Tài liệu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật and mã vạch

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4 1.1. Chi Codonopsis ............................................................................................ 4 1.1.1. Phân loại học .......................................................................................... 4 1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố .................................................... 4 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền…………….. ............................................................................................. 8 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) ........................................... 11 1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu .. 13 1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật ..................................................................... 13 1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật ...................................................................... 14 1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật ..................................................... 19 1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung ............................................................. 19 1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu ........................ 24 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 32 2.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................... 32 2.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................... 32 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 32 2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 33 2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 33 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số........................................................................ 33 2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết ................................................. 34 2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR ............................. 35 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự .............................................. 36 2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu .............................................................. 37 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 38 3.1. Tách chiết ADN tổng số............................................................................. 38 iii 3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ........................... 39 3.3. Phân tích kết quả ....................................................................................... 40 3.3.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu ......... 41 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ....................................................... 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 65 iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN như một công cụ nhận diện [25] ....................................................................................................... 21 Bảng 2. Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong giai đoạn dự kiến năm 2011 [30] .................................................................................. 23 Bảng 3. Những cặp mồi được sử dụng thông dụng trong việc khuyếch đại và giải trình tự các mã vạch ADN .................................................................................... 26 Bảng 4. Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu ................. 32 Bảng 5. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu .................................................... 33 Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................ 35 Bảng 7. Chu trình nhiệt cho gen ITS ...................................................................... 35 Bảng 8. Chu trình nhiệt cho gen matK ................................................................... 35 Bảng 9. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu .................................................... 39 Bảng 10. Bảng thống kê các điểm sai khác trong trình tự ADN giữa các loài Codonopsis trên vùng gen ITS ............................................................................... 45 Bảng 11. Tỷ lệ % nhận diện của gen ITS (nửa trên đường chéo) và số khác biệt (nửa dưới đường chéo) của 21 mẫu Codonopsis ............................................................ 50 Bảng 12. Bảng thống kê các điểm đa hình trong trình tự gen matK giữa các loài Codonopsis nghiên cứu ......................................................................................... 53 Bảng 13. Tỷ lệ phần trăm nhận diện của gen matK (nửa trên đường chéo) và số khác biệt giữa các loài (nửa dưới đường chéo) của 16 mẫu Codonopsis ......................... 56 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Loài Codonopsis pilosula ........................................................................... 5 Hình 2. Hoa của loài C. javanica ............................................................................ 6 Hình 3. Codonopsis tangsheng................................................................................ 7 Hình 4. Hoa của các loài (a) C. nervosa (b) C.lanceolata (c) C. ussuriensis ............ 