Tài liệu Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactic ứng dụng trong chế biến sản phẩm lên men truyền thống

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. iv LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... v Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ vi Danh mục các bảng ......................................................................................... vii Danh mục các hình vẽ và đồ thị ..................................................................... viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 2 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS PLANTARUM B33..... 2 1.1.1. Đặc điểm của chủng Lactobacillus plantarum b33 .......................... 2 1.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic ..... ....................................................................................................... 3 1.1.3. Ứng dụng chủng L.plantarum b33 .................................................. 3 1.2. QUÁ TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC ......................... 4 1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo chế phẩm vi khuẩn lactic .. 4 1.2.1.1. Phƣơng pháp sấy ........................................................................ 4 1.2.1.2. Chất mang .................................................................................. 8 1.2.2. Các nghiên cứu tạo chế phẩm L.plantarum trong và ngoài nƣớc ... 13 1.2.3. Ứng dụng của chế phẩm vi khuẩn lactic ....................................... 15 1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT NEM CHUA .............................................. 16 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 18 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất, môi trƣờng và thiết bị ................................................... 18 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 19 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh ..................................................................... 19 2.2.1.1. Hoạt hoá, làm sạch và giữ giống ............................................... 19 2.2.1.2. Xác định lƣợng tế bào sống theo phƣơng pháp Korch............... 19 2.2.1.3. Quan sát hình thái tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm Gram ....... 20 2.2.1.4. Phƣơng pháp nuôi cấy tạo sinh khối ......................................... 21 i 2.2.2. Phƣơng pháp hoá lý ...................................................................... 21 2.2.2.1. Xác định pH bằng máy đo pH .................................................. 21 2.2.2.2. Xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đo OD (Optical Density)................................................................... 21 2.2.2.3. Xác định khả năng sinh axit lactic ............................................ 22 2.2.2.4. Xác định khả năng kháng khuẩn ............................................... 23 2.2.2.5. Xác định sinh khối vi khuẩn lactic ............................................ 24 2.2.2.6. Xác định độ ẩm chế phẩm ........................................................ 24 2.2.2.7. Xác định tỷ lệ sống sót của vi khuẩn L.plantarum b33 trong chế phẩm ................................................................................................. 25 2.2.3. Quy trình tạo chế phẩm vi khuẩn L.plantarum b33 ....................... 25 3.1. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG TẠO SINH KHỐI CHỦNG L.PLANTARUM b33 ............................................................................................................. 27 3.1.1. Kiểm tra đặc tính chủng L.plantarum b33 ..................................... 27 3.1.1.1. Hình thái vi khuẩn L.plantarum b33 ......................................... 27 3.1.1.2. Xác định khả năng sinh trƣởng của L.plantarum b33 ................ 28 3.1.1.3. Khả năng sinh axit lactic .......................................................... 29 3.1.1.4. Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh ........................... 29 3.1.2. Xác định khả năng tạo sinh khối của chủng L.plantarum b33 .......... 30 3.2. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC .... ............................................................................................................. 31 3.2.1. Ảnh hƣởng của loại chất mang đến quá trình tạo chế phẩm .......... 32 3.2.1.1. Ảnh hƣởng của maltodextrin .................................................... 32 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của trehaloza .......................................................... 33 3.2.1.3. Ảnh hƣởng kết hợp hai chất mang maltodextrin và trehaloza ... 35 3.2.2. Kiểm tra đặc tính chủng L.plantarum b33 trong chế phẩm ............ 36 3.2.2.1. Xác định đặc điểm hình thái của chủng trong chế phẩm ........... 36 3.2.2.2. Khả năng sinh axit lactic của chủng trong chế phẩm................. 37 3.2.2.3. Khả năng kháng khuẩn của chủng trong chế phẩm ................... 38 ii 3.3. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN BẢO QUẢN CHẾ PHẨM ............................ 39 3.3.1. Hiệu quả bảo quản chế phẩm khi phối trộn chất độn vào chế phẩm sau sấy ..................................................................................................... 40 3.3.2. Hiệu quả bảo quản chế phẩm sau khi phối trộn chất độn vào chế phẩm và bảo quản chế phẩm trong các bao bì khác nhau .............................. 42 3.4. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM TRONG LÊN MEN NEM CHUA.................... 43 1. Kết luận ................................................................................................ 45 2. Kiến nghị .............................................................................................. 46 Ứng dụng các kết qủa nghiên cứu của luận văn vào thực tiễnTÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 47 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu của luận văn này là hoàn toàn có thật, do chính bản thân tôi tổ chức thí nghiệm và nghiên cứu theo sự hƣớng dẫn của PGS.TS.Lê Thanh Mai. Các số liệu tham khảo từ các tài liệu đều đƣợc liệt kê ở phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012 Ngƣời thực hiện Trịnh Thị Thảo iv LỜI CẢM ƠN Luận văn này là kết quả của một thời gian dài nghiên cứu và làm việc để áp dụng những kiến thức đã học vào thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của PGS.TS. Lê Thanh Mai, sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội. Với tình cảm chân thành, ngƣời viết xin gửi lời cảm ơn đến: - PGS.TS. Lê Thanh Mai là ngƣời hƣớ+97 ng dẫn khoa học đã rất tận tình hƣớng dẫn và cho những lời khuyên sâu sắc không những giúp tôi hoàn thành luận văn mà còn truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về nghề nghiệp. - Các thầy cô giáo của trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt hai năm học để tôi có đƣợc những kiến thức ứng dụng trong công tác và là cơ sở thực hiện luận