Tài liệu Khảo sát tác động của một số dịch chiết compost lên tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu ở invitro

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay Việt Nam đang đứng đầu thế giới về xuất khẩu tiêu. Tiêu Việt Nam đã có mặt ở 73 nước trên thế giới. Sản lượng xuất khẩu chiếm khoảng 50% lượng tiêu xuất khẩu toàn cầu, khẳng định vị trí số 1 trên thị trường quốc tế [35]. Chuỗi công việc với những công đoạn khác nhau liên quan đến hạt tiêu thương phẩm đã thu hút hàng trăm ngàn lao động chủ yếu ở những vùng sâu vùng xa, kinh tế chưa phát triển. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc tạo việc làm, thu nhập ổn định, từ đó bình ổn đời sống xã hội cũng như góp phần CNH-HĐH nông nghiệp nông thôn. Tuy nhiên, trong những năm gần đây hồ tiêu lại trở thành cây thiếu bền vững. Sự thiếu bền vững thể hiện ở sự bấp bênh về giá cả do sự suy giảm về chất lượng và sản lượng hạt tiêu mà nguyên nhân chính là sự phát sinh các dịch bệnh hại trên cây tiêu. Các dịch bệnh hại trên cây tiêu như: bệnh chết nhanh, bệnh chết chậm, bệnh tiêu điên, bệnh tuyến trùng ký sinh…mà nguyên nhân gây bệnh do tác nhân vi khuẩn và nấm gây ra, đặc biệt tuyến trùng ký sinh thực vật đóng vai trò quan trọng là tác nhân tạo điều kiện, tương hỗ và liên kết với vi khuẩn và nấm bệnh tấn công cây trồng. Có thể nói tuyến trùng bướu rễ là nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật quan trọng nhất đối với nền nông nghiệp trên toàn thế giới, phần lớn thuộc giống Meloidogyne. Ở Việt Nam, loài M. incognita là loài ký sinh và gây hại chính ở cây tiêu [3]. Nhiều biện pháp đã được sử dụng trong phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật nói chung và tuyến trùng bướu rễ nói riêng, trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học vẫn được nông dân chủ yếu sử dụng vì tính hiệu quả nhanh và mạnh của nó. Tuy nhiên, bên cạnh những ưu việt mà biện pháp này mang lại thì mặt trái của nó là để lại những tác động xấu đến môi trường (ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái,…) cũng như sức khỏe con người (gây ung thư, quái thai, đẻ non,…). Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều biện pháp ưu việt hơn trong việc kiểm soát tuyến trùng bướu rễ, đem lại kết quả cao mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người (sử dụng các tác nhân sinh học, các hoạt chất sinh học từ thực vật, bổ sung chất hữu cơ, phân bón có nguồn gốc thảo mộc, v.v.) (Noling và Becker, 1994). Sự bổ sung chất hữu cơ như: phân xanh, phân động vật, và compost rất có hiệu quả trong việc kiểm soát các bệnh vùng rễ (Hoitink và Boehm, 1999). Bổ sung vào đất các SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU nguồn dinh dưỡng khác nhau từ các sản phẩm sau thu hoạch nông nghiệp đã được chứng minh về hiệu quả trong kiểm soát các bệnh ký sinh rễ ở thực vật. Phân xanh, phân bò, phân gia cầm, phế thải sau thu hoạch (Akhtar và Alam, 1990, 1992; Abubakar, 1999) và các phụ phế phẩm thu được của ngành công nghiệp chế biến dầu từ cây neem, thầu dầu, oliu (Akhtar và Alam, 1991; Akhatar và Mahmoud, 1994) đã được sử dụng hiệu quả. Mật độ tuyến trùng suy giảm đáng kể được ghi nhận trong cả thử nghiệm nhà kính và ngoài đồng ruộng, đồng thời làm tăng sản lượng và năng suất cho cây trồng (Abubakar và Majeed, 2000). Phân bò đã được thử nghiệm và chứng minh hiệu quả trong kiểm soát tuyến trùng thực vật (Babatola, 1990; Abubakar và Majeed, 2000) [11]. Ngoài ra, việc sử dụng compost trong nông nghiệp còn góp phần giải quyết một lượng lớn phế thải có thể gây ra các vần đề về môi trường sau này. Đặc biệt, đã có một số nghiên cứu ghi nhận khả năng ngăn chặn một số bệnh gây bởi tuyến trùng bướu rễ của compost phế thải nông nghiệp (McSorley và Gallaher, 1995; Oka và Yermiyahu, 2002). Thêm vào đó, sự bổ sung compost còn làm tăng độ màu mỡ của đất cũng như chất lượng và sản lượng cây trồng (Boehm và cộng sự, 1993). Sự kiểm soát tuyến trùng có thể dựa trên các hợp chất độc tố được tiết ra từ compost. Sự kết hợp các hợp chất cao phân tử như hợp chất tanin và phenolic với compost có thể ngăn chặn được tuyến trùng bướu rễ [12].Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát tác động của một số dịch chiết compost lên tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu ở in vitro ”. Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ biến đổi sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới Tp. HCM. 1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau: - Phân tích các chỉ tiêu hóa lý của compost như: độ ẩm, pH, tỷ lệ C/N, axit humic,… nhằm đưa ra các chỉ tiêu phù hợp khi bón cho cây trồng. - Chiết xuất thô các hoạt chất từ các compost. - Bước đầu khảo sát tác động của các dịch chiết compost được ủ từ lá, bánh dầu Jatropha curcas, bèo lục bình (Eichhronia crassipes) và từ rác thải sinh hoạt lên tuyến trùng bướu rễ trên cây hồ tiêu, nhằm tìm ra nồng độ dịch chiết phù hợp để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU - Xây dựng bảng giá trị EC50 để đánh giá độc tính của các loại compost lên tuyến trùng. Đề tài mở ra một hướng nghiên cứu mới trong việc sử dụng compost như một biện pháp trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ ở Việt Nam. Việc sử dụng phân hữu cơ nói riêng và compost nói chung cho sản xuất nông nghiệp vốn là tập quán lâu đời của nền nông nghiệp Việt Nam. Từ lâu đời nay, người nông dân đã sử dụng các phế thải nông nghiệp như rơm rạ, trấu,…ủ hoại mục và bón cho cây. Một số phế thải trong công nghiệp chế biến hải sản như vỏ tôm cua cũng được sử dụng bón vào đất. Việc sử dụng compost không chỉ có ý nghĩa trong nông nghiệp mà việc tận dụng các nguồn phế thải trong sản xuất nông nghiệp làm compost còn góp phần làm giảm đáng kể nguồn thải gây ô nhiễm môi trường. Kết quả nghiên cứu sẽ là bước đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng cũng như đánh giá được khả năng của compost trong việc kiểm soát tuyến trùng bướu rễ cũng như trong chăm sóc cây trồng. 1.3 Hạn chế của đề tài Do giới hạn về thời gian nên đề tài chỉ khảo sát tác động của các dịch chiết compost lên tuyến trùng bướu rễ ở in vitro, chưa tiến hành thử nghiệm ở vườn ươm và ngoài đồng ruộng. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU 2.1 Khái quát về cây tiêu 2.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm sinh thái của cây tiêu [35] Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Piperales Họ: Piperaceae Chi: Piper Loài: P. nigrum Tiêu có nguồn gốc tại các vùng Tây Nam Ấn Độ thời Trung cổ, tiêu là gia vị quý hiếm do người Veniz độc quyền buôn bán. Năm 1498 người Bồ Đào Nha tìm ra đường thuỷ tới Ấn Độ và giành độc quyền buôn bán tiêu cho đến thế kỷ 17. Sau đó, tiêu mới được trồng ở nhiều nước Viễn Đông trong đó có Việt Nam. Ở Việt Nam tiêu được đưa vào trồng trước năm 1943. Trước năm 2003 Việt Nam là nước xuất khẩu tiêu đứng thứ 2 trên thế giới sau Ấn Độ, từ năm 2003 đến nay Việt Nam đứng đầu thế giới về xuất khẩu tiêu. Cây tiêu thích hợp với nhiệt độ bình quân cả năm từ 250C – 300C, nhiệt độ dưới 150C và cao hơn 400C tiêu không phát triển được. Ẩm độ thích hợp bình quân 75 – 90%, ẩm độ cao làm cho hạt phấn dễ dính vào cuống nhị cái và thời gian thụ phấn kéo dài do cuống nhụy trương to khi có ẩm độ, tạo điều kiện cho sự hình thành quả tốt hơn. Cây tiêu cần có mùa khô rõ rệt khoảng 3-4 tháng để quả chính tập trung. Tiêu không thích hợp với mưa lớn và đọng nước ở vùng rễ. Tiêu không thích hợp nơi có gió lớn, gió dễ làm đổ nọc tiêu gây ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tiêu. Gió lạnh về mùa đông ảnh hưởng đến ra hoa, đậu quả. Tiêu là cây ưa ánh sáng, nhất là trong thời kỳ cho quả. Tuy nhiên tiêu cần cây che bóng khi thời tiết nắng gắt. Tiêu có thể trồng ở nhiều loại đất khác nhau: đất đỏ bazan, đất sét pha cát, phù sa bồi, đất xám, v.v. Đất dễ thoát nước đặc biệt không úng ngập, mực nước ngầm sâu SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU >1m. Đất giàu mùn, tơi xốp, thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình, giàu dinh dưỡng, độ pH: 5,5-6,5. Tiêu được trồng tại nhiều địa phương từ Quảng Trị đến Kiên Giang, nhưng có 6 tỉnh trọng điểm là Đồng Nai, Đắc Lắc, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Gia Lai và Đắc Nông. Các tỉnh nói trên duy trì thường xuyên một sản lượng hạt tiêu lớn và đưa Việt Nam trở thành nước xuất khẩu hạt tiêu lớn nhất thế giới. Hiện nay, các địa phương có diện tích trồng tiêu nhiều nhất phải kể đến Đắc Lắc 9.000ha, Gia Lai 3.800ha, Bình Phước 12.000ha, Bà Rịa - Vũng Tàu 5.400ha, Đồng Nai 4.100ha và Quảng Trị 2.400ha. Sự "bùng nổ" diện tích tiêu thời gian qua là do lợi nhuận của cây tiêu so với một số cây trồng khác đã tăng đến mức "kỷ lục": gấp 32,8 lần cà phê, 16 lần cao su, 14 lần điều. Trong những năm qua, nghề trồng tiêu đã có những bước nhảy vọt, lượng tiêu sản xuất và xuất khẩu mỗi năm tăng 20-30%. Năm 2001 Việt Nam xuất khẩu được 55.000 tấn tiêu, năm 2002 đạt gần 70.000 tấn, đưa Việt Nam trở thành nước đứng thứ 2 về diện tích trồng (sau Ấn Độ) và là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu tiêu đen với các chủng loại nổi tiếng trong và ngoài nước như: tiêu Phú Quốc, tiêu Cù và tiêu Hồ Xá (Quảng Trị), tiêu Tiên Sơn (Gia Lai), tiêu Đất đỏ (Bà Rịa), tiêu Di Linh (Lâm Đồng),… Các loại tiêu này được xuất khẩu sang nhiều nước và được đánh giá cao vì có độ thơm và vị cay nồng đặc trưng. Vườn tiêu bị bệnh Vườn tiêu khỏe mạnh Hình 2.1 Hình ảnh về vườn tiêu tại huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU 2.1.2 Giá trị kinh tế của cây tiêu Hiện nay, tiêu Việt Nam đã có mặt ở 73 nước trên thế giới. Sản lượng xuất khẩu chiếm khoảng 50% lượng hồ tiêu xuất khẩu toàn cầu, khẳng định vị trí số 1 trên thị trường quốc tế. Những năm gần đây, giá bán tiêu của Việt Nam đã ngang với giá các nước, thậm chí có thời điểm còn cao hơn. Có đến 50% lượng hạt tiêu xuất khẩu được bán trực tiếp cho các nhà máy chế biến gia vị tại nhiều nước. Các nhà xuất khẩu Việt Nam đã và đang trở thành một mắt xích trong chuỗi phân phối toàn cầu, khả năng chi phối giá cả thị trường cũng được mở rộng. Điều này cho thấy giá trị kinh tế to lớn mà cây tiêu đem lại. Quá trình trồng, chế biến hạt tiêu đã quy tụ hàng trăm thương lái, đại lý và các doanh nghiệp thu mua cung cấp cho khoảng 100 doanh nghiệp chế biến, tạo ra sản phẩm sau thu hoạch và xuất khẩu. Chuỗi công việc với những công đoạn khác nhau liên quan đến hạt tiêu thương phẩm đã thu hút hàng trăm ngàn lao động, chủ yếu tại những địa phương kinh tế chưa phát triển, vùng xa, vùng sâu. Điều này có ý nghĩa lớn trong tạo việc làm, thu nhập ổn định và từ đó bình ổn đời sống xã hội cũng như từng bước góp phần CNH-HĐH nông nghiệp, nông thôn. Để ngành trồng tiêu phát triển bền vững, Bộ NN và PTNT đề ra mục tiêu: giữ ổn định diện tích cây tiêu ở mức 50.00ha, sản lượng 100.000 tấn/năm, các địa phương phải hướng dẫn người trồng thực hiện quy trình của tiêu chuẩn GAP để tạo ra sản phẩm sạch, an toàn, làm cho giá trị hàng hoá ngày càng gia tăng, xây dựng những vùng nguyên liệu tập trung. Chuyển từ sản xuất tiểu nông với kinh nghiệm truyền thống sang sản xuất theo hướng an toàn, chất lượng cao, tổ chức các câu lạc bộ, tổ hợp sản xuất,... giúp nhau cùng phát triển. 2.1.3 Các sâu bệnh hại chính ở cây tiêu [25, 35]  Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu. Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận này tạo điều kiện cho nấm, tuyến trùng xâm nhập và gây bệnh cho cây tiêu.  Rệp sáp giả (Pseudococidae): gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu trên mặt đất, hoặc gốc tiêu, rễ tiêu dưới mặt đất. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU Bệnh sinh lý Thiếu đạm: thường xảy ra ở giai đoạn sau thu hoạch, lá vàng, vàng cam, ngọn lá cháy, lá rụng. Thiếu Kali: đỉnh lá bị cháy kéo dọc theo rìa lá, lá dòn dễ gãy, phiến lá cong, dây không chết nhưng năng suất giảm. Thiếu lân: cây tăng trưởng chậm lại, cằn cỗi, ít đậu trái. Thiếu Mg: phổ biến ở giai đoạn ra hoa và lúc trái già, lá mất màu diệp lục, gân lá màu vàng, lá trưởng thành có màu xanh nhạt, và sau đó lá bị rụng. Thiếu Ca: cây cằn cỗi, các lóng ngắn lại, lá non màu xanh nhợt, mép lá cháy xém gần phiến lá màu xanh nhạt, xuất hiện các đốm nâu ở giữa gân lá mặt trên và mặt dưới lá.  Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora sp. do tác động của côn trùng, tuyến trùng, chăm sóc xới xáo, ngập úng… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm nhập và gây hại. Các đọt mầm sinh trưởng không dài thêm, lá chuyển màu xanh nhạt, mềm yếu, cành mềm yếu. Những ngày tiếp theo lá chyển sang màu vàng làm lá, hoa và cuối cùng là cành bị rụng. Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phân của cây.  Bệnh chết chậm: bệnh do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp. các loại nấm này thường tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước, trên cây giống…Cây bị bệnh sinh trưởng và phát triển chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng. Hoa quả rụng dần từ gốc đến ngọn. Các đốt cũng rụng dần từ trên xuống dưới, gốc thối, bó mạch thân cây hóa nâu.  Bệnh thán thư: bệnh do nấm Colletotrichum sp. gây ra. Cây bị bệnh trên lá, đọt hoa và quả xuất hiện nhiều đốm vàng nhạt không đều có quầng đen bao quanh. Hoa, quả khô đen sau đó lan sang dây nhánh làm khô cành, rụng đốt.  Bệnh tiêu điên: do virus gây nên, tác nhân truyền bệnh là rầy làm lá cong vẹo, cây lùn, lá nhỏ lại, cằn cỗi, năng suất giảm.  Bệnh tuyến trùng [25] Tiêu bị nhiều loại tuyến trùng gây hại, trong đó có hai loại tuyến trùng phổ biến nhất là: tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục hang Radopholus. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU Triệu chứng: sự phát triển yếu đi dần dần và đặc điểm lá bị vàng là triệu chứng đầu tiên do tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne gây ra. Hiện tượng bạc vàng lá xuất hiện ở toàn bộ cây. M. incognita ký sinh làm giảm khả năng hấp thu các khoáng: P, K, Cu, Zn, và Mn (Ferraz và cộng sự, 1988). Sắc tố của lá bị giảm đáng kể bởi tuyến trùng bướu rễ, làm cho lá già và chết (Ferraz và Lordello, 1989). Ở rễ xuất hiện các khối u lớn , tại đó tuyến trùng cái sẽ đẻ trứng và ký sinh sâu trong các mô rễ (Ramana, 1992; Ramana và cộng sự, 1994). Rễ bị thối, cây sinh trưởng kém đi, trở nên còi cọc, thân khô héo, tuyến trùng bướu rễ tạo ra các u bướu ở rễ, tạo đều kiện cho nấm bệnh xâm nhập và phát triển mạnh. Ngưỡng xâm nhiễm (infection threshold lever) của Meloidogyne spp. là 47 ấu trùng/ 100g đất và 305 ấu trùng/ 10g rễ (Mustika, 1978). Ngưỡng gây hại (damage threshold lever) là 100–10.000 ấu trùng/cây giống (Freire và Bridge, 1985c; Mohandas và Ramana, 1991), và ngưỡng kinh tế (economic threshold lever) là 10.000 ấu trùng/ 100g. 2.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật 2.2.1 Khái niệm về tuyến trùng thực vật [3, 9] Tuyến trùng thực vật là nhóm tuyến trùng chuyên hóa với đời sống ký sinh ở thực vật đang phát triển. Trải qua quá trình tiến hóa tuyến trùng đã thích nghi và có mặt trong hầu hết các bộ phận của thực vật như: rễ, thân, lá, hoa, quả, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác xâm nhập vào các mô sâu hơn, một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Trong quá trình phát triển và dinh dưỡng trên thực vật, tuyến trùng có thể gây ra nhiều biến đổi về cơ học cũng như về sinh lý, sinh hóa bất lợi đối với thực vật chủ. Do quá trình châm chích, di chuyển và dinh dưỡng trên cơ thể thực vật tuyến trùng ký sinh thường gây ra tổn thương cơ học như phá hủy mô, tạo ra các vết thương bề mặt và bên trong thân và rễ thực vật. Các quá trình sinh lý của thực vật như hút các chất khoáng trong đất, vận chuyển chất dinh dưỡng và khả năng quang hợp bị biến đổi hoặc bị phá hủy. Các biến đổi về sinh hóa thực vật do tuyến trùng ký sinh tiết ra các men tiêu hóa làm thay SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU đổi các quá trình sinh hóa bình thường của cây. Ngoài tác hại trực tiếp như trên, tuyến trùng còn tạo điều kiện, liên kết, hoặc tương hỗ với các tác nhân gây bệnh khác như nấm, vi khuẩn và virus, gây nên các bệnh khác nhau cho thực vật. Chúng phá vỡ mô tế bào và mạch dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh khác xâm nhiễm dẫn đến hiện tượng cây bị bệnh với nhiều triệu chứng cùng một lúc. Do ký sinh và gây hại cho thực vật, tuyến trùng thực vật thực sự trở thành mối đe dọa cho ngành nông nghiệp. Chúng có thể làm giảm khả năng của thực vật kháng lại sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác và làm cho tác hại đối với thực vật càng trầm trọng thêm. Một số tuyến trùng ký sinh chuyên hóa có thể làm giảm 12,5% sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính hàng năm là hàng tỷ đô la mỗi năm [3]. Tuyến trùng thực vật sống tập trung nhiều ở tầng đất canh tác, đặcbiệt ở độ sâu 5-20cm. Chúng có kích thước nhỏ bé và có số lượng vô cùng lớn. Chúng có mặt và phá hoại ở nhiều nơi, trên các loại cây trồng thuộc các họ thực vật, trên các loại đất khác nhau, trong vườn ươm và trên đồng ruộng.Về triệu chứng gây hại dễ nhầm lẫn với triệu chứng do các nguyên nhân khác gây ra như: hiện tượng cây thiếu nước, thiếu chất dinh dưỡng, các bệnh do virut, vi khuẩn,… thậm chí do côn trùng hoặc nhện gây hại. Hàng năm tuyến trùng làm giảm 10-20% năng suất cây trồng trên thế giới. Powell (1984) cho biết: chỉ tính riêng tuyến trùng bướu rễ gây hại trên cây thuốc lá năm 1982 vùng Bắc Carolina đã làm giảm 0,77% sản lượng, gây thiệt hại 8 ngàn 932 USD [9]. 2.2.2 Lịch sử nghiên cứu về tuyến trùng thực vật [3] Tuyến trùng thực vật đã được tìm thấy từ giữa thế kỷ 18. Lần đầu tiên Needham (1743) đã phát hiện ra tuyến trùng thực vật trên bông lúa mì, khi quan sát những hạt lúa mì bị dị tật, teo lại ông đã phát hiện ra hàng loạt các động vật dạng sợi di chuyển xoắn vặn trong nước, được Steinbuch đặt tên là Vibrio tritici. Trong những năm cuối thế kỷ 19 và 4 thập niên đầu của thế kỷ 20 chỉ có ít các nhà khảo sát nghiên cứu tuyến trùng. Trong giai đoạn này tuyến trùng ký sinh thực vật ít được chú ý, cho đến khi ở Mỹ, Cobb xuất bản cuốn sách đầu tay về sự tồn tại và tầm quan trọng của tuyến trùng khác không phải là giun tròn ký sinh ở động vật thì mới bắt đầu dấy lên SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU sự quan tâm thực sự đến tuyến trùng ký sinh thực vật. Từ những năm 1960 tại Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới, tuyến trùng học nói chung và tuyến trùng thực vật nói riêng đã trở thành môn khoa học nghiên cứu các quy luật sinh thái học, phát triển của tuyến trùng, nhất là các loài tuyến trùng ký sinh thực vật. Ở Việt Nam, mặc dù nghiên cứu tuyến trùng chỉ mới bắt đầu từ những năm 1970 trở lại đây nhưng đã khẳng định được vai trò to lớn của tuyến trùng về cả phương diện tuyến trùng gây hại (tuyến trùng thực vật) và có lợi (tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng, tuyến trùng sống tự do trong đất, nước) trong nông nghiệp và sinh thái môi trường ở nước ta [3]. 2.2.3 Ý nghĩa của tuyến trùng thực vật [3] Tuyến trùng ký sinh thực vật có ý nghĩa quan trọng trong nông nghiệp, chúng đã được ghi nhận như một nhóm gây hại quan trọng đối với thực vật trong lĩnh vực sâu bệnh hại. Chúng còn được ghi nhận như các cơ thể sống có vai trò quan trọng trong đất và nước cũng như hệ sinh thái nông nghiệp nói chung. Việc nghiên cứu và phân loại tuyến trùng thực vật để biết được thành phần loài tuyến trùng và xác định các loài ký sinh gây hại quan trọng liên quan đến các dấu hiệu gây hại, trên cơ sở điều tra và phân loại để biết được phân bố và vai trò của các loài tuyến trùng đối với cây trồng. Ngoài ý nghĩa khoa học, các nghiên cứu trên còn ý gnhĩa thực tiễn lớn trong việc tìm các giải pháp phòng trừ, hạn chế tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra đối với sản xuất nông, lâm nghiệp [3]. 2.2.4 Phân loại tuyến trùng thực vật [3, 4] Tuyến trùng ký sinh thực vật là nhóm sinh thái tuyến trùng thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật đang phát triển. Nhóm này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác như: thường có kích thước hiển vi; phần miệng có cấu tạo kim hút chuyên hóa để châm chích mô thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyên hóa là đặc biệt quan trọng nhất [3]. Theo động vật chí Việt Nam, dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ khác nhau [4] SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật. Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa. Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus. Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới. 2.2.5 Đặc điểm cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật [3, 9, 36] Tuyến trùng ký sinh thực vật thường có kích thước nhỏ, dài 0,2-1mm, chiều rộng thân không đồng đều theo chiều dài cơ thể. Hình dáng của chúng liên quan chặt chẽ với đặc tính sinh sống và cây ký chủ nên chúng có hình dạng đa dạng như: quả lê, quả chanh, hình cầu, hình tròn, hình giọt nước nhỏ giọt. Chiều rộng thân từ 1520µm, có thể rộng 250-550µm hoặc hơn nữa. Tuyến trùng có màu trắng trong nên có thể quan sát chúng dưới kính hiển vi một cách dễ dàng cả cấu tạo trong và ngoài. Các loài tuyến trùng sống trên lá có hình sợi chỉ nằm trong các gian bào của tế bào thực vật. Loại phá hủy mô tế bào thì có dạng là hình trụ, hình thoi sống ở trong đất [9]. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU Tylenchulus (hình quả lê) Meloidogyne (hình cầu/bầu) Hirschmanniella (hình giun dài) Helicotelynchus (hình giun xoắn) Pratylenchus (hình giun) Heterodera (hình qủa chanh) Hình 2.2 Hình ảnh về nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật [36] Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, mình và đuôi. Phần đầu còn được gọi là vùng môi. Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhô lên, hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt. Phần đuôi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. Bao bọc toàn bộ cơ thể tuyến trùng là vỏ cutin tương đối bền và có thể co giãn được. Trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, hệ sinh dục, hệ bài tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Phía trong gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma. Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mô SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU và nó được tạo áp lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên. Áp lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng vận động được. Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ sinh sản. Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học [3]. Tuyến trùng phần lớn là sinh sản hữu tính, với cấu tạo của bộ máy sinh dục rất phát triển nên khả năng sinh sản của chúng cũng rất lớn. Tỷ lệ đực cái trong quá trình sinh sản hữu tính phụ thuộc nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng nhiều tới quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới đực cái (loài Meloidogyne spp.; Globodera rostochiensis; Heterodera avenae). Tuyến trùng Heterodera Schachtii và Meloidogyne javanica sống và phát triển trong cây thiếu đạm thì con đực hình thành nhiều hơn con cái so với cây bón đủ phân. Tuyến trùng các loài Meloidogyne spp. tăng khi bón ít kali và dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh từ tuyến trùng con tuổi 2 có thể phát triển thành tuyến trùng trưởng thành vừa có cơ quan sinh dục cái lại vừa có cơ quan sinh dục đực [3]. Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và phát triển trong tế bào trứng. Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với số các nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào trứng. Trứng sau khi thụ tinh phát triển trong túi trứng (loài Meloidogyne spp.), một số khác nằm trong cơ thể mẹ (loài Heterodera spp.), vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại cảnh phù hợp. Tuyến trùng non tuổi 1 là giai đoạn cuối cùng của quá trình phân chia nhân và phát triển trong vỏ tế bào trứng. Số lượng trứng trong một cơ thể mẹ nở được bao nhiêu phụ thuộc hoàn toàn vô sự thụ tinh của trứng trong túi trứng. Tùy thuộc vô nhóm sinh thái khác nhau và điều kiện sinh thái mà sự thụ tinh của tuyến trùng thực vật cũng khác nhau, các loài trong bộ Tylenchida đẻ trứng với số lượng khác nhau: loài Anguina đẻ 2.500 trứng (A. tritici), nhóm Meloidogyne spp. đẻ 2882 trứng [9]. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên tuyến trùng thực vật [3] Các yếu tố không sinh học Các yếu tố sinh học A. Địa hình A.Vật chủ 1. Độ cao 1.Thích hợp 2. Độ dốc 2. Điểm sinh dưỡng có sẵn. 3. Độ phơi sáng 4. Tính chất bề mặt B. Môi trường đất B. Tuyến trùng ký sinh 1. Vòng đời 2. Hệ số sinh sản 1. Độ ẩm 3. Cơ chế tồn tại Lượng mưa 4. Tỷ lệ giới tính Lượng tuyết 5. Khả năng nhiễm Sương C. Hoạt động của con người Thoái nước bề mặt 1. Chế độ canh tác Nội tiêu Chế độ tưới nước 2. Nhiệt độ Luân, xen canh Nhiệt độ trung bình Các giống chống chịu Nhiệt độ quá ngưỡng Thuốc hóa học. Thời gian quá ngưỡng 2. Chế độ duy trì bảo tồn Tổng nhiệt D. Các sinh vật khác 3. Không khí 1. Nấm 4. Độ xốp của đất 2. Vi khuẩn 5. Cấu trúc đất 3. Tuyến trùng 6. pH và phân vô cơ 4. Virus và các loài liên quan 7. Phân hữu cơ 5. Côn trùng và ve bét 8. Độ thoáng khí 6.Các động vật khác 2.4 Quan hệ tương hỗ giữa tuyến trùng với các vi sinh vật khác [3] Atkinson (1892) có lẽ là người đầu tiên phát hiện ra bệnh héo rũ do nấm trên cây bông là trầm trọng hơn khi có mặt của tuyến trùng Meloidogyne spp. so với khi không có mặt của tuyến trùng. Phổ tác động tương hỗ giữa tuyến trùng ký sinh ở SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU thực vật và các vi sinh vật khác ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật đã được tổng kết một cách bao quát (Huang ,1987; Smith, 1987; Hussey và McGuire, 1987; Lamberti và Roca, 1987; Powell, 1979, Sikora và Carter, 1987). Các vi sinh vật khác có liên quan bao gồm nấm, vi khuẩn và virus. Ngoài ra tuyến trùng còn có tác động qua lại với các nhóm động vật khác lớn hơn như giun đất, ve bét, côn trùng và động vật gặm nhấm. Tuyến trùng cũng có thể liên quan đến những bệnh được gây ra bởi nấm (Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Cylindrocladium crotalariae, Verticillium spp. và những loài khác) có nghĩa là nó có khả năng xâm nhập vào rễ cũng như gây bệnh trên lá với sự tác động của tuyến trùng (Nicholson và cộng sự, 1985). Các công trình được nghiên cứu tương đối sớm cho đến gần đây nhất đã được tiến hành trên nhóm tuyến trùng Meloidogyne spp.. Tuyến trùng ký sinh còn có thể dẫn đến hoặc là yếu tố bắt buộc cho sự phát triển của một bệnh nào đó được gây ra bởi vi khuẩn. Tuyến trùng có thể là môi giới mang truyền vi khuẩn gây bệnh cho thực vật do nhiễm vi khuẩn trên bề mặt, các bướu rễ được tạo thành do tuyến trùng có thể trở thành độc tố chỉ khi nó nhiễm vi khuẩn [3]. 2.5 Tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp. Phân loại: Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Giống: Meloidogyne Tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne được Berkeley phát hiện đầu tiên vào năm 1855 trên cây dưa chuột ở Anh [9]. 2.5.1 Đặc điểm chuẩn loại [4] Con cái trưởng thành hình quả lê hoặc hình cầu, nằm sâu trong mô rễ. Đường kính cơ thể 0,5–0,7 mm với cổ cân đối, vulva ở phía sau gần hậu môn. Vỏ cutin màu SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Stylet ngắn, kitin hóa trung bình, hai nhánh sinh dục được cuộn gấp lại. Trứng được đẻ bên ngoài cơ thể vào khối gelatin. Con đực hình giun sống tự do trong đất, dài 1-2 mm, cơ thể thường ở dạng xoắn vặn 1800 quanh trục cơ thể khi cố định trong dung dịch nóng. Stylet khỏe, vùng đầu kitin hóa mạnh, đôi ngắn, hình cầu, gai giao cấu phát triển mạnh. Ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 (IJ2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm. Stylet và vùng đầu kitin hóa yếu. đuôi hình chóp. 2.5.2 Đặc điểm sinh học [4] Hầu hết các loài của giống này trứng được giữ lại bên trong túi gelatin nằm ngoài cơ thể phình rộng của con cái. Khi nở thành ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 (IJ2) ở trong đất. IJ2 xâm nhập vào rễ vật chủ và tạo nên các tế bào khổng lồ phục vụ cho việc dinh dưỡng. Các tế bào vỏ rễ tạo thành bướu rễ (nốt sần).Tuyến trùng bướu rễ (root – knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất cho nền nông nghiệp trên toàn thế giới. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh ở hầu hết các cây trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau. Chúng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Cho đến nay có khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại nghiêm trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng khắp ở các vùng nông nghiệp trên thế giới [3, 4]. Tuyến trùng bướu rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây chủ, nhiệt độ, và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm,…có ảnh hưởng lớn đến sự sống sót, khả năng sinh sản, số thế hệ trong năm và hiệu quả gây hại đối với thực vật do tuyến trùng gây ra [3]. Đã xác định 5 loài ký sinh ở cây trồng Việt Nam: M. arenaria phân bố ở Sơn La, Hải Phòng, Nam Hà, Thái Bình, M. cynariensis phân bố ở Lâm Đồng, M. graminicola phân bố ở Nghệ An, M. incognita phân bố ở khắp nơi, và M. javanica phân bố ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Lâm Đồng [4]. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU M. javanica M. hapla M. arenaria M. incognita Hình 2.3 Hình ảnh về tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne [38] - M. incognita Kofoid – White 1949: là loài phổ biến ở vùng nhiệt đới, đây cũng là loài ký sinh gây hại phổ biến nhất trên cây trồng Việt Nam. Theo Nguyễn Chung Tú (1989), Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) loài này ký sinh trên 100 loài thuộc 76 họ thực vật, trong đó gây hại hầu hết các loài cây trồng và cây dại như: dưa chuột, cà chua, thuốc lá, hồ tiêu, ớt, cà phê, chuối, dứa, cây dược liệu như: bạch truật, ngưu tất, bạch chỉ, các cây họ bầu, bí, hoa (cẩm chướng, mào gà,…), su hào, cải bắp,… - M. javanica Chitwood 1949: là loài phổ biến thứ 2 sau loài trên và có dải phân bố tương tự, phổ biến chủ yếu ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, gây hại chủ yếu trên mía, khoai tây, cà rốt, cải bắp, đậu đỗ, củ cải, chuối, cà chua, bí đỏ, thuốc lá,… Ở Việt Nam, loài này ký sinh tương đối phổ biến sau loài M. incognita. - M. arenaria Chitwood 1949: phổ biến trong nhiều nước nhất là vùng nóng ẩm, gây hại trên nhiều loài cây nhất là trên cây lạc và đậu tương, cà chua, thuốc lá, mía, khoai tây, rau dền., … - M. halpa Chitwood 1949: chủ yếu phổ biến ở vùng có khí hậu lạnh, gây hại trên nhiều loài cây: các loại cây họ cà, đậu đỗ, hướng dương, đặc biệt hại nặng trên dâu tây, nho, đào. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 19 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - GVHD: Th.S DƯƠNG ĐỨC HIẾU M. graminicola: ký sinh gây hại chính cho lúa cạn ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ). Ở Việt Nam loài này ký sinh gây hại tương đối phổ biến trên lúa cạn ở đồng bằng sông Cửu Long. - M. exigua: ký sinh và gây hại chính ở các vùng cà phê ở Nam Mỹ và Trung - M. chitwoodi: ký sinh chủ yếu ở khoai tây và phân bố hạn chế ở Bắc Âu và Mỹ. Đông Nam Châu Mỹ - Thái Bình Dương [3, 4].  Đặc điểm chung của bệnh tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp. Chúng ký sinh trong rễ cây chủ, khi xâm nhập vào bên trong tế bào rễ (IJ2) tuyến trùng không di chuyển đi các bộ phận khác, tiết ra các men và các chất kích thích sinh trưởng làm cho tế bào rễ sinh sản quá độ, phình to, tạo ra các u bướu to nhỏ khác nhau thành từng chuỗi ở trên rễ. Các giai đoạn phát triển từ tuyến trùng non, phân hóa giới tính thành tuyến trùng trưởng thành, tiến hành bên trong u sưng. Trong u bướu có từ 1 - 10 tuyến trùng cái hình quả chanh. Cây bệnh bị cằn còi, vàng úa, chết héo, biến dạng, rễ thối hỏng. Sau khi trứng nở, IJ2 có thể từ trong nốt sần giải phóng vào đất, gặp điều kiện thuận lợi, chúng di chuyển xâm nhập, lây lan trên nhiều rễ cây trong ruộng. Chu kỳ phát triển (vòng đời) phụ thuộc vào nhiệt độ các tháng trong năm và phụ thuộc cây ký chủ. Ở nhiệt độ 280C vòng đời của loài M. incognita là 30 ngày trên cây thuốc lá. Ở nhiệt độ thấp 200C vòng đời của chúng kéo dài trong khoảng 57 – 59 ngày. Mỗi con tuyến trùng cái tạo ra bọc trứng có thể tới 2.000 trứng, trung bình nở ra 200-600 tuyến trùng non tuổi 1. Trứng và tuyến trùng non có thể tồn tại ở trong đất hàng năm nếu gặp điều kiện thuận lợi và cây ký chủ phù hợp. Tuyến trùng gây hại nặng ở các loại đất cát pha, thịt nhẹ, trồng cạn liên tục nhiều năm. Mật độ tuyến trùng nhiều ở tầng đất canh tác với độ sâu 6 - 15cm, ẩm độ khoảng 60%. Trong điều kiện khô hạn quá hoặc ngập nước lâu dài tuyến trùng kém phát triển, số lượng giảm thấp rõ rệt. Tuyến trùng bướu rễ có thể tạo vết thương thúc đẩy bệnh nấm, vi khuẩn phát triển [9]. SVTH: VŨ THỊ MỸ LINH Trang 20