Tài liệu Định lượng flavonoid của lá quan âm biển (vitex rotundifolia l. f., verbenaceae) bằng phương pháp ce pda

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN (VITEX ROTUNDIFOLIA L. f., VERBENACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Thị Xuân Diệu Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 . . ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN (VITEX ROTUNDIFOLIA L. f., VERBENACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA (Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày …………....) Cơ quan chủ quản (ký tên và đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Nguyễn Thị Xuân Diệu Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên và đóng dấu) . . MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ....................................................................................... iii Mở đầu ............................................................................................................................................ 1 Chương 1. Tổng quan tài liệu........................................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về thực vật học ........................................................................................................ 3 1.1.1. Tên khoa học .......................................................................................................................... 3 1.1.2. Vị trí trong bảng phân loại thực vật ....................................................................................... 3 1.1.3. Mô tả thực vật ........................................................................................................................ 3 1.1.4. Bộ phận dùng ......................................................................................................................... 4 1.2. Tổng quan về thành phần hóa học............................................................................................. 4 1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý ................................................................................................. 7 1.3.1. Kháng viêm ............................................................................................................................ 7 1.3.2. Ức chế tiết prolactin ............................................................................................................... 8 1.3.3. Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt ....................................................................................... 8 1.3.4. Chống dị ứng và hen suyễn .................................................................................................... 9 1.3.5. Ức chế tế bào ung thư .......................................................................................................... 10 1.4. Công dụng trong y học cổ truyền............................................................................................................... 10 1.5. Tổng quan về cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của casticin, isoorientin và cynarosid ........ 11 Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ................................................................... 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................. 13 2.1.1. Nguyên liệu .......................................................................................................................... 13 2.1.2. Dung môi, hóa chất .............................................................................................................. 13 2.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu ..................................................................................................... 13 2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................................... 13 2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng phương pháp CE.......................... 13 2.2.2. Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp UPLC .................................................. 16 Chương 3. Kết quả nghiên cứu ................................................................................................... 