văn này. - Quý thầy cô đã dành thời gian quý báu để đọc và phản biện luận văn này, xin cảm ơn những ý kiến nhận xét sâu sắc của quý thầy cô. Mặc dù đã rất cố gắng nhƣng do thời gian có hạn, kinh nghiệm và trình độ bản thân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn luận văn không tránh khỏi những sai sót, tác giả rất mong nhận đƣợc những ý kiến góp ý của các thầy cô và các bạn đồng nghiệp để luận văn đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 09 năm 2012 Học viên v Danh mục các chữ viết tắt MD TH E.coli L.plantarum b33 MSK OD Cfu MRS MPA NB Maltodextrin Trehaloza Escherichia coli Lactobacillus plantarum b33 Môi trƣờng nuôi cấy tạo sinh khối Optical density Clony forming unit Deman Rogosa Sharpe Meat peptone agar Nutrient broth vi Danh mục các bảng Trang Bảng 1.1:Các phƣơng pháp sấy phổ biến hiện nay…………………………..5 Bảng 1.2: Thành phần nguyên liệu sản xuất nem chua………………………16 Bảng 3.1: Lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho nuôi cấy tạo sinh khối vi khuẩn lactic……………………………………………………………..............31 Bảng 3.2: So sánh đặc điểm hình thái L.plantarum b33 trƣớc và sau sấy đông khô…………………………………………………………………….............…36 Bảng 3.3:Các tính chất cảm quan của nem chua…...………………………...44 vii Danh mục các hình vẽ và đồ thị Trang Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn các giai đoạn của quá trình sấy đông khô …….7 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của maltodextrin …………………………..10 Hình 1.3:Cấu trúc của trehaloza …………………………………………13 Sơ đồ 1.1:Quy trình sản xuất nem chua truyền thống…………………….17 Sơ đồ 2.1: Xác định khả năng kháng khuẩn của L.plantarum b33 …….23 Sơ đồ 2.2:Quy trình tạo chế phẩm vi khuẩn L.plantarum b33…………...26 Hình 3.1:Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn L.plantarum b33……………………………………………………………………………..27 Hình 3.2: Khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn L.plantarum b33 theo thời gian…………………………………………………………………………….28 Hình 3.3: Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn lactic………………..29 Hình 3.4: Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn L.plantarum b33…………………………………………………………………………...30 Hình 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ maltodextrin đến tỷ lệ tế bào sống sót trong quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm……………………………….33 Hình 3.6: Ảnh hƣởng của nồng độ trehaloza đến tỷ lệ tế bào sống sót trong quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm………………………………………34 Hình 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ trehaloza và maltodextrin đến quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm………………………………………………….35 Hình 3.8: Khả năng kháng Staphylococus aureus của vi khuẩn L.plantarum b33 ……………………………………………………………………….38 Hình 3.9: Xác định khả năng kháng E.coli của chế phẩm L.plantarum b33 sau quá trình sấy đông khô…..………………………………………………39 viii Hình 3.10: Ảnh hƣởng của các loại chất độn khác nhau lên quá trình bảo quản khi sử dụng bao bì túi thiếc……………………………………………41 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của chế phẩm khi đƣợc bảo quản trong lọ đông khô……………………………………………………………………………..42 Hình 3.12: Sự biến đổi số lƣợng tế bào vi khuẩn L.plantarum b33 trong nem chua theo thời gian……………………………………………………...44 ix MỞ ĐẦU Từ ngàn đời xƣa, cha ông ta đã biết dự trữ thực phẩm để sử dụng lâu dài. Phƣơng pháp dự trữ không chỉ đơn thuần là phơi khô hay ƣớp muối mà còn biết muối chua (lên men). Quá trình muối chua chỉ đƣợc chú ý và quan sát rất đơn giản nhƣ biến đổi màu sắc, mùi vị hay tuổi thọ của sản phẩm đƣợc dự trữ. Năm 1857 Louis Pasteur phát hiện ra vi khuẩn lactic có trong sữa chua thì loài ngƣời mới bƣớc đầu hiểu biết thực sự quá trình lên men. Ngày nay, các sản phẩm lên men truyền thống không chỉ dừng lại ở lên men tự nhiên mà còn cần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Tại Việt Nam, có rất nhiều sản phẩm nhƣ vậy nhƣ: nem chua, tôm chua, dƣa chua, cà muối, tƣơng… Trong các sản phẩm này, có lẽ nem chua là phổ biển nhất trong các sản phẩm lên men truyền thống của nƣớc ta đƣợc nhiều bạn bè trên thế giới biết đến. Tuy nhiên, quá trình sản xuất nem chua không gia nhiệt, lên men diễn ra bởi các vi sinh vật tự nhiên, nguyên liệu sản xuất lại giàu dinh dƣỡng, độ ẩm lại cao. Cho nên, quá trình lên men đã tạo điều kiện thích hợp cho hệ vi sinh vật gây bệnh phát triển. Vì vậy, chất lƣợng nem chua thƣờng không đồng đều và không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Vậy làm thế nào để nem chua không chỉ có chất lƣợng đồng đều, giữ đƣợc hƣơng vị thơm ngon truyền thống, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm mà vẫn kéo dài thời gian sử dụng. Để giải quyết vấn đề này, trong những năm gần đây đã có không ít các nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic làm chủng khởi động cho quá trình lên men sản xuất nem chua công nghiệp. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ là bƣớc đầu nên chúng tôi quyết định “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactic ứng dụng trong chế biến sản phẩm lên men truyền thống” 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS PLANTARUM B33 Vi khuẩn đầu tiên đƣợc sử dụng phổ biến trong các sản phẩm lên men truyền thống chính là vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên chứng minh sữa chua đƣợc tạo thành do hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặc biệt, ông đặt tên là vi khuẩn lactic nhƣng ông chƣa phân lập đƣợc chúng. Năm 1878, J.Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên là Bacterium lactic[14]. Từ đó cho đến nay có rất nhiều chủng vi khuẩn mới đƣợc phân lập. Vi khuẩn lactic nói chung đƣợc xếp vào họ Lactobacteriacae, chúng không đồng nhất về hình thái, hình dạng và kích thƣớc tế bào vi khuẩn còn phụ thuộc vào môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt oxy và tuổi tế bào. Tuy nhiên, về mặt sinh lý chúng là các vi khuẩn Gram dƣơng, không tạo bào tử, không di động, thu năng lƣợng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết axit lactic. 1.1.1. Đặc điểm của chủng Lactobacillus plantarum b33 Lactobacillus plantarum là loài lớn trong họ Lactobacillus, đây là họ lớn nhất trong họ thuộc loài vi khuẩn lactic, là trực khuẩn gram dƣơng, lên men đồng hình [18]. Hình dạng của chúng chủ yếu là hình que dài, kích thƣớc 0,7- 1,1µm đến 38µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của L.plantarum là 30-40oC, chúng có khả năng sinh trƣởng đƣợc ở 15oC nhƣng lại không sinh trƣởng tại 45oC. L.plantarum có khả năng tổng hợp axit lactic ở cả hai dạng đồng phân D và L. Đây là loài vi hiếu khí nên nó có thể lên men kỵ khí hoặc hiếu khí (do có thể sử dụng oxy nhƣng không có chuỗi hô hấp và cytochrome). L.plantarum b33 mang đầy đủ các đặc điểm chung của loài Lactobacillus plantarum nhƣ: là trực khuẩn Gram dƣơng, không có hoạt tính catalaza, không sinh bào tử, không sinh khí, không có khả năng di động. 2 Hình thái chủng L.plantarum b33 sau khi đƣợc nhuộm