7 Hình 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 1kb .................................................................................................... ..…..38 Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 100bp ........................................................................ 40 Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1% ...................................................................................................... 40 Hình 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 ............................................ 58 Hình 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93......................................... 59 Hình 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ………....................................................................................................................60 Hình 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ……………………………………………………………………………………..61 vi BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotit triphosphat EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Axit ethylene diamine tetraacetic Acid Kb Kilobase (= 1000 bp) 1000 cặp bazơ MP Maximum Parsimony Thuật toán tiết kiệm tối đa OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối mtDNA mitochondrial DNA ADN ty thể IGS intergenic spacer vùng liên gen vii MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau. Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8], [47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô 1 tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị. Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên gia về hình thái dược liệu. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62]. Công việc này nối tiếp các thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13]. Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các nghiên cứu về ADN. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66]. Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc. ADN nhân và lạp thể được khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu loài. “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự 2 đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chi Codonopsis Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm. Đây là chi thực vật hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông. Chi này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á. Codonopsis được coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75]. 1.1.1. Phân loại học Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:  Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)  Giới: Plantae (Thực vật)  Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)  Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)  Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)  Phân lớp: Asteriades  Bộ: Asterales (Bộ Cúc)  Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)  Phân họ: Campanuloideae  Chi: Codonopsis 1.1.2. Sơ lƣợc đặc điểm hình thái và phân bố Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn [1]. Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông. Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu 4 xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hình 1. Hình thái loài Codonopsis pilosula Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng. Trên thế giới, chi Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm.Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có: - Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá. Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng 5 9 tháng 10. Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi là Phòng đảng sâm. - Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hình 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng Hình 2. Hoa của loài C. javanica hoặc hơi vàng, họng có vân tím. Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5. Quả nang, màu tím, chứa nhiều hạt hình trái xoan, màu vàng bóng. Cây mọc hoang ở vùng núi cao, chỗ ẩm mát, nhiều mùn. Có nhiều ở Hoàng Liên Sơn,Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Tuyên Quang, còn ở Cao Bằng, Lạng Sơn thì ít hơn, ở các tỉnh phía nam chỉ thấy ở cao nguyên Langbian (Lâm Đồng), xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Giây-Kon Tum và Quảng Nam- Đà Nẵng). Ở miền núi, người dân tộc đã trồng xen Codonopsis với ngô, cho kết quả tốt. - Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim), ở trên thân có nhiều lông gai ngắn, đến lúc già thì tự rụng. Lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 – 3 cm, hai mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn, Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong có nếp nhăn ngắn. Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. - Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân leo bò. Thân lá đều có lông dài, lá hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa. Cánh hoa sâu, 6 dài bằng nửa ống hoa, tràng hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. - Xuyên đảng sâm (Codonopsis tangshen Oliv); hình thái cơ bản giống loài C. pilosula (Franch) Nannf nhưng lá hình trứng hay hình trứng đuôi nhọn, mặt lá không có lông, chỉ rìa lá có lông nhung. Sau khi ra hoa (Hình 3) thì có quả đuôi màu trắng tím, trong hoa có sọc nhỏ màu tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại trên, ở chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả chín không nứt. Có nhiều ở tỉnh Tứ Xuyên, Hình 3. Hoa Codonopsis tangsheng Trung Quốc. - Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf), thuộc cây thảo, thân đứng thẳng, sống nhiều năm. Rễ cọc đâm thẳng xuống, trong có lõi gỗ bằng nửa thể tích củ, cao độ 20cm, nhỏ bé lông thô dày. Lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép nguyên, hai mặt đều có lông. Hoa (Hình 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm, màu lam nhạt, trong có thới màu tím đậm. Có ở khu tự trị dân tộc Tạng A-pa và chuyên khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. Hình 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis lanceolata, và (c) C. ussuriensis. 