22 3.1. Độ tinh khiết của các chất đối chiếu ....................................................................................... 22 3.2. Khảo sát điều kiện phân tích cao quan âm biển bằng phương pháp CE ................................. 23 3.2.1. Lựa chọn kỹ thuật điện di..................................................................................................... 23 3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ............................................................................................ 24 3.2.3. Khảo sát hệ đệm .................................................................................................................. 24 3.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và tỉ lệ methanol thêm vào ................................................ 25 3.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm ........................................................... 27 i . . 3.2.6. Thay methanol bằng acetonitril và khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm .... 28 3.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế .................................................................................... 29 3.2.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................... 30 3.2.9. Khảo sát tính phù hợp hệ thống .......................................................................................... 30 3.2.10. Phân tích mẫu thử và mẫu đối chiếu ở điều kiện khảo sát ................................................ 31 3.3. Khảo sát điều kiện UPLC........................................................................................................ 32 3.3.1. Khảo sát chương trình rửa giải UPLC.................................................................................. 32 3.3.2. Khảo sát bước sóng phát hiện .............................................................................................. 33 3.3.3. Khảo sát tốc độ dòng ............................................................................................................ 34 3.3.4. Khảo sát nhiệt độ cột ............................................................................................................ 35 3.4. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu............................................................................................. 36 3.4.1. Khảo sát dung môi chiết....................................................................................................... 36 3.4.2. Khảo sát thời gian chiết........................................................................................................ 36 3.4.3. Khảo sát số lần chiết ............................................................................................................ 37 3.5. Đánh giá quy trình định lượng đồng thời isoorientin, cynarosid và casticin trong lá Quan âm biển ................................................................................................................................................. 38 3.5.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ...................................................................................... 38 3.5.2. Khảo sát tính tuyến tính (khoảng xác định) ......................................................................... 39 3.5.3. Khảo sát độ đặc hiệu ............................................................................................................ 41 3.5.4. Khảo sát độ lặp lại ................................................................................................................ 42 3.5.5. Khảo sát độ đúng.................................................................................................................. 43 3.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................................... 44 3.6. Định lượng so sánh các flavonoid trong lá quan âm biển thu hái ở Phú Yên và Nha Trang . 46 Chương 4. Bàn luận ..................................................................................................................... 47 Kết luận ......................................................................................................................................... 