Gram và soi tiêu bản trên kính hiển vi với vật kính 1000 có đặc điểm: bắt màu tím tinh thể, tế bào hình que, có màu tím, thƣờng xếp song song thành từng cặp hoặc riêng rẽ, kích thƣớc tế bào khoảng 0,8-1.5 µm. Hình thái khuẩn lạc L.plantarum b33 nhỏ, đƣờng kính khoảng 0,5-1mm, tròn, mép trong, khuẩn lạc có màu trắng ngà. Đặc điểm sinh trƣởng: chủng sinh trƣởng ở nhiệt độ thích hợp nhất là 30oC; pH thích hợp 6,2; có khả năng lên men tạo axit lactic là chủ yếu. Sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng MRS trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí [31].Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn này đạt cân bằng sau 24h nuôi cấy [2; 9; 5] và pH đạt đƣợc khoảng 3,5-4. Ngoài ra, chủng có khả năng sinh bacteriocin mạnh [2; 9] 1.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic 1) Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên quá trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic  Ảnh hƣởng của nguồn cacbon  Ảnh hƣởng của nguồn nitơ  Ảnh hƣởng có các yếu tố khác 2) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy  Ảnh hƣởng của nhiệt độ  Ảnh hƣởng của pH  Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống 1.1.3. Ứng dụng chủng L.plantarum b33 Cũng nhƣ nhiều vi khuẩn lactic khác thì L.plantarum b33 cũng có một số ứng dụng trong thực tiễn:Trong ngành công nghiệp sản xuất axit lactic, đây là nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho ngành công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, in ấn, sơn và công nghiệp chế tạo chất dẻo có khả năng phân hủy sinh học. 3  Trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm  L.plantarum b33 có khả năng lên men galacza, glucoza, fructoza…. nên chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm lên men nhƣ các sản phẩm nguồn gốc động vật (nem chua, xúc xích, salami, tôm chua…), các sản phẩm có nguồn gốc thực vật (kim chi Hàn quốc, bắp cải muối, ngũ cốc lên men, tƣơng…) và một số sản phẩm từ sữa khác.  L. plantarum b33 đƣợc sử dụng để ủ thức ăn gia súc trong điều kiện kỵ khí, các vi khuẩn này lên men nhanh và át hẳn các vi khuẩn khác trong vòng 48h. Hơn nữa, do có khả năng lên men lactic sinh ra axit hữu cơ làm giảm pH môi trƣờng khiến các vi sinh vật gây thối, hỏng thực phẩm hay vi sinh vật gây bệnh bị tiêu diệt do đó đƣợc sử dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm. Năm 2010, Nguyễn Thế Trang đã tiến hành sử dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm bảo quản cá.  Hơn nữa, một số chủng thuộc loài L.plantarum có khả năng sinh bacteriocine nhóm IIB (<10kDa) nhƣ: plantaricins loại S và T[22], plantaricins LR14 [32], plantaricins TF711 [21]. Đây là các bacteriocin bền nhiệt có thể chịu pH 100oC trong 30 phút và có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ pH = 27[21; 32]. Riêng chủng L.plantarum b33 cũng có khả năng sinh bacteriocin và cũng đƣợc ứng dụng trong sản xuất nem chua, tôm chua[2; 9]. 1.2. QUÁ TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC 1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo chế phẩm vi khuẩn lactic 1.2.1.1. Phương pháp sấy Dựa vào phƣơng pháp tạo động lực cho quá trình sấy có thể chia thành hai phƣơng pháp sấy[9]: - Phƣơng pháp sấy lạnh: gồm sấy chân không, sấy đông khô, sấy ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ>0). - Phƣơng pháp sấy nóng:sấy tầng sôi, sấy khí, sấy trống, sấy phun, sấy hầm, sấy tháp … 4 Hiện nay, có bốn phƣơng pháp sấy đƣợc sử dụng phổ biến để tạo chế phẩm vi sinh vật: Bảng 1.1: Các phƣơng pháp sấy phổ biến hiện nay Phƣơng pháp sấy Sấy tầng sôi (Fluidized bed drying) Cấu tạo -Cấu tạo dạng hộp hay buồng hình trụ, trong có lớp lƣới để đỡ vật liệu và phân phối dòng tác nhân sấy. Nguyên lý hoạt động -Không khí nóng đƣợc thổi từ đáy buồng, thổi bung lớp vật liệu lên, làm vật liệu ở trạng thái lơ lửng Sấy phun (Spray drying) -Mỗi hệ thống bao gồmcác bộ phận riêng biệt: +Bộ phận đốt nóng không khí(air heater) +Bộ phận nhập liệu (feeding) +Cơ cấu phun (atomization) +Bộ phận thu hồi sản phẩm (powder collection), +Cyclon tách bụi (dust separation). -Gồm một buồng sấy, trong có giá đỡ đựng các khay. Vỏ của buồng sấy là lớp vỏ áo. -Những thiết bị đi kèm: bơm chân không, thiết bị ngƣng -Gồm ba giai đoạn cơ bản: +Phun sƣơng: tạo sƣơng mù cho nguyên liệu ở dạng lỏng, huyền phù thành dạng hạt. + Trộn mẫu và tác nhân sấy: sau khi trộn, ẩm trong mẫu bốc hơi +Thu hồi sản phẩm Sấy chân không (Vacuum drying) -Áp suất trong buồng sấy là áp suất chân không, vỏ áo đƣợc gia nhiệt bằng hơi nƣớc bão hoà hay nƣớc nóng. Khi đƣợc gia nhiệt dƣới áp suất chân 5 Ƣu điểm - Rẻ tiền, đơn giản - Cƣờng độ sấy lớn, cho phép sấy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cho phép vì thời gian tiếp xúc ngắn -Hiệu quả sử dụng cao -Có khả năng điều khiển tự động -Thời gian sấy cực ngắn -Chất lƣợng sản phẩm đồng đều -Hoạt động liên tục và điều khiển tự động. Nhƣợc điểm - Phạm vi sử dụng hẹp: chỉ dùng cho nguyên liệu kích thƣớc nhỏ, độ ẩm thấp -Máy sấy lớn, dễ vỡ -Thiết bị nhanh hao mòn -Nhiệt độ sấy thấp -Lƣợng ẩm bốc ra nhiều, không gây ô nhiễm môi trƣờng -Sấy đƣợc vật liệu không -Chi phí năng lƣợng và chi phí thiết bị cao -Chỉ dùng cho một số sản phẩm chất lƣợng cao -Phạm vi sử dụng hẹp, thiết bị mang tính đặc thù -Vốn đầu tƣ lớn. - Hiệu suất thu hồi thấp tụ,bộ phận gia nhiệt, áp kế. Sấy đông khô (Freeze drying) không, ẩm từ vật liệu thoát ra và liên tục đƣợc hút ra ngoài nhờ bơn chân không. Nhiệt độ sấy nhỏ hơn 100°C. -Gồm ba giai đoạn: +Giai đoạn lạnh đông + Giai đoạn thăng hoa +Giai đoạn tách hơi ẩm 6 chịu đƣợc nhiệt độ cao - Nhiệt độ sấy thấp nên bảo toàn đƣợc giá trị dinh dƣỡng và màu sắc, cấu tử hƣơng, cấu trúc vật liệu không thay đổi đáng kể. -Chi phí cho thiết bị và năng lƣợng cao dẫn tới giá thành sản phẩm đắt  Sấy đông khô Sấy đông khô gồm 3 giai đoạn chính [8]:  Giai đoạn làm lạnh (giai đoạn lạnh đông) Trong giai đoạn này vật liệu sấy đƣợc làm lạnh từ nhiệt độ môi trƣờng xuống nhiệt độ -20°C. Ở giai đoạn này không gian của bình thăng hoa đƣợc hút chân không và áp suất trong bình giảm. Do áp suất giảm (gồm áp suất hơi nƣớc và áp suất trong lòng vật liệu sấy) dẫn tới hiện tƣợng thoát ẩm từ vật liệu sấy cho nên nhiệt độ vật liệu sấy nhỏ hơn điểm 3 thể (T<273k, p>610Pa). Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn các giai đoạn của quá trình sấy đông khô  Giai đoạn thăng hoa Đây là giai đoạn tách ẩm chính của phƣơng pháp sấy đông khô. Ở giai đoạn này, áp suất hơi nƣớc đƣợc giữ dƣới 4,58 mmHg (610,5 Pa) và nƣớc ở dạng băng, khi sản phẩm đƣợc cung cấp nhiệt, thì băng rắn sẽ thăng hoa trực tiếp thành hơi mà không bị tan chảy. Hơi nƣớc tiếp tục đƣợc tách ra khỏi sản phẩm bằng cách giữ cho áp suất trong buồng thăng hoa thấp hơn áp suất hơi nƣớc trên bề mặt của băng, đồng thời tách hơi nƣớc bằng máy bơm chân không và ngƣng tụ nó bằng các ống xoắn ruột gà lạnh. Quá trình sấy tiếp diễn, bề mặt thăng hoa di chuyển vào bên trong sản phẩm đông lạnh, 7 làm sản phẩm đƣợc sấy khô. Hơi nƣớc di chuyển ra khỏi sản phẩm qua các kênh và đến bình ngƣng, sau đó thành băng bám trên bề mặt ống.  Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại Là giai đoạn làm bay hơi ẩm liên kết, nhiệt độ của vật liệu sấy tăng nhanh. Tốc độ sấy phụ thuộc phần lớn vào tính cản trở nhiệt của sản phẩm và ở mức độ thấp hơn vào độ cản trở dòng hơi (dịch chuyển khối) ra khỏi bề mặt thăng hoa. Sau giai đoạn thăng hoa do trạng thái của nƣớc trong vật liệu nằm trên điểm 3 thể nên ẩm trên vật liệu trở về dạng lỏng. Vì khi đó áp suất trong bình thăng hoa vẫn đƣợc duy trì bé hơn áp suất khí quyển nhờ bơm chân không và vật liệu sấy vẫn tiếp tục đƣợc gia nhiệt nên ẩm vẫn không ngừng biến từ dạng lỏng sang dạng hơi và đi vào không gian bình thăng hoa. Nhƣ vậy giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy chân không bình thƣờng. Phƣơng pháp này đã đƣợc chứng minh là cho tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi sấy cao nhất. Năm 2011, Papanna cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sấy vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides MTCC 5209 sử dụng cả bốn phƣơng pháp sấy nêu trên. Kết quả cho thấy chỉ có phƣơng pháp sấy đông khô khi sử dụng chất mang là sucrose 7% cho thấy có hiệu quả sống sót 72% và sau 6 tháng bảo quản ở 4oC chỉ giảm 1log[28]. Bên cạnh đó, không chỉ phƣơng pháp sấy có ảnh hƣởng tới quá trình tạo chế phẩm mà chất mang cũng có ảnh hƣởng không nhỏ tới quá trình tạo chế phẩm. Và cũng đã có không ít các nghiên cứu về ảnh hƣởng của chất mang khi sử dụng phƣơng pháp sấy đông khô tạo chế phẩm vi khuẩn lactic [14; 11; 18; 25; 31; 36; 28; 26]. 1.2.1.2. Chất mang Chất mang có vai trò rất lớn trong quá trình sấy và bảo quản vi khuẩn lactic. Do đó việc lựa chọn chất mang phù hợp với chủng vi khuẩn nghiên cứu là rất cần thiết. Có ba loại hợp chất thƣờng đƣợc sử dụng làm chất mang: 8  Chất có khả năng hấp thụ qua thành và màng nguyên sinh chất làm thành tế bào dẻo hơn, chúng ngăn sự tách nƣớc, giảm tính độc của muối và ngăn sự tạo thành tinh thể bên trong tế bào trong quá trình sấy. Các chất thuộc loại này bao gồm: monosaccharide, disaccharide, glycerol….[28]  Chất thấm qua thành tế bào nhƣng không qua màng nguyên sinh chất gây co nguyên sinh tế bào trƣớc khi lạnh đông, tập trung vào giữa màng tế bào và thành tế bào nhƣ lớp đệm chống lại sự tạo thành băng vì vậy tạo thành sự bảo vệ cơ học dƣới màng nhƣ maltodextrin  Chất không thấm qua thành tế bào hoặc không trực tiếp tƣơng tác với thành hoặc đƣợc hấp thụ trên bề mặt của các vi sinh vật ở đó chúng tạo thành lớp gel, do đó kìm hãm đƣợc tốc độ tạo tinh thể thông qua sự gia tăng tính nhầy của dung dịch và giữ cấu trúc vô định hình của tinh thể gần nhƣ trạng thái của tế bào nhƣ protein, polysaccharide… Ngoài ra còn có một số loại đƣờng và dẫn xuất của đƣờng (glucose, fructose, lactose, manose...), rƣợu có gốc đƣờng (sorbitol, inositol) và đƣờng không khử (trehaloza) [17; 10] với các tính năng nhƣ giá thành rẻ, không độc hại, đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và đƣợc bổ sung vào chế phẩm trƣớc khi sấy nhằm bảo vệ vi khuẩn trong quá trình sấy và bảo quản chế phẩm sau này. Qua nghiên cứu các tài liệu chúng tôi nhận thấy hai chất mang không những mang đầy đủ các đặc tính có lợi trên mà còn góp phần nâng cao tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn lactic trong quá trình sấy và bảo quản chế phẩm là trehaloza và maltodextrin. 1. Maltodextrin Maltodextrin là polysaccharide có giá trị dinh dƣỡng cao, có độ ngọt thấp, đƣợc cấu thành từ D-glucose nhờ các liên kết α-1,4 glucozit và có chỉ số DE<20 (Dextrose Equivalent: chỉ số đƣơng lƣợng khử quy ra D-glusoce đƣợc tạo thành trong quá trình 9 thủy phân tinh bột tính theo % chất khô). Maltodextrin đƣợc sản xuất bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: Lý hóa học, sinh học. Hình 1.2: Công thức cấu tạo của maltodextrin Maltodextrin đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:  Maltodextrin đƣợc dùng để sản xuất thức ăn trẻ em và đồ ăn kiêng  Maltodextrin đƣợc sử dụng trong sản xuất các loại bánh kẹo và đồ uống  Maltodextrin có tác dụng trong dƣợc phẩm nhƣ làm màng bao, tá dƣợc  Cuối cùng một đặc tính vô cùng quý báu đó là maltodextrin đƣợc dùng làm chất ổn định, giữ hƣơng vị hay giữ tinh dầu trong sản xuất sôcôla, cà phê, nƣớc quả… Hơn thế nó còn là chất mang bảo vệ vi khuẩn và các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình sấy tạo chế phẩm ứng dụng rất lớn trong đời sống và sản xuất. Trong nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic, maltodextrin đƣợc coi là một trong những chất mang đƣợc sử dụng rộng rãi.  Năm 2005, Harrie Oldenhof cùng cộng sự đã nghiên cứu thành công sấy khí (air drying) vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus sử dụng chất mang maltodextrin 5% (w/w) và kết hợp maltodextrin với sucrose 5% (w/w) cho hiệu quả sống sót của vi khuẩn này sau sấy là cao nhất trong các loại chất mang đƣợc nghiên cứu[20]. 10  Năm 2007, Chavez và cộng sự nghiên sử dụng protein đậu nành kết hợp với maltodextrin cho tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn Bifidobacterium lactis BB12 là cao nhất trong các chất mang đƣợc tiến hành nghiên cứu [15].  Năm 2009, Ibourahema cùng cộng sự năm 2009 đã tiến hành tạo chế phẩm vi khuẩn L.plantarum bằng phƣơng pháp sấy đông khô và cho tỷ lệ tế bào sống sót sau sấy lên đến 97% khi sử dụng kết hợp hai loại chất mang maltodextrin 5% với glycerol 2%. Chế phẩm L.plantarum đƣợc bảo quản trong 4oC sau 3 tháng mà tỷ lệ sống sót chỉ giảm 1 log [25]. 2. Trehaloza Trehaloza là chất mang đƣợc ứng dụng nghiên cứu nhiều nhất trong nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic do mang các đặc tính thực sự cần thiết giúp tế bào vi khuẩn chống chịu đƣợc với điều kiện khắc nghiệt của quá trình sấy đông khô. Trehaloza đƣợc thấy nhƣ là chất bổ trợ cần thiết, do nó thế chỗ các phân tử nƣớc trong màng tế bào khi quá trình loại nƣớc và các liên kết hidro liên kết của các phân tử protein ở hai đầu cực bị phá vỡ [29]. Theo kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy, các tác nhân bảo vệ đặc biệt là các đƣờng tạo nhiệt độ thấp hơn của màng tế bào khi chuyển trạng thái (Tm: transition temperature) và bảo vệ cấu trúc protein trong quá trình sấy. Hầu hết các phân tử nƣớc đều bị giữ ở trong giữa các phân tử đƣờng và các tinh thể đá [16]. Samuel và cộng sự đã công nhận trehaloza có khả năng bảo vệ tế bào khô hơn các loại đƣờng khác, nó có thể bảo vệ liposom, cô lập màng sinh học và bảo vệ nguyên vẹn tế bào khỏi sự ảnh hƣởng của quá trình lạnh đông và sấy [29]. Đến năm 2003, Hubalek cũng khẳng định khả năng bảo vệ của đƣờng là do đƣờng ngăn sự tạo thành các tinh thể khi mà chúng giữ các dung môi đặc biệt là muối tránh hiện tƣợng tạo tinh thể [24]. Hơn thế nữa trehaloza còn có tác dụng làm ổn định màng tế bào trong quá trình lạnh đông là do: trong quá trình ƣu trƣơng khi các tinh thể đá đƣợc hình thành chúng 11