7 Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hình 4b) có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hình 4c) có rễ hình củ tròn, thường được trộn lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc; còn ở phía Nam, chỉ có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng và Lâm Đồng [4], [2]. 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ. Vào mùa đông, lúc cây đã úa vàng, rụng lá hoặc tới đầu xuân năm sau lúc cây chưa đâm chồi nảy lộc là có thể thu hoạch, lúc này phẩm chất Codonopsis tốt nhất, sản lượng cao; đào rễ phải dài sâu trên 0,7m, vì rễ rất dài, không làm trầy xát. Rửa sạch đất cát, phân loại rễ to nhỏ để riêng, phơi riêng trên gìan từng loại đến lúc nào rễ bẻ không gãy là đạt bó từng bó đem phơi.. Dựa vào chất lượng của rễ sau khi thu hoạch, người ta chia ra làm 5 loại sau: - Tây đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi đều tròn, màu vàng hay xám, thịt rễ có màu ánh vàng, có vân tròn, đường kính từ 13mm trở lên, không lẫn rễ con. - Đông đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi tròn với ít nếp nhăn, vỏ màu vàng xám hay nâu xám, thịt màu trắng vàng, thoáng có vân tròn, đường kính từ 10mm trở lên. - Lộ đảng sâm: khô, nhiều đường, mềm, rễ dài, vỏ màu vàng hay màu vàng xám, thịt màu vàng nâu hay màu vàng, đường kính trên 10mm. - Điều đảng sâm: khô, có chất đường, hình trụ tròn, vỏ khô màu vàng, thịt màu trắng hay màu vàng trắng, đường kính 12mm trở lên. - Bạch đảng sâm: khô, tương đối cứng, ít đường, hình dạng rễ không thống nhất, vỏ màu vàng xám hay màu trắng vàng, thô mập, đường kính 10mm trở lên. 8 Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy sucrose, glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin, nhiều loại alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-Dglucopyranoside, ethyl a-D-fructofuranoide, tangshenoside I, choline. Về nghiên cứu tác dụng dược lý về Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành phần của chúng có thể được tóm lược như sau: - Tác dụng tăng lực: thực nghiệm cho thấy Codonopsis có tác dụng chống mỏi mệt và tăng sự thích nghi của súc vật trong môi trường nhiệt độ cao. Thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Codonopsis có tác dụng làm tăng sự thích ứng của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí [5]. - Đối với hệ tiêu hóa: dịch chiết Codonopsis làm tăng trương lực của hồi tràng chuột, nồng độ thuốc tăng lên thì trương lực cũng tăng theo. Dịch Codonopsis có tác dụng đối kháng (đối vận) với serotonin (5-HT) gây co bóp ruột nhưng không kháng với acetylcholine. Codonopsis có tác dụng bảo vệ rõ rệt với 4 mô hình gây loét bao tử ở súc vật: gây loét do kích thích, gây viêm, gây loét do acid acetic, loét do thắt môn vị [5]. - Đối với hệ tim mạch: tiêm tĩnh mạch dịch chiết Codonopsis với liều 2g/kg cho mèo gây mê có tác dụng tăng co bóp tim, tăng lưu lượng máu tới não, chân và nội tạng. Truyền 20-25ml dịch Codonopsis với tỉ lệ 1:1 cho thỏ bị gây choáng do mất máu, có tác dụng nâng áp, áp lực trung tâm hạ, nhịp tim chậm lại. Khi đối chiếu với các dịch chiết nhân sâm, cam thảo, tác dụng nâng áp của Codonopsis cao hơn. Ngoài ra, tác dụng hạ áp của Codonopsis trên súc vật là do tác dụng giãn mạch ngoại vi và tác dụng ức chế adrenalin của thuốc gây nên. - Đối với máu và hệ thống tạo máu: dịch chiết cồn và nước sắc Codonopsis có tác dụng làm tăng số hồng cầu, làm giảm số bạch cầu trong đó lượng bạch cầu trung tính tăng còn lượng tế bào lâm ba lại giảm. Dịch tiêm Codonopsis làm tăng nhanh sự đông máu (không có tác dụng tán huyết)[5]. - Đối với điều hòa huyết áp: Tiêm mạch máu dịch Codonopsis 20% (chiết bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy gây hạ huyết áp, trong 9 khi các lô đối chứng được tiêm 4,8% glucose và dung dịch sinh lý thì không thấy hạ huyết áp, do đó hiện tượng hạ huyết áp của dịch Codonopsis có lẽ không liên quan đến thành phần đường của nó. Codonopsis còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao huyết áp gây ra do adrenalin [5]. - Đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Codonopsis tiêm bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột đều có tác dụng làm tăng số lượng thực bào rõ rệt, khả năng thực bào cũng tăng. - Đối với hệ thần kinh trung ương: cho chuột dùng Codonopsis với liều 67mcg/kg thấy có tác dụng ức chế. Ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn. Trong mô hình thực nghiệm „in vitro‟, Codonopsis có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau đối với não mô cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu, trực khuẩn đại tràng, tụ cầu khuẩn vàng, trực khuẩn lao ở người. Codonopsis cũng được tìm thấy còn có tác dụng làm hưng phấn tử cung ở chuột cống, phát triển nội mạc tử cung, gây tăng trương lực cổ tử cung, tiết sữa ở súc vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương, nâng cao đường huyết [75]. Trong Y học cổ truyền Việt Nam, Codonopsis được ghi nhận có tác dụng bổ trung ích khí, sinh tân, dưỡng huyết. Chủ trị chứng huyết hư hoặc khí huyết lưỡng hư, không có sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang, trị trung khí suy nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh, trị thiếu máu mạn, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng, trị hư lao, nội thương, phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản [1]. Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng với nạn tàn phá rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng phân bố tự nhiên của các loài này bị thu hẹp nhanh chóng. Với giá thành rẻ hơn Nhân sâm, lại có nhiều tác dụng giống Nhân Sâm, một số sản phẩm từ Codonopsis được thay thế bởi rễ củ phơi khô của một số loài cây khác có hình thái tương tự như cây Thương lục (Phytolacca acinosa Roxb. ) hoặc cây Tục đoạn (Dipsacus 10 japonicus) do các lợi ích về kinh tế hoặc do nhầm lẫn khi thu hái trong tự nhiên và phân loại sản phẩm. Trong đó nguy hiểm nhất là sự nhầm lẫn với cây Thương lục, bởi đây là loài cây có độc ở tất cả các bộ phận, các tài liệu [1] [4] [5] đều có ghi chú về sự nhầm lẫn chết người này. Trong sách Trồng hái và dùng cây thuốc của Lê Trần Đức, NXB Nông nghiệp in năm 1984 đã từng lưu ý: “Hiện nay củ thương lục được bán ở Hà Nội và chở vào miền Nam bán với tên giả mạo hồng sâm hay phòng sâm. Củ thương lục chính là một vị thuốc công hạ mãnh liệt, có thể gây sảy thai... Dù người khỏe mạnh mà dùng thì cũng tổn thương gân cốt và hại thận”. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với các mục đích chính: 1. Đánh giá tính đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis được thu thập tại Việt Nam. 2. Xác định các mã vạch có khả năng phân biệt, nhận dạng được các loài thuộc chi Codonopsis, cùng với chỉ thị hình thái, trở thành công cụ ứng dụng hữu hiệu trong kiểm định dược liệu. 3. Góp phần bảo tồn nguồn gen của loài cây thuốc quý hiếm đang được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam. 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [36]; ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện được bởi các chuyên gia hình thái học; việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [29]. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và 11 được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen. Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây chủng loại phát sinh cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi. Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng loài như sử dụng enzym giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN (ADN fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, và đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến. Các phương pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống nhau và sự khác biệt đặc trưng duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp bazơ. Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài. Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm [59]. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được. Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn. Theo The Barcode of Life Data Systems (http://www.boldsystems.org) năm 2011 đã lưu trữ được hơn 1.100.000 DNA barcoding từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau. Trong 10 năm qua, đã có hơn 180.000 trình tự ADN barcode của thực vật được lưu giữ trong Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau. Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN có thể làm mã 12 vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [16], [25], [28], [44]. Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau : (i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật; (ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao; (iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài. 1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật Việc lựa chọn các vùng ADN mã vạch liên quan đến việc lựa chọn một hoặc một vài locut có thể thu được trình tự thường xuyên và đáng tin cậy trong bộ mẫu lớn và đa dạng, đưa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp phân biệt các loài với nhau; hay có thể nói đây là vùng thông tin di truyền có ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thông tin nhận dạng: nó thường phải đủ dài để chứa đủ thông tin có thể phân biệt giữa các loài nhưng đủ ngắn để thuận tiện cho phân tích. Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do đáp ứng được các tiêu chí này [29]. Đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt cao. Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào. Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài [78] Chẳng hạn ở các loài linh trưởng, hệ gen mỗi tế bào có khoảng 4 tỷ cặp bp. Mã vạch gen ty thể CO1 (mã hóa cho tiểu đơn vị của cytochrome oxidase) chỉ có kích thước 648 bp, nhưng từ người tới tinh tinh và các loài vượn khác, sự khác biệt của CO1 là vừa đủ để phân biệt giữa mỗi loài. Loài người khác hai loài còn lại ở một hoặc hai cặp base trong vùng mã vạch, nhưng khác biệt ở cả hệ gen người với tinh tinh, là khoảng 60 vị trí và với khỉ đột là khoảng 70 vị trí [59]. Đối với công nghệ mã vạch ADN, hệ gen ti thể cũng tỏ ra đặc biệt phù hợp do sự khác biệt giữa các loài là nhiều hơn so với DNA hệ gen nhân. Vì đó, một số phân đoạn ngắn ADN 13