48 Tài liệu tham khảo ......................................................................................................................... a ii . . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT IFN-γ Interferon gamma IL Interleukin LPS Lipopolysaccharide MeOH methanol MRSA Methicillin-resistant S. aureus PMS Premenstrual Syndrome - hội chứng tiền kinh nguyệt UV ultraviolet - tử ngoại ISO isoorientin CYN cynarosid CAS casticin iii . . MỞ ĐẦU Chi Vitex thuộc họ Verbenaceae bao gồm gần 250 loài phân bổ phổ biến cả khu vực khí hậu nhiệt đới lẫn ôn đới. Trong đó, nhiều loài đã được con người sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời và được y học hiện đại nghiên cứu, chứng minh có những tác động dược lý giá trị. Đáng chú ý nhất là loài Vitex agnus-castus mọc chủ yếu ở vùng biển Địa Trung Hải. Loài này được biết đến với tên gọi “chaste tree” nghĩa là “cây trong sạch”, xuất phát từ việc được các thầy tu từ thời Trung Cổ sử dụng với mục đích giảm ham muốn tình dục. Loài này đã và đang được nghiên cứu, bào chế thành các thành phẩm thuốc từ những thập niên cuối của thế kỷ 20 trong điều trị nhiều bệnh như mụn trứng cá, rối loạn tiêu hóa, rối loạn kinh nguyệt, đặc biệt là hội chứng tiền kinh nguyệt (premenstrual syndrome - PMS) tại Châu Âu, Bắc Mỹ.1 Ở Việt Nam, Quan âm biển (Vitex rotundifolia L.f.), được dân gian sử dụng để trị nhức đầu, quáng gà và một số bệnh ngoài da như mẩn ngứa, mụn nhọt, phát ban và đã được các nhà khoa học chứng minh có tác dụng điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt hiệu quả tương tự như Vitex agnus-castus.2 Đây là tín hiệu đáng mừng vì loài này mọc khá phổ biến ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh duyên hải Miền Trung. Với nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có, nếu như được quan tâm nghiên cứu và phát triển thành chế phẩm thuốc thì nguồn nguyên liệu này sẽ đóng góp không nhỏ cho y học hiện đại nói riêng và nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe cho nhân dân nói chung. Gần đây, các phương pháp phân tích hiện đại như CE, UPLC thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội trong việc kiểm nghiệm dược liệu như thời gian phân tích ngắn, tiêu tốn ít dung môi và mẫu,… Phương pháp CE thích hợp để định lượng các thành phần hoạt chất có khả năng phân ly (flavonoid, alkaloid,…) trong khi đó UPLC áp dụng cho hầu hết các nhóm hoạt chất. Tuy nhiên, hiện nay chưa tìm thấy nhiều tài liệu công bố việc dùng các phương pháp hiện đại này để định lượng thành phần hoạt chất trong chi Vitex nói chung và dược liệu Quan âm biển nói riêng. Flavonoid là một trong những thành phần hoạt chất chính của Quan âm biển. Đây là thành phần đóng góp đáng kể vào các tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng ung thư, điều hòa nội tiết tố… cho dược liệu này.3 Do đó, đề tài đặt vấn đề xây dựng quy trình định lượng các flavonoid chính của lá Quan âm biển (Vitex rotundifolia L. f., Verbenaceae) với mong muốn tìm kiếm một phương pháp mới trong việc kiểm nghiệm dược liệu này. Đề tài được thực hiện với 3 mục tiêu cụ 1 . . thể như sau: - Thăm dò và chuẩn hóa điều kiện phân tích định lượng flavonoid của lá Quan âm biển bằng phương pháp phân tích hiện đại như CE, UPLC. - Khảo sát điều kiện thích hợp để xây dựng quy trình chiết xuất định lượng flavonoid của lá Quan âm biển. - Định lượng so sánh mẫu Quan âm biển thu hái ở hai tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa. 2 . . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Tên khoa học: Vitex rotundifolia L.f. Tên đồng nghĩa: Vitex trifolia var. simplicifolia Cham, Vitex trifolia var. ovata (Thunb.) Makina, Vitex trifolia var. unifoliata Schauer, Vitex ovata Thunb. Tên thường gọi: Quan âm biển, Màn kinh tử, Từ bi biển, Mạn kinh lá đơn, Mạn kinh lá nhỏ, Bình linh xoan.4 1.1.2. Vị trí trong bảng phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại của Takhatajan và Phạm Hoàng Hộ, vị trí của loài Vitex rotundifolia L.f. được xếp như sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Hoa môi (Lamiidae) Bộ Hoa môi (Lamiales) Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Chi Vitex Loài Vitex rotundifolia L.f.5 1.1.3. Mô tả thực vật Dạng sống: Cây gỗ nhỏ, cao từ 10-40 cm, mọc sà bên bờ biển tạo nên thảm dày, có khi tới 10 m tính từ gốc. Thân non