cao nên nó không bị biến đổi theo thời gian và do đó thích hợp để lưu trữ lâu dài. Cách tiếp cận này cũng thuận lợi ở chỗ nó tránh được sự tốn kém của quá trình lọc protein riêng biệt và nhân bản ADN vì các protein được tạo ra và cố định cùng một lúc trên bề mặt chip. Các ví dụ về các kỹ thuật tại chỗ là PISA (protein tại chỗ), NAPPA (mảng protein lập trình nucleic) và DAPA (mảng ADN đến mảng protein). c. Đầu dò Các phương pháp dựa trên phát hiện huỳnh quang thường được ưa chuộng để phát hiện vì chúng rất đơn giản, an toàn, nhạy cảm và mang lại độ phân giải cao [23]. Thông thường, một con chip được kiểm tra trực tiếp bằng một phân tử được đánh dấu bằng huỳnh quang hoặc được thăm dò theo hai bước, bằng cách sử dụng đầu dò được gắn nhãn (ví dụ biotin) sau đó có thể được phát hiện trong bước thứ hai sử dụng một chất phản ứng ái lực huỳnh quang (ví dụ: Streptavidin), hoặc bằng cách sử dụng các kháng thể huỳnh quang cụ thể. Các phương pháp phát hiện khác cũng có thể được sử dụng. Ví dụ, ELISA đã được sử dụng để phát hiện các protein trên cả mảng tráng nitrocellulose [2, 13] và mảng kính [6]. Ge et al. [5], và Zhu et al. [29], đã từng sử dụng việc ghi nhãn đồng vị để nghiên cứu sự tương tác proteinprotein, protein-DNA, và protein-thuốc trên mảng tráng ni-trocellulose, cũng như sự tương tác kinase-chất nền trong nanowells. I.1.3. Phân loại 8 Các protein chip có thể phân thành hai loại, tùy thuộc vào ứng dụng của chúng: các phân tử protein chip phân tích và các tế bào vi phân protein chip chức năng. Các protein chip phân tích sử dụng các phân tử có đặc điểm tốt mà đã biết các hoạt động cụ thể như các đầu dò cố định, như các kháng thể, các phức hợp peptit-MHC, hoặc các lectins. Nó đã trở thành một trong những nền tảng phát hiện đa kênh mạnh mẽ nhất và có thể được sử dụng để giám sát biểu hiện protein, nhận biết biomarker, đánh dấu bề mặt tế bào / mô hình glycosyl hóa, chẩn đoán lâm sàng hoặc phân tích an toàn môi trường / thực phẩm.[22] Chip protein chức năng được xây dựng bằng cách cố định số lượng lớn các protein tinh chế trên bề mặt rắn. [9]. Thường thì các protein cố định này không được đặc trưng tốt .Nhiều protein khác nhau, hoặc thậm chí là tổng số protome của một cơ thể, được phát hiện riêng trên một protein chip chức năng. Các protein chip chức năng chủ yếu được sử dụng để sàng lọc các loại hoạt động của protein, bao gồm protein-protein, protein lipid, protein-DNA, protein-thuốc và protein-peptid tương tác; Để xác định các chất nền enzyme; Và để mô tả phản ứng miễn dịch.[22] 9 Hình I.2 Ứng dụng của Protein chip I.1.3. Các mô hình protein chip Có ba mô hình protein chip hiện đang được sử dụng để nghiên cứu các hoạt động sinh hóa của protein. Hình I.3 Các mô hình protein chip Hình C và D: 10 Trong mô hình này, các protein và protein gắn kháng thể đánh dấu được đính trực tiếp vào giếng. Những kháng thể này thường được phát hiện bằng các thử nghiệm phát quang hóa học, huỳnh quang vật lý hoặc colorymetric (nhuộm màu). Các peptide được gắn trên các giếng để cho phép định lượng protein của lysates mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này thường có nhược điểm là làm biến tính các protein do quá trình đính trực tiếp lên giếng . Phương pháp này cho phép xác định sự có mặt của các protein thay đổi hoặc các chất khác có thể là kết quả của bệnh. Cụ thể, sửa đổi sau khi chuyển đổi, thường bị thay đổi do bệnh tật có thể được phát hiện.