Tài liệu đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (coffea canephora)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ---------- NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ---------- NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS Bùi Thanh Tùng Người hướng dẫn 2: PGS.TS Vũ Mạnh Hùng Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ gia đình, bạn bè và toàn thể thầy cô trong khoa. Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các cơ quan, các tổ chức nghiên cứu, tổ chức chính trị của Việt Nam và các nước khác trên thế giới…Đặc biệt hơn nữa là sự hỗ trợ của cán bộ giảng viên các trường đại học và sự giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là PGS.TS Bùi Thanh Tùng và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng và các thầy cô trong Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học. Thầy cô cũng là người luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía trước. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác trong khoa đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong quý thầy cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn. Một lần nữa em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương I: TỔNG QUAN ............................................................................... 2 1. Bệnh tiểu đường ....................................................................................... 2 1.1 Khái niệm .............................................................................................. 2 1.2 Phân loại................................................................................................ 2 1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 ..................................... 3 1.3.1 Thừa cân và béo phì ....................................................................... 3 1.3.2 Tuổi ................................................................................................. 3 1.3.3 Tiền sử gia đình .............................................................................. 4 1.3.4 Yếu tố gen ....................................................................................... 4 1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực ....................................... 4 1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 ................................................. 4 1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường .......................................................... 6 1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường.................................................. 6 1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 .......................................... 6 1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 ........................................... 7 1.7 Dịch tễ học ............................................................................................ 7 2. Mô hình gây tiểu đường .......................................................................... 8 2.1 Tác nhân hóa học .................................................................................. 9 2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường .................................................................. 12 2.3 Tiểu đường do di truyền ..................................................................... 12 3. Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym αglucosidase .................................................................................................. 12 3.1 Enzym và chất ức chế enzym ............................................................. 12 3.2 Enzym α–glucosidase ......................................................................... 13 3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase ................................................ 14 4. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro ................................................................ 16 4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể ........................................................... 16 4.2 Cơ chế chống oxy hóa......................................................................... 17 4.3 Các chất chống oxy hóa ...................................................................... 17 4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro .................... 19 5. Quan niệm về tiểu đường của đông y ................................................... 21 6. Cây cà phê vối (Coffea canephora )– hạt cà phê xanh ........................ 22 6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) ................................................... 22 6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối .................................... 23 Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối ...................................................... 23 6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê .................................................... 24 6.4 Tác dụng dược lý ................................................................................ 26 Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 28 1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28 1.1 Mẫu nghiên cứu .................................................................................. 28 1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ................................................................... 29 1.3 Động vật thí nghiệm ........................................................................... 29 2. Phương tiện nghiên cứu......................................................................... 30 2.1 Hóa chất và thuốc thử ......................................................................... 30 2.2 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 30 3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 31 3.1 Xây dựng mô hình chuột tiểu đường típ 2 .......................................... 31 3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh ............ 32 3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH .......................................................................... 33 3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh.......................................................................................... 35 4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 36 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 37 1. Kết quả .................................................................................................... 37 1.1 Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol ............................ 37 1.2 Xây dựng mô hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm............................... 37 1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm 38 1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH .................................................................................. 41 1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh.......................................................................................... 42 2. Bàn luận .................................................................................................. 44 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................... 47 1. Kết Luận ................................................................................................. 47 2. Đề Xuất.................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl Acetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IC50 IU Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) Đơn vị quốc tế (Interational Unit) mTOR Mammalian target of the rapamycin n-BuOH n-buthanol RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường. ............................................... 6 Hình 1. 3 Công thức hóa học của Streptozocin................................................. 9 Hình 1. 4 Công thức hóa học của Alloxan ...................................................... 10 Hình 1. 5 Công thức hóa học của Acarbose .................................................... 14 Hình 1. 6 Cây cà phê vối (Coffea canephora) ................................................ 23 Hình 1. 7 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic .............................................. 25 Hình 1. 8 Cấu trúc phân tử của Cafein. ........................................................... 25 Hình 2. 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) ................................................ 28 Hình 2. 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora) ................................................. 28 Hình 2. 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss......................................................... 29 Hình 2. 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate ...................... 31 Hình 3. 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic. ............................ 41 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase ...................................................................................................... 15 Bảng 1. 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh .................................................... 18 Bảng 1. 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ..................... 20 Bảng 1. 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea arabica ............................................................................................................ 26 Bảng 3. 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm Alloxan ............................................................................................................ 38 Bảng 3. 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê. ........................ 39 Bảng 3. 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị..................... 40 Bảng 3. 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH. ............................. 42 Bảng 3. 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose. ....... 42 MỞ ĐẦU Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là tiểu đường ngày càng phổ biến và có sự gia tăng về tỉ lệ và mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe. Tiểu đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong và gây ra các biến chứng bệnh trầm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh. Mặc dù đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đường uống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế do các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị của các thuốc đang được sử dụng [60]. Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử dụng các loại thuốc Đông Y hoặc thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc từ tự nhiên do độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có của chúng để giảm bớt các gánh nặng về kinh tế khi sử dụng các thuốc tân dược[40]. Vì vậy, trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng của các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểu đường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trong thời gian kéo dài điển hình như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây Chuối hột [14], [18], [21]. Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khả quan, có thể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [4]. Cây cà phê là loài cây công nghiệp khá phổ biến ở nước ta, được trồng nhiều ở vùng Tây Nguyên. Trong đó, 3 loài cà phê được trồng nhiều nhất ở nước ta là cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea excels). Loài được trồng nhiều, cho năng suất cao là cà phê vối (coffea canephora). Cây cà phê là loài cây thân gỗ hoặc cây bụi chứa nhiều thành phần có tác dụng điều trị nhiều bệnh. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng cây cà phê có tác dụng trên tim mạch, thần kinh, hô hấp… Nhưng qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết của hạt cà phê xanh để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Do đó, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora)” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết hạt cà phê xanh trên mô hình in vivo của chuột nhắt bị tiểu đường bằng Alloxan. 2. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro theo phương pháp DPPH. 3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro. 1 Chương I: TỔNG QUAN 1. Bệnh tiểu đường 1.1 Khái niệm Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) “Tiểu đường là một rối loạn chuyển hóa do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin” [57] Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái Tháo Đường Hoa Kỳ năm 2019 (American Diabetes Association - ADA): “Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc giảm hoạt tính của insulin. Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ thần kinh, tim và mạch máu” [30] Theo hướng dẫn của bộ y tế Việt Nam: “Bệnh tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh” [7] Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa của cơ thể, đặc trưng bởi sự tăng glucose trong máu. Bệnh gây ra nhiều biến chứng phức tạp trên nhiều bộ phận của cơ thể. 1.2 Phân loại Tiểu đường nguyên phát [2], [6], [7], [30] - Tiểu đường típ 1: do phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếu insulin tuyệt đối. - Tiểu đường típ 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin - Tiểu đường thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai. 2 Tiểu đường thứ phát: Bệnh tiểu đường do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng. 1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 Bệnh tiểu đường típ 2 hay còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin thường thấy ở người trên 40 tuổi và có thể trạng béo. Bệnh tiểu đường típ 2 là một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữ yếu tố gen và yếu tố môi trường [24]. 1.3.1 Thừa cân và béo phì Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì (BMI >30 kg/m2) trên thế giới đã được dự đoán là sẽ tăng lên 57% vào năm 2030. Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chất nhóm adipocytokyne. Tất cả những hiện tượng này đều có vai trò gây ra kháng insulin ở gan, mô cơ và làm tăng nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đường [58]. Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25 kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [24]. Đặc điểm của đa số bệnh nhân tiểu đường ở Việt Nam thường có BMI bình thường nhưng lượng mỡ của cơ thể thường cao, đặc biệt là ở phụ nữ [36]. Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy cơ mắc tiểu đường typ 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường. 1.3.2 Tuổi Nguy cơ tiểu đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liên quan tới béo phì và tình trạng ít vận động. Cùng với thời gian, các tế bào β suy yếu do chúng phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulin của cơ thể. Ở châu Á, tỷ lệ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên (độ tuổi lao động sản xuất chính của xã hội). Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nước Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển [55]. Tại Việt nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh tiểu đường tại 4 thành phố lớn thực hiện năm 2003 cho kết quả tỷ lệ mắc tiểu đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là 0,9% còn ở nhóm người 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm người 55-64 tuổi là 10,3%. 3 Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt, có liên quan chặt chẽ đến bệnh tiểu đường. 1.3.3 Tiền sử gia đình Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh tiểu đường, điều này thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh. Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình bị bệnh. Theo một nghiên cứu của Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc tiểu đường thì có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có người thân trong gia đình mắc bệnh tiểu đường [36]. 1.3.4 Yếu tố gen Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục về những ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh tiểu đường. Các cặp sinh đôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng. Sự tương đồng về nguy cơ mắc tiểu đường típ 2 ở người sinh đôi cùng trứng từ 3483% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [57]. 1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực Chế độ dinh dưỡng và luyện tập phù hợp là chìa khóa để chống lại trình trạng béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo glucogen ở gan. Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnh tiểu đường típ 2. Nhóm đối tượng ít vận động (<30 phút/ ngày) có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều. Nhiều nghiên cứu đã có thấy rằng việc vận động thể lực thường xuyên có tác dụng làm giảm nồng độ glucose máu đồng thời giúp duy trì sự ổn định của lipid máu, huyết áp và giúp cải thiện tinh thần. Sự phối hợp các hoạt động thể lực và điều chỉnh chế độ ăn phù hợp có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường típ 2 [58]. 1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 Tiểu đường típ 2 là dạng tiểu đường thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 90% trong số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường. Thông thường, với bệnh tiểu đường típ 2, trong cơ thể vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng insulin được sản xuất 4 ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin [30]. Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết hợp với nhau [30]. Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào trong cơ thể. Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến insulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tế bào. Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thức sau: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi và khả năng ức chế sản xuất glucogen ở gan bị giảm. Thừa cân và béo phì là những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, trong đó béo phì thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động. Axit béo tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây nên tình trạng đề kháng insulin [14]. Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao hơn mức bình thường. Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm. Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình chuyển hóa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình trạng viêm. Thêm vào đó, insulin trong máu cao còn gây hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào sẽ chết theo chu trình. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin. Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan thấp, gan đáp ứng bằng cách giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độ glucose đã cao sẵn sau bữa ăn. Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp làm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao. Trong giai đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm soát nồng độ glucose ngày càng xấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng cho người bệnh [14]. 5 1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường Bệnh tiểu đường nếu không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèm theo. Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của tiểu đường như: Nhiễm toan ceton – thường xảy ra với tiểu đường típ 2, hạ đường huyết – thường gặp bệnh nhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu. Một số biến chứng mãn tính như: Biến chứng mạch máu lớn (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu,..), các bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.)[2], [6]. Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho người bệnh và gia đình người bệnh. Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường. 1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường 1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 [2], [26] Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thể không có khả năng tạo ra insulin. Do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thường xuyên trong suốt cuộc đời để bổ xung đủ lượng insulin cho cơ thể. 6 1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 [2], [26] Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea: gliclazid, glibenclamid, glimepiride… - Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng insulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộc nhóm này); nhóm thiazolidinedion. - Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol làm hấp thu chậm glucose từ ruột vào máu. Đối với bệnh nhân tiểu đường típ 2, ngoài uống thuốc điều trị cần phải kết hợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt nhất. Chế độ ăn lành mạnh là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu đường, cần lựa chọn các loại thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có nguồn gốc thực vật, ăn nhiều trái cây, ít chất béo. Chế độ tập luyện thường xuyên sẽ giúp cải thiện sức khỏe, giúp chống lại bệnh tật nhất là các bệnh về tim mạch, xương khớp. Vận động thường xuyên giúp tăng cường sức khỏe, giảm cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường [58]. Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lý kèm theo cũng như thể trạng khác nhau nên việc kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu. 1.7 Dịch tễ học Bệnh tiểu đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước phát triển và đang phát triển gây ra các gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêm trọng. Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, là nguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận. Tiểu đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từ những năm đầu của thế kỷ 21. Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Tiểu đường Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2015 toàn thế giới có 415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh tiểu đường (tiểu đường), tương đương cứ 11 người có 1 người bị tiểu đường. Năm 2017 dân số thế giới là 7,5 tỷ người trong đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh tiểu đường. Dự tính đến năm 7 2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị tiểu đường [8] và đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị tiểu đường thì có một người không được chẩn đoán. Đông Nam Á có số người trưởng thành bị tiểu đường cao thứ hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị tiểu đường trên thế giới, trong đó khoảng 45,8% các trường hợp bị tiểu đường không được chẩn đoán và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh tiểu đường sống ở các thành phố [42]. Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống tiểu đường quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000 người trong độ tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc tiểu đường trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ tiểu đường năm 2012 là 2,7%. Ngoài ra, tỷ lệ tiểu đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng lên tới 63,6% [3]. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trong cả nước là 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói 1,9% (năm 2003). Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, hiệp hội Nội tiết – Tiểu đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độ tuổi 20-79. Và tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá. Nhưng một điều đáng mừng là có tới 70% trường hợp tiểu đường típ 2 có thể dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [8]. 2. Mô hình gây tiểu đường Thử nghiệm tiểu đường trên mô hình động vật là điều cần thiết để nâng cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ đó tìm ra các liệu pháp và các phương pháp điều trị mới. Hầu hết các mô hình hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm làm đối tượng thí nghiệm do nhiều ưu điểm của chúng như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chi phí thấp. Bệnh tiểu đường thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí nghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, di truyền [45]. 8 2.1 Tác nhân hóa học Các tác nhân hóa học gây ra tiểu đường có thể phân thành ba loại: phá hủy tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm chuyển hóa insulin trong mô đích. Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh tiểu đường và giúp ích cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh. Các loại thuốc này có thể được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da. Liều cần thiết để gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng thuốc và tình trạng dinh dưỡng. Tùy theo liều dùng của các thuốc này mà các hội chứng tương tự như tiểu đường típ 1, tiểu đường típ 2 hoặc không dung nạp glucose có thể được gây ra. Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều qua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng có sự khác nhau về cơ chế hoạt động [45].  Streptozotocin Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosamine nitrosorea, có công thức hóa học là C8H15N3O7, đã được thử nghiệm lâm sàng từ năm 1967. STZ tồn tại trong tự nhiên, chúng có khả năng gây độc đặc hiệu với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú. STZ được phát hiện có trong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm 50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một số ung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây tiểu đường được sử dụng phổ biến nhất và có hiệu quả trên các mô hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu y học [56] . Hình 1. 2 Công thức hóa học của Streptozocin 9 STZ xâm nhập vào tế bào β đảo tụy thông qua chất vật chuyển glucose GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngoài ra, STZ còn gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid. Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [45]. Sử dụng STZ trong mô hình bằng nhiều phương pháp: - STZ cho chuột mới sinh: Mô hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của tiểu đường típ 2 như làm giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ/ trung bình/ nặng. Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặc điểm bài tiết insulin ở bệnh nhân tiểu đường típ 2 [31], [61]. - Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đó bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [52]. Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây mô hình động vật tiểu đường típ 1 hoặc tiểu đường típ 2. Liều trên chuột nhắt dao động từ 100 - 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40 - 100 mg/kg [28]. Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn ở tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội mô.  Alloxan Alloxan, đôi khi được gọi là alloxan hydrate; 2,4,5,6-Tetraoxypyrimidine; 2,4,5,6-pỷimidinetetrone; Axit 5,5-dihydroxybarbituric. Nó là dẫn xuất của axit uric, không bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3. Hình 1. 3 Công thức hóa học của Alloxan 10 Alloxan cũng giống như streptozotocin là những hóa chất gây tiểu đường nổi bật nhất trong nghiên cứu bệnh tiểu đường. Cả hai đều là chất tương tự glucose gây độc tế bào. Mặc dù độc tính tế bào của chúng đạt được thông qua các con đường khác nhau, cơ chế hoạt động chọn lọc tế bào β của chúng là giống hệt nhau. Alloxan tác động trên tế bào qua bốn giai đoạn [54]: Giai đoạn thứ nhất: hạ đường huyết thoáng qua đầu tiên lên đến 30 phút bắt đầu trong vòng vài phút sau khi tiêm Alloxan. Phản ứng hạ đường huyết trong thời gian ngắn này là kết quả của sự kích thích thoáng qua bài tiết insulin, được ghi nhận bằng sự gia tăng nồng độ insulin trong huyết tương. Cơ chế cơ bản của chúng là giảm tiêu thụ tạm thời và tăng khả năng tiêu thụ ATP do ức chế quá trình phosphoryl hóa glucose thông qua ức chế glucokinase. Giai đoạn hạ đường huyết thoáng qua ban đầu này không được quan sát khi gây mô hình tiểu đường bằng streptozotocin, vì streptozotocin không ức chế glucokinase. Sự thay đổi hình thái là tối thiểu trong giai đoạn này. Giai đoạn thứ hai bắt đầu với sự gia tăng nồng độ glucose trong máu, 1 giờ sau khi tiêm alloxan và giảm insulin huyết tương. Giai đoạn tăng đường huyết này, thường kéo dài 2 - 4 giờ, được gây ra bởi sự ức chế bài tiết insulin dẫn đến hạ đường huyết. Trong giai đoạn này, các tế bào β cho thấy các đặc điểm hình thái thay đổi như: không bào nội bào, giãn màng lưới nội chất thô, giảm diện tích Golgi, giảm bài tiết và hàm lượng insulin, ty thể bị sưng… Giai đoạn thứ ba, một lần nữa là giai đoạn hạ đường huyết, thường xảy ra sau khi tiêm alloxan và kéo dài vài giờ. Nó có thể gây co giật và thậm chí có thể gây tử vong nếu không sử dụng glucose, đặc biệt là khi glycogen ở gan bị cạn kiệt do đói. Sự hạ đường huyết nghiêm trọng này được tạo ra do lưu thông insulin (kết quả của việc tiết ra chất độc làm vỡ màng tế bào). Ngoài những thay đổi về hình thái được thấy trong giai đoạn đầu tiên, các nhân tế bào β có hình chóp và không có màu dương tính với TUNEL. Giai đoạn thứ tư là giai đoạn tăng đường huyết vĩnh viễn. Sự thoái hóa hoàn toàn và mất tính toàn vẹn của tế bào β được nhìn thấy trong 48-72 giờ sau khi tiêm Alloxan. Các tế bào khác vẫn còn nguyên vẹn, thể hiện tính chất chọn lọc tế bào β. Các mảnh vụn tế bào có nguồn gốc từ các tế bào β bị phá hủy được loại bỏ bởi các đại thực bào. 11