tiết diện vuông, màu xanh mốc, thân già tiết diện tròn, bề mặt nứt nẻ, màu vàng nâu hay nâu, có mùi thơm. Lá: Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập, có mùi thơm, kích thước 2-6,5 x 1-4,5 cm, hình dạng biến thiến, thường dạng trứng ngược hoặc hình thìa với đỉnh tù, đáy thuôn, mặt trên xanh đậm và có ít lông tơ hơn mặt dưới. Cuống lá ngắn gần như không có. Hoa: Hoa có màu tím xanh, lưỡng tính, chùm xim mọc ở ngọn cành dài 3-10 cm. Đài hoa hình chén, 5 lá đài gần đều, kích thước khoảng 0,4-0,5 cm, nhiều lông mịn ở ngoài, bên trong nhẵn, tiền khai van. Tràng hoa không đều, dính thành ống hẹp bên dưới dài khoảng 0,8 cm, phía trên chia làm 2 môi 2/3, có màu tím hay tím hoa cà; mặt trong và ngoài ống tràng có nhiều lông mịn, tiền khai 5 điểm. Bộ nhị gồm có 4 nhị, kiểu hai trội, hai nhị trước dài hơn hai nhị sau, có kích thước khoảng 0,8-1,2 cm, chỉ nhị màu trắng hay 3 . . tím nhạt, có nhiều lông ở gốc chỉ nhị. Bao phấn màu tím, hình bầu dục, 2 buồng, nứt dọc, đính giữa. Hạt phấn hình bầu dục có 3 rãnh dọc. Bầu trên hình cầu gồm 2 lá noãn có vách giả chia làm 4 ô, mỗi ô một noãn, đính noãn trung trụ. Quả: Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,5-0,65 cm; khi còn non có màu xanh lá cây, khi chín màu vàng hay đỏ, quả khô màu nâu sẫm. Đài đồng trưởng bao lấy 1/3 - 2/3 phía dưới quả, màu trắng xám, khó vỡ. Bên trong quả chia làm 4 ô, mỗi ô 1 hạt. Quả có mùi đặc trưng, vị hơi nóng. Hạt: Hạt màu trắng xám, thường 1-2 phát triển.6, 7 1.1.4. Bộ phận dùng Thường là quả, thu hái vào mùa thu khi chín rửa sạch và loại bỏ cuống, phơi hay sấy khô, dùng tươi hoặc sao qua. Lá và hạt, rễ cũng được sử dụng bằng cách xông hay sắc lấy nước uống.8 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Trong những năm gần đây, Vitex rotundifolia L.f. được nghiên cứu và phân lập ra chủ yếu 4 nhóm hợp chất chính: flavonoid, terpenoid, irrioid và lignan. Ngoài ra trong cây còn có các ecdysteroid, glucosid, phenolic acid…9, 10 Flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f. chủ yếu thuộc nhóm euflavonoid, thường là các polymethoxyflavonoid mà tiêu biểu là các flavonol với vòng B có 2 nhóm thế như: casticin, artemin, quercetagenin. Trong đó, casticin là flavonoid có hàm lượng cao nhất trong cây, đặc biệt là ở lá và quả. Dược điển Trung Quốc 2005 quy định casticin là chất chuẩn trong Vitex rotundifolia L.f. với hàm lượng không nhỏ hơn 0,3%. Casticin (vitexicarpin) đang ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm vì khả năng tác động kiểu estrogen,2 điều hòa miễn dịch11 hay ức chế các tế bào ung thư bằng cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis.12 Ngoài flavonol, trong cây còn có các flavon như luteolin và các dẫn xuất glycosid của nó: luteolin 6-C-βglucopyranosid (isoorientin), luteolin 7-O-β-glucuronid, luteolin 7-O-βglucopyranosid (cynarosid), luteolin 3-O- β-glucuronid và apigenin 6-C-β-glucosid (isovitexin).13 Terpenoid trong Vitex rotundifolia L.f. chủ yếu là các diterpen có cấu trúc khung labdan-diterpen chiếm hàm lượng cao trong thành phần hóa học của quả và lá Vitex rotundifolia L.f..14 Tính đến nay, đã có khoảng gần 30 diterpen được phân lập trong đó đặc biệt rotundifuran và trisnor-γ-lacton có khả năng kháng ung thư nhờ tác động cảm ứng quá trình apoptosis.15 4 . . Irioid trong Vitex rotundifolia nói riêng và chi Vitex nói chung thường là các monoterpen cấu trúc đơn giản, đôi khi có trường hợp bị mở vòng lacton như 1-oxoeucommiol hoặc tạo liên kết -O-glycosid với α-D-glucose như trong agnusid.16 Lignan có chủ yếu trong rễ của Vitex rotundifolia với cấu trúc chính là arylnaphtalenlignan. Trong đó, vitrofolan C và D đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng khuẩn cao, đặc biệt là có hiệu quả với MRSA.17 R1 R2 1. Casticin OMe OH 2. Artemin OMe OMe 3. Quercetagenin OH OH 4. Penduletin OH H R1 O MeO R2 OMe MeO OH O OH OH OH OMe O MeO H O HO R MeO OH OH O O R1 3’,5-dihydroxy-4’,6,7-trimethoxyflavanon 1. Luteolin H 2. Quercetin OH OH OH OH OH HO HO HO O O O O O OH OH OH OH OH O OH OH O OH Luteolin 7-O-β-glucopyranosid (cynarosid) Luteolin 6-C-β-glucopyranosid (isoorientin) OH OH O HO O O O OH OH OH OH O Luteolin 7-O-β-glucuconid Hình 0.1 Cấu trúc hóa học các flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f. 5 . . O O O O O O O OH H H OAc OAc H Previtexilacton Prerotundifuran O OAc Vitexilacton R2 OH R1 H R1 R2 Ferruginol H OH Abietratrien-3-β-ol OH H H OAc Rotundifuran Hình 0.2 Cấu trúc hóa học các terpenoid trong Vitex rotundifolia L.f. HO HO H HO H OH OH OH OH Eucommiol O HO 1-oxo-eucommiol Iridolacton HO H HO O H O O H H HO O HO H O HO Pedicularis-lacton Viteosid I HO O O H O HO O O OH OH OH Agnusid Hình 0.3 Cấu trúc hóa học các iridoid trong Vitex rotundifolia L.f. 6 O Viteosid II H O . O H O HO HO HO H . OHC OHC OH OHC HO OH OMe MeO OMe OHC Vitrofolal B OHC O Vitrofolal C OMe MeO Vitrofolal D R1 OH OMe OMe OMe OMe R1 OH OH OMe OMe OMe OMe Vitrofolal A HO OMe Vitrofolal E H Vitrolfolal F OH OMe Hình 0.4 Cấu trúc hóa học các lignan trong Vitex rotundifolia L.f. 1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 1.3.1 Kháng viêm Công trình được hợp tác nghiên cứu của các nhà khoa học từ Đại học tại Seoul, Hàn Quốc đã phân lập thêm được 3 diterpen (vitextrifolin H, viterotulin A, viterotulin B) và 2 neolignan (viterolignan A, viterolignan B) từ quả của Vitex rotundifolia L.f.. Các chất này được thử nghiệm về khả năng ức chế sản xuất NO ở dòng tế bào bạch cầu RAW264,7. Kết quả ở IC50 = 11,3-24,5 μM cả 5 chất trên cho tác động ức chế sản xuất NO đáng kể, tương tự như những thành phần đã được phân lập trước đó như viteagnusin I, vitextrifolin D, viteagnusin F.18 Vitex rotundifolia L.f. từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Hàn Quốc để điều trị đau đầu, chóng mặt, sốt. Một nghiên cứu được thiết kế bởi các nhà khoa học Hàn Quốc để nghiên cứu cơ chế kháng viêm của loài này thông qua tác động ức chế sản xuất NO của đại thực bào màng bụng chuột được kích thích bởi IFN-γ và LPS. Ban đầu, các tế bào sẽ được chia làm 2 nhóm: có hoặc không tác động bởi dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f. ở 3 mức nồng độ (0,01; 0,1 và 1 mg/ml). Sau đó cả 2 nhóm sẽ được kích thích bởi rIFN-γ (20 U/ml) và LPS (10 μg/ml). Lượng NO sinh ra sẽ được xác định thông qua nồng độ NO trong tế bào sau 48 giờ. Thông thường nếu không bị kích thích, lượng NO trong tế bào dao động trong khoảng 3,62 ± 0,4 μM. Ở nhóm chứng, nồng độ NO tăng lên gấp 10 lần giá trị bình thường, trong khi đó, các tế bào được tác động trước bởi dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f., nồng độ NO tăng lên ít hơn, đặc biệt là với nồng độ 1 mg/ml Vitex rotundifolia L.f. 7 . . cho kết quả ức chế việc sản xuất NO trên 64%. Đồng thời không có ảnh hưởng cũng như độc tính nào đáng kể tới hoạt động của tế bào ngay cả ở nồng độ sử dụng cao nhất (1 mg/ml). Do đó, Vitex rotundifolia L.f. có khả năng ức chế sản xuất NO nhưng không gây độc tính tế bào. Bên cạnh đó, thử nghiệm Western blotting cũng được tiến hành nhằm làm rõ cơ chế của khả năng ức chế sản xuất NO của Vitex rotundifolia L.f.. Kết quả thu được cho thấy cơ chế chính là do Vitex rotundifolia L.f. làm giảm biểu hiện của cyclooxygenase (COX-2) và yếu tố sản xuất enzym NO synthase từ Larginine (iNOS); tác động trên phụ thuộc vào liều.19 1.3.2 Ức chế tiết prolactin Một nghiên cứu đã thử nghiệm tác động của casticin được phân lập từ loài Vitex rotunfifolia L.f. lên chuột Sprague Dawley và tế bào tuyến yên từ những con chuột trên. Cả hai nhóm đối tượng này đều được gây cường prolactin máu bởi metoclopramid dihydroclorid (50 mg/kg, tid, ip/10 ngày). Casticin (10, 20 và 40 mg/kg, ip/7 ngày) làm giảm nồng độ prolactin lần lượt 33,9%, 54,3%, và 64,7%. Trong khi đó bromocriptine 1mg/kg làm giảm nồng độ prolactin ở nhóm chuột cường prolactin máu khoảng 44,9%. 17β-estradiol làm tăng đáng kể sự phát triển tế bào tuyến yên, từ đó làm tăng sự tiết prolactin và casticin (1 và 10 μmol/L) làm suy giảm đáng kể tác động đó theo thứ tự 27,7% và 42,1%. Casticin (1 và 10 μmol/L) ức chế có ý nghĩa trên thụ thể ERα mRNA ở các tế bào tuyến yên được kích thích bởi 17β-estradiol nhưng lại gia tăng tác động trên thụ thể ERβ mRNA ở nồng độ 10 μmol/L. Tuy nhiên, casticin không có tác động nào đáng kể trong sự phát triển cũng như tiết prolactin của các tế bào tuyến yên không được kích thích bởi 17β-estradiol in vitro. Như vậy, casticin có khả năng ức chế sự tiết prolactin từ các tế bào tuyến yên đã được kích thích bởi 17β-estradiol của chuột Sprague Dawley in vivo và in vitro. Nguyên nhân có thể liên quan tới khả năng ức chế những biểu hiên trên ERα mRNA và gia tăng biểu hiện trên ERβ mRNA.20 1.3.3 Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt (PMS) PMS là hội chứng liên quan tới sự rối loạn nội tiết tố nữ bao gồm một số triệu chứng như lo âu, căng thẳng, trầm cảm, nóng nảy, nhức đầu, đau ngực, chướng bụng, buồn nôn và nôn… trước khi bắt đầu chu kỳ kinh nguyệt. Các nguyên nhân của PMS vẫn còn chưa rõ ràng, nhưng phần đông ý kiến đều cho rằng steroid sinh dục sản xuất bởi hoàng thể của buồng trứng là nguyên nhân chính. Các nhà khoa học của Trung Quốc và Anh đã hợp tác trong nghiên cứu về đánh giá tác động tương tự estrogen của Vitex 8 . . rotundifolia L.f. cũng như vai trò của nó trong điều trị PMS, cụ thể là 4 thành phần chủ yếu trong dịch chiết cồn của quả loài cây này, bao gồm: casticin, luteolin, rotundifuran và agnusid thông qua ảnh hưởng của chúng đến phát triển của tế bào cũng như trên receptor estrogen (ER), receptor progesteron (PR) và biểu hiện của pS2 mRNA trên dòng tế bào MCF-7. Kết quả cho thấy, chỉ rotundifuran và agnusid có khả năng kích thích sự phát triển của các tế bào MCF-7. Tác động này phụ thuộc vào liều (từ 100 nM tới 10 μM). ER, PR và mức biểu hiện pS2 mRNA tăng khi sử dụng rotundifuran và agnusid trong vòng 24 giờ. Tóm lại, dịch chiết của Vitex rotundifolia L.f. và các chất chủ yếu trong đó như rotundifuran và agnusid cho tác động tương tự estrogen thông qua tương tác với ER, PR và pS2. Điều này sẽ rất ý nghĩa trong điều hòa những thay đổi ở cơ quan sinh sản và trong điều trị một số bệnh liên quan tới hormon như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, đồng thời điều hòa tỉ lệ estrogen và progesteron trong hội chứng tiền kinh nguyệt.2 1.3.4 Chống dị ứng và hen suyễn Dịch chiết nước quả Vitex rotundifolia L.f. cho tác động trên shock phản vệ in vivo và in vitro. Với nồng độ (10−4-1,0 g/kg), khả năng ức chế phản ứng dị ứng phụ thuộc liều theo mức độ lần lượt 48% và 80%. Dịch chiết làm giảm nồng độ histamin đồng thời làm ức chế thụ động phản ứng phản vệ trên da do IgE kháng DNP (dinitrophenyl). Các tác động này đều phụ thuộc vào liều. Hơn nữa, dịch chiết từ quả Vitex rotundifolia L.f. (10-3mg/ml) cho tác động đáng kể trên IgE kháng DNP gây ra bởi sự phân hủy các nhân tố α của tế bào ung thư từ đại thực bào màng bụng chuột.21 1H,8H-Pyrano [3,4-c]pyran-1,8-dion (PPY), phân lập từ Vitex rotundifolia L.f. cho tác động chống lại hen suyễn in vitro. Thí nghiệm được thiết kế trên tế bào biểu mô phổi (A549) được kích thích bởi TNF-alpha, IL-4 và IL-1 beta nhằm gây ra hóa ứng động và kết dính với bạch cầu ưa kiềm. PPY với nồng độ 50 μM không gây độc tế bào, lại làm giảm đáng kể biểu hiện của eotaxin, IL-8, IL-16 và VCAM-1 mRNA. PPY giảm tiết eotaxin phụ thuộc liều và ức chế hóa ứng động tới A549. Đồng thời, PPY ức chế rõ rệt quá trình phosphryl hóa của p65 và ERK1/2, có nghĩa nó có khả năng ức chế kênh MAPK/NF-KB. Để làm rõ khả năng kháng viêm và hen suyễn của PPY in vivo, các tác giả đã thử nghiệm ảnh hưởng của PPY trên sự phát triển bệnh viêm phổi trong mô hình chuột hen suyễn bởi ovanbumin (OVA) và sau đó kiểm tra những dấu hiệu đặc trưng của hen suyễn: sự gia tăng bạch cầu ưa acid ở BALF; hiện diện của Th2 cytokines như IL-4 và IL-5 ở BALF; nồng độ IgE trong 9 . . huyết tương; và sự gia tăng của tế bào viêm phổi. Kết quả cho thấy PPY ức chế rõ rệt sự tập trung của bạch cầu ái toan tại khí đạo thông qua việc giảm IL-4, IL-5 và IL-13 ở BALF với liều sử dụng là 10 mg/kg, khả năng kháng viêm của liều PPY sử dụng tương đương với 1 mg/kg dexamethason.22 1.3.5 Ức chế tế bào ung thư Các polymethoxyflavonoid bao gồm: casticin, armentin và 3’,5-dihydroxy-4’,6,7trimethoxyflavanon được phân lập từ dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f. được báo cáo có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu dòng tủy HL-60 thông qua việc cảm ứng chu trình chết tế bào (apoptosis). Sau đó các tác giả trên đã phân lập thêm một labdan-diterpen: rotundifuran từ quả của Vitex rotundifolia L.f. cũng có khả năng ức chế tế bào ung thư dòng HL-60 với cơ chế tương tự như polymethoxyflavonoid. Năm 2002, cũng từ quả của loài cây