[8] Hình A: Mô hình “protein bánh kẹp” Trong mô hình này, rất nhiều kháng thể, aptamers hoặc affibodies được gắn trên bề mặt hỗ trợ của bề mặt rắn. Chúng được sử dụng như các phân tử thu nhận vì mỗi tế bào liên kết cụ thể với một protein cụ thể. Hệ thống phân tích vi mô còn được gọi là các mảng chụp. Mảng được khảo sát với một phức hợp protein phức tạp như một lysate tế bào. Phân tích các phản ứng liên kết kết quả bằng cách sử dụng các hệ thống phát hiện khác nhau hoặc các phép đo liên kết ràng buộc và đặc trưng, có thể cung cấp thông tin về mức biểu hiện của các protein đặc biệt trong mẫu. Mô hình “Protein bánh kẹp” này có ưu điểm là tính ổn định cao, triệt tiêu các cân bằng phụ, đặc biệt hữu ích trong việc so sánh biểu hiện protein trong các dung dịch khác nhau. Ví dụ, phản ứng của các tế bào với một yếu tố đặc biệt có thể được xác định bằng cách so sánh các lysates của các tế bào được điều trị bằng các chất cụ thể hoặc được nuôi trong điều kiện nhất định với các lysates của tế bào kiểm soát. Một ứng dụng khác là xác định và mô tả các mô bệnh. 11 Hình B: Các protein và protein đánh dấu cạnh tranh nhau để gắn với kháng thể đính cố định trên giếng. Phương pháp này kém ổn định hơn so với mô hình “ protein bánh kẹp” dosinh ra nhiều cân bằng phụ trong quá trình cạnh tranh. Tuy nhiên, nó có thể sử dụng trong phân tích các mẫu với nồng độ không cao (cỡ nano), khoảng thay đổi nồng độ hẹp, làm tăng độ phân giải. Phương pháp được ứng dụng để xác định các tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA, protein-phospholipid và các phân tử protein-nhỏ khảo nghiệm hoạt động enzym và phát hiện kháng thể và chứng minh tính đặc hiệu của chúng. Các protein chip này được sử dụng để nghiên cứu các hoạt động hóa sinh của toàn bộ proteome trong một thí nghiệm. I.1.5. Vai trò của protein chip Protein chip có thể được dùng để chẩn đoán lâm sàng hoặc phân tích an toàn môi trường / thực phẩm. Protein chip phân tích liên quan đến một chất phản ứng ái lực mật độ cao (ví dụ: kháng thể hoặc kháng nguyên) được sử dụng để phát hiện các protein trong hỗn hợp phức tạp. Chip protein chức năng được xây dựng bằng cách cố định số lượng lớn các protein tinh chế trên bề mặt rắn, có tiềm năng rất lớn trong việc khảo sát các hoạt động sinh hóa khác nhau (ví dụ protein-protein, protein-lipid, protein-nucleic-acid và tương tác enzyme-chất nền) cũng như tương tác với thuốc và xác định ma túy. 12 Hình I.4 Vai trò của Protein chip I.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH PROTEIN Cố định protein (hay kháng thể, antibody) là quá trình gắn các phân tử protein lên một bề mặt đế sử dụng làm các đầu thu sinh học. Trong một số trường hợp nhất định, việc cố định có thể làm mất một phần hoặc toàn bộ hoạt tính của 13 protein vì khuynh hướng gắn ngẫu nhiên và dễ bị biến dạng cấu trúc. Vì vậy, để quá trình cố định các kháng thể không làm mất hoạt tính sinh học của protein thì việc lựa chọn bề mặt và phương pháp cố định đóng vai trò quyết định. Bề mặt đế cũng như quá trình cố định phải không làm ảnh hưởng đến cấu tạo và chức năng của các protein sau khi được cố định.[4] Nhiều kĩ thuật cố định đã được phát triển trong những năm qua, chủ yếu dựa trên ba cơ chế là: hấp phụ vật lý, liên kết hóa học và tương tác sinh học (Hình 1.3). I.2.1. Cố định hóa học Việc cố định protein dựa trên liên kết hóa học là quá trình sử dụng các phản ứng hóa học liên kết protein với bề mặt đế. Các phản ứng được lựa phải căn cứ vào các nhóm chức sẵn có của protein (-NH2, -COOH, -SH) và bề mặt đế (-OH, Au, NH2….)[xx] (Bảng 1.1). Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định protein phải đáp ứng các yêu cầu khắt khe như: không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của protein, có thể phản ứng trong môi trường nước và diễn ra trong nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng nhiệt độ phòng. Việc dùng các liên kết hóa học để cố định protein giúp quá trình cố định bền và ổn định hơn, làm tăng độ lặp của phép phân tích. Tuy nhiên, do các nhóm chức dùng cho quá trình liên kết của protein được phân bố ngẫu nhiên, có nghĩa là bất cứ vị trí nào trên bề mặt protein cũng có thể tham gia vào phản ứng cố định, điều này dẫn đến việc sắp xếp các protein trên bề mặt đế là ngẫu nhiên, không theo trật tự nhất định. Vì vậy, hoạt tính của các protein (đầu thu sinh học) sẽ giảm đi đáng kể (Hình 1.3.b). Hơn nữa, Khi các nhóm chức trên bề mặt protein tham gia phản ứng sẽ ít nhiều làm giảm hoạt tính (biến dạng, biến tính), ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của cảm biến sinh học.[21,4,28] Bảng I.1: Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định hóa học. 14 I.2.2. Cố định vật lý (Hấp phụ vật lý) Cố định vật lý là phương pháp dựa trên tương tác hấp phụ vật lý giữa bề mặt đế và chất cần phân tích (kháng thể). Trong phương pháp cố định vật lý, dung dịch kháng thể cố định được đưa trực tiếp lên bề mặt đế trong một khoảng thời gian nhất định để sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác giữa các phân tử, mà tương tác chủ yếu ở đây là các tương tác yếu như tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện, tương tác Van der Van. [4,12] 15 Hình I.5. Cố định vật lý Ưu điểm của phương pháp cố định vật lý là nó đơn giản, dễ thực hiện, và nổi trội hơn cả so với hai phương pháp đã nêu trên đó là phương pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ nên tính chất, chức năng của protein không bị biến tính trong quá trình cố định. [4] Tuy nhiên, nhược điểm của cơ chế hấp phụ là định hướng ngẫu nhiên, sử dụng các tương tác yếu, độ bền chắc của tương tác lại bị phụ thuộc nhiều vào tính chất bề mặt đế, pH, thời gian hấp phụ và nồng độ chất phân tích (protein), các nhược điểm này làm cho protein dễ bị rửa trôi bởi một số bộ đệm hoặc chất tẩy rửa khi thực hiện phân tích các chất. Ngoài ra, các vấn đề liên quan đến hiệu ứng phát tín hiệu tập trung và tín hiệu nền cao phát ra từ tương tác đặc hiệu có thể dẫn đến tính toán sai lầm của nồng độ chất phân tích. Như vậy, cần phải tìm ra một loại giếng có thể đảm bảo được tính định hướng, hiệu suất gắn kết kháng thể trên bề mặt cao, khó bị mất trong quá trình sử dụng chất tẩy rửa và kháng thể sau khi cố định cũng có tính ổn định. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi khắc phục được nhược điểm và đã tìm ra loại giếng phù hợp được làm từ vật liệu polystiren (PS). Loại giếng làm từ vật liệu PS đảm bảo được tính đinh hướng.[14] 16 I.2.3. Cố định sinh học Cố định sinh học là phương pháp cố định protein lên bề mặt đế dựa trên tương tác của các phân tử sinh học (tương tác sinh học). Trong phương pháp cố định sinh học thì bề mặt đế và protein cố định sẽ được gắn thêm các phân tử sinh học có tương tác với nhau, làm cầu nối giữa bề mặt đế và protein cố định. Các tương tác sinh học thường được dùng như: protein A – kháng thể, streptavidin (STV) – biotin, ADN-ADN…[4] Các protein cố định theo phương pháp này có trật tự sắp xếp cao, tương tác tương đối bền nên cảm biến sinh học dạng này sẽ có độ nhạy và độ lặp cao. Tuy nhiên, việc cố định protein theo phương pháp này cũng có các hạn chế nhất đinh như: 1) cũng giống như phương pháp cố định hóa học, các protein cố định cũng cần được gắn thêm các phân tử sinh học khác có tương tác với bề mặt đế. Việc dùng các phản ứng hóa học để gắn các phân tử sinh học sẽ làm bề mặt protein thay đổi, giảm một phần hoạt tính. 2) Việc bảo quản và lưu giữ các protein đã biến tính cũng trở nên khó khăn hơn, thời hạn sử dụng ngắnn hơn. 3) Việc biến tính cũng làm tăng giá thành của sản phẩm. Và, 4) Quá trình phân tích sẽ phải thực hiên qua nhiều bước, tốn thời gian phân tích hơn các phương pháp khác. Một trong các tương tác hay sử dung trong cố định sinh học là tương tác giữa streptavidin và biotin. Hình 1.4 mô tả quá trình cố định Lectin-FITC thông qua tương tác của biotin-streptavidin-biotin. Lectin-FITC Lectin-FITC HO HO HO HO O O O O HO HO HO HO O O O O STV STV STV STV Hình I.6. Cô định Lectin-FITC trên bề mặt bằng biotin-streptavidin-biotin. 17
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan