Tài liệu Hoạt tính của protease kim loại (mmp 2, mmp 9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn với những ý kiến đóng góp quý báu của TS. Đỗ Minh Hà trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. BS. Phạm Mạnh Cường cùng Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 và đồng cảm ơn tới Khoa Xét nghiệm và Sàng lọc máu Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương vì đã cung cấp mẫu những mẫu bệnh phẩm và đối chứng quý giá trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về trong suốt quá trình làm luận văn này. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 02 năm 2017 Học viên Hoàng Ngọc Anh MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chương 1 - TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng .................................................3 1.1.1. Ung thư đại trực tràng .................................................................3 1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ.4 1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng ..................................................6 1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật...............................................................9 1.2. Tổng quan về các MMP ...................................................................9 1.2.1. Matrix Metalloproteinases ..........................................................9 1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) ...........................12 1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase ..................................13 1.3. Chương 2 - Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng .............16 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................21 2.1. Nguyên liệu ....................................................................................21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................21 2.1.2. Thiết bị ......................................................................................21 2.1.3. Hóa chất ....................................................................................21 2.2. Phương pháp ..................................................................................22 2.2.1. Tách chiết protein tổng số từ mẫu mô ......................................23 2.2.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford ........24 2.2.3. Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP trên gel polyacrylamide .................................................................................................25 2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di bằng phần mềm Image J ....27 2.2.5. Phân tích, đánh giá kết quả .......................................................28 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................29 3.1. Xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có SDS có bổ sung cơ chất gelatin ..............................................................................................29 3.2. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng....................................................................33 3.2.1. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo vị trí mô ........................33 3.2.2. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương .................36 3.3. Hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng....................................................................40 KẾT LUẬN ...............................................................................................................46 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................48 PHỤ LỤC .................................................................................................................... i BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persunfate CA Kháng nguyên ung thư (Cancer antigen) CBB Coomassie Brilliant Blue CEA Kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcinoembryonic antigen) Cs Cộng sự ECM Chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix) ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) MMP Proteinase kim loại trong chất nền ngoại bào (Matrix Metalloproteinase) OD Mật độ quang (Optical density) RT-PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) TIMP Chất ức chế của MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase) TNM Kích thước khối u - Hạch vùng - Di căn (Tumor - Node - Metastasis) UTĐTT Ung thư đại trực tràng UTVMH Ung thư vòm mũi họng i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm .............................9 Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính ...........10 Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP ....................................................................14 Bảng 2.1. Thành phần bản gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung cơ chất ......26 Bảng 3.1. Tần suất biểu hiện hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu mô và huyết tương của 37 bệnh nhân UTĐTT ....................................................................30 Bảng 3.2. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong mô T, LCU và U của bệnh nhân UTĐTT, n=37 ..........................................................................................33 Bảng 3.3. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 trong huyết tương của 37 bệnh nhân UTĐTT và đối chứng ..............................................................................37 Bảng 3.4. Sự khác biệt hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và -9 tại mô u so với T theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT .......................................41 ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng .................................................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP .....................................................................11 Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP ..........................................................................13 Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu MMP-2 và MMP-9 .......................23 Hình 3.1. Hình ảnh điện di xác định hoạt tính enzyme trên bản gel polyacrylamide có SDS, có gelatin ở mẫu mô (T, LCU và U) và huyết tương (HT-1, HT+1, HT+3 và HT+7) của bệnh nhân #10, và mẫu đối chứng. ....................................................29 Hình 3.2. Hoạt tính gelatinase trong mẫu mô của một số bệnh nhân UTĐTT .........31 Hình 3.3. Biểu diễn băng hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 trong các mẫu huyết tương của một số bệnh nhân, đối chứng và giá trị chuẩn hóa của chúng .................32 Hình 3.4. Hoạt độ chuẩn hóa của MMP-2 và MMP-9 ở các mẫu huyết tương của bệnh nhân UTĐTT ....................................................................................................38 Hình 3.5. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-9 giữa U-T của bệnh nhân UTĐTT theo mức độ xâm lấn và độ biệt hóa ...........................................................42 Hình 3.6. Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa của proMMP-2 giữa HT+7 so với HT-1 và proMMP-9 giữa HT+3 so với HT-1 theo mức độ xâm lấn và hạch di căn tương ứng của bệnh nhân UTĐTT..............................................................................................43 iii Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh MỞ ĐẦU Theo báo cáo của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Thế giới (International agency for research on cancer, IARC), năm 2012, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư phổ biến thứ 4 trên toàn thế giới và đứng thứ nhất trong các ung thư đường tiêu hóa. Tại Việt Nam, dựa trên một số công bố từ năm 2005-2010 cho thấy: UTĐTT là loại ung thư có tỷ lệ mắc đứng thứ 5 về số ca mắc mới (8768 ca) và thứ 4 về số ca tử vong (5976 ca) [67]. Hiện nay, các phương pháp đang được áp dụng để chẩn đoán UTĐTT như: chẩn đoán hình ảnh, chẩn đoán nội soi, chẩn đoán tế bào học, chẩn đoán mô bệnh học thường chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, gây khó khăn cho việc điều trị. Một số chỉ thị sinh học như kháng nguyên ung thư (cancer antigen, CA), kháng nguyên ung thư phôi thai (carcinoembryonic antigen, CEA) chỉ dừng lại ở tiên lượng sau điều trị bằng phẫu thuật [19, 7]. Nhu cầu đặt ra là phải tiếp tục tìm kiếm các dấu hiệu sinh học giúp chẩn đoán có hiệu quả cũng như theo dõi điều trị bệnh trong UTĐTT. Matrix metalloproteinase (MMP) được biết đến là nhóm enzyme tham gia vào các quá trình phát triển và xâm lấn của khối u, đặc biệt là MMP-2, MMP-9 và dạng tiền hoạt động của chúng. Các enzyme này đã được nhiều công bố trên thế giới chứng minh có biểu hiện khác biệt liên quan đến sự tiến triển khối u của bệnh UTĐTT. Vì vậy, đề tài “Hoạt tính của protease kim loại (MMP-2, MMP-9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật” được thực hiện nhằm mục tiêu: 1. Đánh giá hoạt tính và mức độ biểu hiện hoạt tính của MMP-2, MMP-9 trong mô và huyết tương của bệnh nhân UTĐTT trước và sau phẫu thuật. 2. Đánh giá mối liên quan giữa hoạt độ của MMP-2 và MMP-9 với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT. 1 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng Ung thư là nhóm bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một cách nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể. Từ đó, các tế bào bất thường có thể xâm lấn, chèn ép vào các tế bào, mô lân cận. Ngoài ra, chúng có thể tách rời và di chuyển đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào mạch máu hoặc hệ bạch huyết. Hơn thế nữa, sự xâm lấn chèn ép của những tế bào ung thư dẫn tới sự rối loạn các chức năng vốn của cơ quan mà chúng có mặt [68]. Đại trực tràng bao gồm đại tràng lên, đại tràng góc gan, đại tràng ngang, đại tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng (hình 1.1). Chúng chiếm phần lớn ruột già – phần cuối cùng của hệ tiêu hóa, đóng vai trò hấp thu nước và các chất dinh dưỡng ở phần đầu đại tràng và dần chuyển thành các chất cặn bã để đào thải khỏi cơ thể tại trực tràng. Hình 1.1. Cấu tạo đại trực tràng [68] 1.1.1. Ung thư đại trực tràng UTĐTT hay còn gọi ung thư ruột già là thuật ngữ để chỉ các loại ung thư khởi phát có nguồn gốc từ bất kỳ vị trí nào thuộc đoạn đại tràng và trực tràng. UTĐTT thường bắt đầu với sự phát triển của polyp trong lòng đại trực tràng và theo thời gian một số polyp có thể sẽ trở thành ung thư [68]. 3 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization, WHO) về tình hình ung thư năm 2012, trên thế giới ước tính có 14,09 triệu ca mắc mới ung thư và 8,20 triệu ca tử vong do ung thư, trong đó, số ca mắc mới UTĐTT là 1,36 triệu (chiếm 9,7%) đứng vị trí thứ ba sau ung thư phổi (vị trí thứ nhất) và ung thư vú (vị trí thứ hai) và gần 0,7 triệu ca tử vong do UTĐTT (chiếm 8,5%). Cũng theo báo cáo này, ở Việt Nam, có khoảng 125 nghìn ca mắc mới và 94 nghìn ca tử vong do ung thư nói chung, trong đó, tính riêng ở UTĐTT có 8,7 nghìn ca mắc mới (chiếm 7%) và 5,9 nghìn ca tử vong (chiếm 8%). Xét trên cả số lượng ca mắc mới và số ca tử vong, UTĐTT đứng thứ 5 trong các dạng ung thư tại Việt Nam [67]. 1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng và các yếu tố nguy cơ Có rất nhiều nguy cơ dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu tổng quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là: Yếu tố không di truyền Là các yếu tố như: thói quen ăn uống, hút thuốc lá, theo độ tuổi, bệnh tật, thể dục ,… Thói quen ăn uống: nhóm có nguy cơ cao phải đối mặt với UTĐTT thường sử dụng các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu, gan,…), các loại thịt chế biến (như xúc xích, thịt hun khói) và chế biến thực phẩm ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể tạo ra các chất làm tăng nguy cơ ung thư. Bên cạnh đó, sử dụng chế độ ăn thực dưỡng (rau, củ, quả, ngũ cốc,…) lại làm giảm nguy cơ UTĐTT [49, 24]. Thói quen vận động: những nhóm người năng vận động thể dục mỗi ngày có tỷ lệ mắc ung thư thấp hơn nhóm lười vận động [61, 29]. Thừa cân: tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ mắc UTĐTT [61, 12]. Hút thuốc: hầu hết mọi người biết rằng hút thuốc gây ra ung thư phổi, nhưng nhóm người hút thuốc trong thời gian dài có nguy cơ mắc UTĐTT nhiều hơn nhóm 4 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh không hút thuốc. Ngoài ra, hút thuốc cũng làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư khác [61, 9]. Sử dụng đồ uống chứa cồn: Có nghiên cứu dịch tễ cho thấy 15% số người mắc UTĐTT có cường độ sử dụng rượu, bia nhiều và nhóm ít sử dụng đồ uống có cồn thì nguy cơ thấp hơn nhóm sử dụng nhiều [61, 40]. Tiền sử bệnh lý: Những người có tiền sử mắc bệnh viêm loét đại tràng, bệnh