này, luteolin được phân lập và được cho là có khả năng tiềm ẩn trong phòng ngừa và hóa trị ung thư ở dòng tế bào ung thư bạch cầu tủy cũng thông qua cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis.23, 24 Casticin phân lập từ quả Vitex rotundifolia L.f. cho tác động ức chế sự phát tế bào lympho ở chuột. Bằng cách sử dụng 4 dòng tế bào EL-4, P815,9 và L929, casticin ở nồng độ lớn hơn 0,1μM thể hiện khả năng ức chế sự tạo thành concanavaline A và lipopolysaccarid – yếu tố cần thiết trong sự phát triển của tế bào lympho. Khả năng ức chế sự phát triển tế bào của flavonoid nói chung phụ thuộc vào liên kết đôi tại vị trí C2, C3 và phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm –OH có trong công thức. Khác với các flavonoid khác, casticin không những ức chế sự phát triển tế bào ở pha sớm mà còn ở pha muộn. Điều này rất có ý nghĩa trong điều trị bệnh liên qua đến hệ thống miễn dịch, ví dụ như viêm khớp dạng thấp bởi lẽ các tế bào lympho đã được kích hoạt và phát triển trước khi xuất hiện các triệu chứng và được chuẩn đoán.12, 25 1.4. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN Quả trị đau đầu, chảy nước mắt, đau mắt do nhiệt, viêm sưng nướu, quáng gà với liều dùng 5-9 g.8 Ngoài ra quả còn được dùng để trị hen suyễn, viêm phế quản, đau nửa đầu, răng lợi sưng đau, đau cơ, đau thần kinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn tiêu hóa.26 Lá dùng chữa đòn ngã tổn thương, giã ra ngâm vào rượu, lấy nước uống, bã đắp. Lá của Vitex rotundifolia L.f. là một trong những phương thuốc truyền thống của người dân Hawaii. Họ dùng lá tươi để trị các bệnh liên quan đến viêm nhiễm trên da, ngứa, nổi mẩn, phát ban. Một số nơi người ta dùng lá làm thuốc lợi tiêu hóa, long đờm. Ngoài ra, do trong thành phần có rotundial nên lá của Vitex rotundifolia L.f. còn được sử dụng 10 . . để xua đuổi côn trùng, đặc biệt là muỗi Aedes aegypti.27 1.5. TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CASTICIN, ISOORIENTIN VÀ CYNAROSID 1.5.1. Casticin 1.5.1.1. Cấu trúc hóa học 1.5.1.2. Một số tính chất lý hóa Khối lượng phân tử: 374.345 g/mol UV λ max (nm): 257, 349 (methanol) pKa = 6.13±0.40 (Scifinder) Tan trong methanol nóng, không tan trong nước,… (PubChem CID: 5315263) 1.5.2. Isoorientin 1.5.2.1. Cấu trúc hóa học 1.5.2.2. Một số tính chất lý hóa Khối lượng phân tử: 448.38 g/mol UV λ max (nm): 257, 350 (methanol) pKa = 5.90±0.40 (Scifinder) Tan trong nước, cồn, methanol,… (PubChem CID: 114776) 1.5.3. Cynarosid 11 . . 1.5.3.1. Cấu trúc hóa học 1.5.3.2. Một số tính chất lý hóa Khối lượng phân tử: 448.38 g/mol UV λ max (nm): 253, 348 (methanol) pKa = 6.10±0.40 (Scifinder) Tan trong cồn nóng, methanol nóng, ít tan trong nước… (PubChem CID: 5280637) 12 . . CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. 2 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Lá Quan âm biển (Vitex rotundifolia L. f.) thu hái tại thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Bột lá Quan âm biển được rây qua rây 0,3 mm trước khi dùng cho phân tích định lượng. Thời gian thu hái: tháng 8/2013. Mẫu lá Quan âm biển so sánh được thu hái tại Phú Yên vào tháng 8/2014. 2.1.2. Dung môi, hóa chất Chất đối chiếu: casticin, isoorientin và cynarosid (hàm lượng trên 99%) được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Quan âm biển. Hóa chất và dung môi dùng cho điện di mao quản: natri hydroxyd, acid phosphoric, acid boric, dinatri hydrophosphat, dinatri tetraborat, methanol (LiChrosolv® -Merck, Đức), acetonitril (LiChrosolv® -Merck, Đức). Dung môi dùng cho sắc ký lỏng siêu hiệu năng: methanol (LiChrosolv® -Merck, Đức), acetonitril (LiChrosolv® -Merck, Đức), acid formic (Prolabo®, Pháp), nước cất hai lần khử khoáng 18,2 M. 2.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu Máy điện di mao quản Agilent G7100A đầu dò DAD, điều khiển và xử lý số liệu bằng phần mềm Chemstation; cột mao quản silicagel nung chảy đường kính trong 50 m, chiều dài tổng cộng 64,5 cm. Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) Waters Acquity H-Class D12QSM851A, đầu dò PDA B12UPD859A kết nối với phần mềm Enpower 3; cột sắc ký Acquity UPLC® BEH C18 (130 Å; 1,7 µm; 2,1 mm x 50 mm). Máy đo pH Neomet pH 220 L. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng phương pháp CE 2.2.1.1. Pha chế các dung dịch thử nghiệm Dung dịch đối chiếu gốc Cân 0,0100 g mỗi chất đối chiếu (casticin, isoorientin, cynarosid) cho chung vào 13 . . bình định mức 5 ml, hòa tan và điền đầy đến vạch bằng methanol. Các dung dịch đệm Các dung dịch đệm được pha trong nước cất hai lần. - Đệm dinatri hydrophosphat 75 mM: Hòa tan 1,3431 g dinatri hydrophosphat với 40 ml nước, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch natri hydroxyd, thêm nước vừa đủ 50 ml. - Đệm amoni chlorid 75 mM: Hòa tan 0,2006 g amoni chlorid với 40 ml nước, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch amoniac, thêm nước vừa đủ 50 ml. - Đệm dinatri tetraborate 75 mM: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat với 40 ml nước, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Tương tự pha các dung dịch đệm dinatri tetraborat 25, 50 mM có pH 9,0. - Đệm dinatri tetraborat 75 mM thêm methanol: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat với 40 ml nước, thêm lần lượt 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml methanol, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Các dung dịch đệm thu được có nồng độ methanol lần lượt là 5%, 10%, 15% và 20%. Tương tự pha các dung dịch đệm dinatri tetraborat 25, 50 mM thêm methanol 5%, 10%, 15% và 20% có pH 9,0. - Đệm dinatri tetraborat 75 mM thêm acetonitril: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat với 40 ml nước, thêm lần lượt 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml acetonitril, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Các dung dịch đệm thu được có nồng độ acetonitril lần lượt là 5%, 10%, 15% và 20%. Tương tự pha các dung dịch đệm dinatri tetraborat 25, 50 mM thêm acetonitril 55%, 10%, 15% và 20% có pH 9,0. Dung dịch mẫu thử Cân chính xác khoảng 1 g bột lá Quan âm biển, chiết với 10 ml methanol với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (mức năng lượng sóng siêu âm 100% thiết kế của máy) ở nhiệt độ 60C ± 2C trong vòng 30 phút, sau đó ly tâm lấy dịch chiết, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm trước khi tiến hành phân tích bằng CE. 2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng CE Cột mao quản mới được hoạt hóa bằng natri hydroxyd 1 N trong 30 phút, sau đó được rửa lại bằng nước cất 2 lần trong 60 phút, tiếp tục với natri hydroxyd 0,1 N trong 30 phút, rửa lại với nước cất 2 lần trong 60 phút, rồi cân bằng với dung dịch đệm trong 30 phút. 14 . . Để đảm bảo độ lặp lại giữa các lần tiêm mẫu, cột mao quản được rửa bằng nước cất 2 lần trong 5 phút, natri hydroxid 0,1 N trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất 2 lần trong 10 phút rồi cân bằng với dung dịch đệm trong 10 phút. Mẫu được tiêm bằng chương trình tiêm áp suất 50 mbar x 5 s Trong quá trình thực hiện, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách như hệ đệm, pH, nồng độ dung dịch đệm, nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch đệm, nhiệt độ, điện thế được khảo sát để chọn điều kiện điện di thích hợp, đáp ứng các yêu cầu sau: - Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đuôi (0,8 ≤ AF ≤ 1,5); - Cường độ dòng điện thấp (< 100 A) - Tổng thời gian phân tích ngắn; - Độ lặp lại tốt. Hệ đệm Chọn hệ đệm có khả năng đệm tốt ở môi trường kiềm (pH 8-10), có linh độ điện di thấp (kích thước lớn, điện tích nhỏ) để tối thiểu hóa sự phát sinh dòng điện. Lần lượt khảo sát các hệ đệm dinatri hydrophosphat, dinatri tetraborat, amoni chlorid ở cùng nồng độ 75 mM và pH 10,0, điện thế 25 kV và nhiệt độ 25oC để chọn hệ đệm tối ưu. pH pH có ảnh hưởng lớn đến quá trình điện di, vì ảnh hưởng đến sự ion hóa của nhóm silanol, từ đó ảnh hưởng đến dòng EOF, linh độ điện di và thời gian phân tích. Bản thân hệ đệm được chọn để tạo môi trường kiềm nên pH được khảo sát trong khoảng 8,5; 9,0; 9,5; 10 để tìm ra pH tối ưu. Nồng độ đệm Sau khi chọn được hệ đệm và pH tối ưu, tiếp tục khảo sát nồng độ đệm cho khả năng phân tách cao nhất để định lượng các flavonoid. Lần lượt thay đổi nồng độ đệm 25 mM, 50 mM và 75 mM cố định các thông số khác. Nồng độ và bản chất dung môi hữu cơ (methanol, acetonitril) thêm vào dung dịch đệm Khảo sát ảnh hưởng của dung môi hữu cơ thêm vào với các nồng độ lần lượt là 5%, 10%, 15% và 20%. 15 .