Crohn và đái tháo đường tuýp 2 trong thời gian dài thường có nguy cơ cao mắc UTĐTT [54, 63]. Sai hỏng trong điều hòa và biểu hiện gen: các tế bào có thể tăng sinh không kiểm soát nếu có sai hỏng quá trình điều hòa và biểu hiện gen. Trong đó, những nhóm gen liên quan trực tiếp đến ung thư gồm: các gen tiền ung thư (protooncogenes), các gen ức chế khối u và các gen sửa chữa ADN [68]. Ngoài các yếu tố kể trên còn có các yếu tố nguy cơ khác như tuổi, giới tính, hay rối loạn trao đổi chất cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến UTĐTT. Yếu tố di truyền Khoảng 5-10% những ca mắc UTĐTT là có những biến đổi về gen được di truyền lại. Thông thường, những biến đổi này dẫn đến ung thư khi bệnh nhân còn trẻ. Hội chứng đa polyp trong gia đình (Familial adenomatous polyposis, FAP): Những người mắc FAP thường có hàng trăm hoặc hàng ngàn polyp trong ruột kết và trực tràng. Ung thư thường khởi phát ở một hoặc một vài polyp ở tuổi 20. Đến 40 tuổi, hầu hết những người bị rối loạn này sẽ bị ung thư nếu không được cắt bỏ đoạn đại tràng. Hội chứng FAP chiếm khoảng 1% trong UTĐTT [68]. Hội chứng Lynch (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) hay còn gọi UTĐTT không polyp di truyền: chiếm khoảng 3% đến 5% số ca mắc UTĐTT và thường mắc ung thư khi còn trẻ. Từ những biến đổi trong gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, hoặc EPCAM dẫn đến tăng nguy cơ phát triển hội chứng 5 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Lynch. Những người mắc hội chứng này cũng có thể có khối u, nhưng họ chỉ có một lượng nhỏ và không đến hàng trăm như trong hội chứng FAP. Nguy cơ UTĐTT ở những người bị tình trạng này có thể lên đến 80% [68]. Chủng tộc hay sắc tộc: một số nhóm chủng tộc như người Mỹ gốc Phi, người Do Thái gốc Đông Âu (Ashkenazi Do Thái) có nguy cơ UTĐTT cao hơn. Trong số những người Do Thái Ashkenazi, một số đột biến gen đã được tìm thấy dẫn đến tăng nguy cơ UTĐTT [35, 11]. 1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng Việc xác định giai đoạn của ung thư có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và tối ưu nhất cho bệnh nhân. Đồng thời, phân giai đoạn cụ thể cũng thuận lợi cho việc nghiên cứu, trao đổi thông tin giữa các trung tâm điều trị, so sánh và đánh giá các phương pháp điều trị với nhau. Hiện nay, hệ thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trên thế giới cho UTĐTT là hệ thống phân loại theo khối u, hạch lympho, di căn (Tumor-NodeMetastasis hay còn gọi là TNM); hệ thống Dukes và hệ thống phân loại theo mô bệnh học. Hệ thống phân giai đoạn TNM đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American Joint Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế (Union for International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được sửa đổi theo các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ thống phân loại AJCC phiên bản thứ 7 cho UTĐTT cụ thể như sau [4]: T cho biết về kích cỡ, mức độ xâm lấn vào thành ruột của khối u nguyên phát: - Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin; - Tis: Khối u tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc; - T1: Khối u đã phát triển và xâm lấn đến lớp hạ niêm mạc; 6 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ - Hoàng Ngọc Anh T2: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp hạ niêm mạc và xâm lấn đến lớp đệm cơ; - T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp đệm cơ và xâm lấn đến các lớp ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối u chưa xâm lấn đến các cơ quan và mô lân cận; - T4a: Khối u đã phát triển xuyên qua thanh mạc; - T4b: Khối u đã phát triển xuyên qua thành đại tràng, dính chặt hoặc xâm lấn các mô và cơ quan lân cận. N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch huyết: - Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết; - N0: Không có tế bào ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận; - N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận; - N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2-3 hạch bạch huyết kề cận; - N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các hạch bạch huyết nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết; - N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 đến 6 hạch bạch huyết kề - N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong 7 hạch bạch huyết kề cận trở lên. cận; M cho biết mức độ di căn của khối u: - M0: Không có tế bào di căn xa; - M1a: tế bào ung thư đã di căn đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch bạch huyết ở xa; 7 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ - Hoàng Ngọc Anh M1b: tế bào ung thư đã di căn đến ít nhất 1 cơ quan xa trở lên hoặc một nhóm các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã di căn đến các phần phúc mạc ở xa. Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Cuthbert Dukes người Anh phát minh ra vào năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT. Duke A: ung thư xâm lấn tới lớp cơ bị giới hạn ở thành trực tràng, chưa di căn hạch. Duke B: ung thư xâm lấn thanh mạc đến tổ chức xung quanh, chưa di căn hạch. Duke C: Có di căn hạch. Duke D: Có di căn xa. Ngoài cách phân giai đoạn theo TNM, UTĐTT còn được phân thành 5 giai đoạn, gồm: giai đoạn 0, I, II, III và IV. - Giai đoạn 0: khối u chỉ được tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của đại tràng hoặc trực tràng. - Giai đoạn I: khối u đã phát triển vào thành trong của đại tràng hoặc trực tràng. Khối u chưa phát triển vượt qua thành. - Giai đoạn II: khối u phát triển sâu hơn vào trong hoặc xuyên qua thành đại tràng hoặc trực tràng. Các tế bào ung thư có thể đã xâm lấn các mô lân cận nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết. - Giai đoạn III: tế bào ung thư đã di căn đến các hạch bạch huyết vùng lận cận nhưng chưa đến các bộ phận khác của cơ thể. - Giai đoạn IV: Tế bào ung thư đã lây lan sang các bộ phận khác của cơ thể, như gan hoặc phổi,… Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sau 5 năm được thể hiện ở bảng 1.1 8 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm [4, 69] Giai đoạn TNM Duke 0 TisN0M0 - I A IIA T1N0M0 T3N0M0 TNM IIB T4aN0M0 B IIC T4bN0M0 IIIA IIIC T1,2N1/1cM0 T N M T3,4aN 1/1cM0 T 4bN2aM0 T N M IVA T M1a M N IVB M1b IIIB Tỷ lệ sống sau 5 năm 87-92% 80-87% 49-63% 84-89% C 69-71% 53-58% D 11-12% 1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật Phẫu thuật là một phương pháp điều trị cơ bản không bị nhờn, cho phép loại bỏ các tổ chức ung thư. Nếu như bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và xác định được vị trí khu trú của tổ chức u thì phẫu thuật có thể loại bỏ tổ chức u triệt để. Tuy nhiên, những biến chứng không mong muốn vẫn tồn tại do phẫu thuật như tụ máu, chảy máu, nhiễm trùng tại ví trí phẫu thuật, bên cạnh đó, thuốc dùng trong quá trình gây mê và các thuốc giảm đau sau phẫu thuật cũng có những ảnh hưởng nhất định với bệnh nhân sau phẫu thuật [69]. Từ đó, dẫn đến các quá trình của cơ thể như hồi phục tổn thương, stress oxi-hóa [14, 46]. 1.2. Tổng quan về các MMP 1.2.1. Matrix Metalloproteinases Matrix Metalloproteinases (MMP) là một họ các enzyme có 1 nhân kim loại kẽm tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide nội phân tử giúp phân giải các chất nền ngoại bào (extracellular matrix, ECM) qua đó làm yếu đi các liên kết giữa tế bào - tế bào; tế bào - ECM [20]. Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm được 25 loại MMP khác nhau, trong đó, 24 loại cũng được tìm thấy trong cơ thể 9 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh con người, chúng được nhận dạng dựa vào các vùng chức năng cơ bản của các MMP và cơ chất của chúng (bảng 1.2) [33] Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính [33] Nhóm Tên Collagenases: MMP-1, -8, -13 Các Archetypal MMP Stromelysins: MMP-3, -10 Các loại khác: MMP-12, -19, -20, -27 Matrilysins MMP-7, -26 Gelatinases MMP-2, -9 Tiết: MMP-11, -21, -28 Furin – Hoạt hóa các MMP Xuyên màng loại 1: MMP-14, -15, -16, -24 Cơ chất ECM: collagens, gelatin, fibronectin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, pro-iL-8, pro-TNF, MMP khác, PAi, IGFBP ECM: collagens, gelatin, elastin, fbronectin, laminin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, các MMP, liên kết MMP/ TIMP, fibrinogen, plasminogen, antithrombin III, iGFBP ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin Non-ECM: fibrin, plasminogen, myelin basic protein ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin, integrins, … Non-ECM: các MMP khác, liên kết MMP/TIMP, fibrinogen, plasminogen. ECM: collagens, gelatin, elastin, fibronectin, … Non-ECM: pro-iL-1β, plasminogen, các MMP khác ECM: collagen IV, gelatin, laminin, fibronectin Non-ECM: casein, IGFBP ECM: collagens, gelatin, elastin, laminin, vitronectin Non-ECM: các MMP khác GPI-anchored: MMP-17, -25 Chưa biết Xuyên màng loại 2: MMP-23A, -23B Chưa biết Chú giải: ECM: chất nên ngoài bào, pro-IL: dạng tiền hoạt động của interleukin (proform of interleukin), pro-TNF: dạng tiền hoạt động của yếu tố hoại tử u (proform of tumor necrosis factor), PAI: ức chế nhân tố hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator inhibitor), IGFBP: protein kết hợp với yếu tố sinh trưởng tương tự insulin (insulin-like growth factor-binding protein), TIMP: Chất ức chế của MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase) 10 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP [18] Mặc dù có một vài khác biệt giữa các MMP nhưng về cấu trúc protein lại tương đồng khá nhiều (hình 1.2). Nhìn chung, tại đầu N của chúng đều chứa một đoạn ngắn peptide tín hiệu giúp xác định điểm đến trong quá trình bài tiết, nhưng chuỗi peptide tín hiệu sẽ được loại bỏ khi phân tử đi qua lưới nội chất. Các phần tiếp theo của các phân tử MMP gồm một vùng propeptide với khoảng 80 axit amin có chứa 1 motif bảo thủ PRCGXPD được biết đến như Switch - cysteine với vai trò khóa trung tâm hoạt động của phân tử và giữ cho chúng ở dạng tiền hoạt động. Phần tiếp theo của các MMP là vùng hoạt động gồm một chuỗi có 160-170 axit amin cuộn thành hình khối cầu có chứa trình tự bảo thủ khác là HEXXHXXGXXH và 2 phân tử kẽm tạo thành trung tâm hoạt động cho các enzyme. Hầu hết các MMP (trừ MMP-7, -23 và -26) đều có 1 vùng bản lề (hinge) với bản chất là 1 chuỗi chứa 1030 axit amin với chức năng làm cầu nối cho vùng hoạt động với đầu C của các MMP – vùng giống hemopexin. Vùng này có khoảng 200 axit amin được xem như vùng gắn chất ức chế của các MMP (các TIMP) [43]. Bên cạnh đó, đối với các loại 11 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh MMP màng (Membrane-type MMP, MT-MMP) có thể có thêm vùng bám màng glycosylphosphatidylinositol (GPI) gồm MMP-17 và -25 còn được gọi tương ứng là MT4- và MT6-MMP hoặc xuyên màng loại I với MMP-14, -15, -16, và -24, còn được gọi tương ứng là MT-1, -2, -3, và -5-MMP [52]. Ngoài các thành phần phổ biến nói trên, một số MMP có chứa một vài phần độc đáo khác. Ví dụ như fibronectin II giống như chèn vào trong vùng xúc tác chỉ được được tìm thấy trong MMP-2 và -9. Hay vùng bản lề của MMP-9 chứa 64 axit amin bị O-glycosyl hóa. Hơn nữa, trong phân tử MMP-23, các peptide tín hiệu được thay thế bởi vùng xuyên màng loại II, trong khi đó vùng giống hemopexin được thay thế bằng một đoạn giàu cysteine và tạo thành một vùng giống với immunoglobulin. Cuối cùng, tất cả các MMP GPI và MMP tiết (MMP-11, -21 và 28) đều có một motif R(X/R)KR giữa vùng tiền hoạt động và hoạt động. Trình tự này được nhận diện và cắt bỏ bởi furin, các proteinase serine nội bào, trong đó loại bỏ các vùng pro từ các phân tử MMP và dẫn đến kích hoạt nó [18]. (hình 1.2) 1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) Các loại enzyme MMP đều được tiết ra dưới dạng tiền hoạt động hay còn gọi là zymogen hay là pro-MMP. Do đó, chúng cần phải được hoạt hóa trước khi thực hiện chức năng phân cắt chất nền ngoại bào. Trong cơ thể, các MMP được hoạt hóa từ dạng tiền hoạt động sang hoạt động nhờ các endoproteinase. Sự hoạt hóa các MMP có thể được thực hiện bởi nhiều enzyme khác nhau trong chất nền ngoại bào như protease nhóm cysteine, serine và aspartate hoặc MMP khác. Ngoài ra, quá trình hoạt hóa nhiều loại MMP cũng được xử lý ngay trong tế bào bởi furin, các subtilisin như serine proteinase, ở lưới nội chất và thể Golgi. Mặt khác, các MMP có thể được hoạt hóa bởi tác nhân vật lý và hóa học như amino phenylmercuric acetate (APMA), sodium dedocyl sunfate (SDS), pH thấp hay xử lý bằng nhiệt [33]. Quá trình hoạt hóa MMP như sau: vùng pro-peptide của các MMP có cystein ở vị trí 73 tạo ổn định cho dạng pro-enzyme không hoạt động. Trong vùng xúc tác, Zn2+ được liên kết với cystein ở vị trí 73. Khi liên kết này còn nguyên, MMP không 12 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm