TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Đặt vấn đề:
Nhân sâm Panax ginseng C.
ngàn năm nay.
. Meyer là cây dược liệu được sử dụng từ hàng
hững tác dụng y học của
hân Sâm, được dùng trong y học cổ
truyền, hiện đã được chứng minh theo nguyên lý của y học hiện đại.
hân Sâm từ
cây thuốc huyền thoại của phương Đông đã xuất hiện rộng rãi ở phương Tây, với
những sản phẩm thương mại đa dạng.
hân Sâm ngày nay là cây thuốc mang lại giá
trị kinh tế to lớn.
Việt am tự hào có được một loài hân Sâm đặc hữu là Sâm gọc inh (hay
còn gọi là Sâm hu
ăm) Panax vietnamensis
a & Grutzv., được biết đến trên thế
giới với tên gọi Vietnamese ginseng. Sâm gọc inh có thành phần ginsenosid, dược
chất chính trong
hân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác
của chi Panax trên thế giới. Tuy nhiên, Sâm
gọc inh được phát hiện khá muộn
(vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá này
nhưng tiềm năng của Sâm
gọc inh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức. Cộng với
địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi gọc inh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm
gọc inh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Với nỗ lực của những địa phương
có Sâm gọc inh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt.
hưng để đưa Sâm gọc inh thành cây thuốc ngang hàng với các loại hân sâm có
trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu
chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả.
Trên thế giới, cây
hân Sâm Panax ginseng C. . Meyer đã được nhân giống
và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô. Ginsenosid chiết từ
mô sẹo trong nuôi cấy mô cây hân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ hân
Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bột
ginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ
hân Sâm tự
nhiên. Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuất
ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng
rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời gian
trồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh...
SVT : G YỄ T Ị T
1
TỐT G IỆP
Sâm
gọc
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
inh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng
nhưng không có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó. Việt
am cần
tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế
của Sâm gọc inh. Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa
nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm
gọc inh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể
bỏ qua kỹ thuật này. Thực tế, cây Sâm
mô sẹo.
gọc inh đã được nhân giống thành công từ
hưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm gọc inh bằng nuôi
cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố.
Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những
công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và
sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công
nghệ nuôi cấy tế bào Sâm
gọc Linh (Panax vietnamensis
a et Grushv.) dưới sự
hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh.
1.2. Mục đích của đề tài:
-
Tổng quan về Sâm gọc Linh.
-
Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm gọc Linh.
SVT : G YỄ T Ị T
2
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ
phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan
) trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:
-
Dựa vào tính toàn năng của tế bào:
Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Mỗi tế
bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên
biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết.
-
Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể
hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại
trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá
trình phản biệt hóa. Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao
nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
ngh a:
-
Nhân nhanh giống cây trồng.
-
Bảo quản nguồn gen.
-
Tạo cây sạch bệnh.
-
Sản xuất các hoạt chất sinh học.
-
Mang tính công nghiệp
c ch
SVT : G YỄ T Ị T
hát tri n:
3
TỐT G IỆP
-
1 5:
obert
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
ooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra
khái niệm tế bào.
-
1838: Matthias Schleiden và Theodore Sch ann đề xướng học thuyết tế bào.
-
1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải.
-
19
-
1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát
: ogl xác định vai trò của I
.
sinh cơ quan.
-
195 : Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công.
-
19
-
19 : Guha và Mahesh ari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn
: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt.
-
19 9: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của
Hapopappus gracilis.
-
197 : Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.
-
1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần.
-
1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ
cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng ithospermum spp.
Mitsui .0Petrochemicals.
-
1988: lein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen.
-
199 : Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen lavrSavr.
2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy
2.1.2.1. Nuôi cấy hôi
Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng.
giai đoạn dị dưỡng
cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển.
Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho
nhiều kết quả tốt hơn.
goài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt,
casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa
sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự
phát triển của phôi.
hiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi
nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên.
SVT : G YỄ T Ị T
4
hiệt độ 5 ±
o
C
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh
trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng .000
lux hoặc hơn trong giờ chiếu sáng suốt
ngày nuôi đầu tiên.
ỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:
-
hân giống cây trồng.
-
Thử sức sống của phôi hạt.
-
Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa.
-
Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi.
2.1.2.2. Nuôi cấy mô và c
uan tách r i
Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc
biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển.
hu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau
nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa
lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát
triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.
Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng
acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa
sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp
các chất này.
uôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:
-
ghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây.
-
Nhân cây invitro.
-
Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến
soma,
2.1.2.3. Nuôi cấy mô phân sinh
SVT : G YỄ T Ị T
5
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không
bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus. Mô phân
sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường
tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non.
Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng.
Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ
thì bổ sung auxin.
uôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:
-
Tạo cây sạch virus.
-
hân giống invitro.
-
Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.
ghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
2.1.2.4. Nuôi cấy bao hấn và hạt hấn
Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường
nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ
khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội.
ạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều
kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo
mô sẹo và tạo cơ quan. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc
tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương
pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân
tạo.
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của
bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Quá trình
sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi
trường. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu
chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu
gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.
uôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:
SVT : G YỄ T Ị T
6
TỐT G IỆP
-
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
ghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử.
Chọn các dòng đột biến.
2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đ n
Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme.
Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho
sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối.
Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác
nhau. Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất
nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào.
uôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:
-
Chọn dòng tế bào.
-
Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều
kiện khác nhau.
-
Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp.
2.1.2.6. Nuôi cấy roto a t
Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học
hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh
thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật
tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật
độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế
bào/1ml môi trường).
Ứng dụng nuôi cấy protopast:
-
Tạo ra cây lai soma.
-
Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể
được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
-
Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào.
2.1.3. Môi tr
ng nuôi cấy
SVT : G YỄ T Ị T
7
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau:
-
Muối khoáng đa lượng.
-
Muối khoáng vi lượng
-
Vitamin.
-
guồn carbon.
-
Chất điều hòa sinh trưởng.
-
Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết
nấm men,
) và agar.
Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại:
-
Môi trường ngh o dinh dưỡng: White, Knop.
-
Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg.
-
Môi trường giàu dinh dưỡng: MS.
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần
cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài
và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm
thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.
Tế bào mô thực vật đòi hỏi p tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi
cấy. Độ p
của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận
các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ p
trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng aO
chỉnh độ p .
2.1.4. Các chất điều hòa inh tr ởng thực vật
SVT : G YỄ T Ị T
8
hay
môi
Cl loãng để điều
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
2.1.4.1. Auxin
uxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi
cấy mô thực vật. I
là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn
, IB , , -D
là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn.
Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non
khác của cây.
Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
-
iểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.
-
àm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
-
hả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
-
Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
-
Đặc tính của auxin.
Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin:
-
ích thích phân chia và kéo dài tế bào.
Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên.
ích thích sự phân hoá của các mô dẫn.
Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và
chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.
-
Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).
ích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp).
Tạo phôi soma ( , -D).
2.1.4.2. Cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường
xuyên nhất là B P, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn B và kinetin là các
cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong aO hoặc Cl loãng.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các
hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần
có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản
chồi và chồi nách.
Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non.
Chức năng chủ yếu của các cytokinin:
SVT : G YỄ T Ị T
9
TỐT G IỆP
ích thích phân chia tế bào.
-
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Tạo và nhân callus.
-
ích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô.
-
ích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh .
-
àm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào.
-
Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài.
-
Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) .
-
Ức chế sự hình thành rễ.
-
Ức chế sự kéo dài chồi.
-
Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục.
2.1.4.3. Gibberellin
Trong số hơn 0 chất thuộc nhóm gibberellin, G
nhiều hơn cả trong thực tiễn. G
tính.. G
là chất được sử dụng
kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô
có tính hoà tan trong nước.
Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt.
Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:
-
ích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào.
-
Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống.
-
iểm soát sự ra hoa của các cây
-
Ức chế sự hình thành rễ bất định.
-
năm tuổi.
ích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm.
Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và
củ).
-
ích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn.
-
Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt.
-
Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi.
2.1.4.4. Abscisic acid (ABA)
bscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra
trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid.
Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt.
Các tác dụng cơ bản của B là:
SVT : G YỄ T Ị T
10
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
-
ích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả
-
B
thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước
và nhiệt độ thấp đóng băng.
ích thích sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm
của hạt.
-
Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành.
-
Gây ra sự đóng khí khổng.
2.1.4.5. Ethylene
Ethylene là một loại khí hiện diện trong bầu khí quyển với một nồng độ rất
thấp. Ethylene được sinh ra bởi những mô thực vật còn sống và có vai trò điều hòa
sự phát triển ở thực vật. Chúng được tạo ra ở các bộ phận như mô phân sinh đỉnh rễ,
chồi, nốt lá, hoa hóa già, quả chín.
Các chức năng cơ bản của ethylene:
-
Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả.
àm chín quả.
Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng,
lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh.
-
Điều khiển sự chín của một số loại quả.
-
Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa,
một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
-
ích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá.
2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.5.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng,... rất thích hợp cho các
loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so
với tế bào thực vật.
-
Dụng cụ thuỷ tinh: ửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 1 1 oC/15 phút.
út đậy: Sử dụng nút cao su.
út được nhét bông gòn không thấm nước để
bụi và không khí không được đi qua. Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 1 1 oC/15
phút.
SVT : G YỄ T Ị T
11
TỐT G IỆP
-
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch
bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm.
-
Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,...
-
Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy.
-
Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 1 1 oC, 1atm trong 30
phút.
Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng
sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi
đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được.
2.1.5.2. Chọn đúng môi tr
ng và chuẩn b môi tr
ng đúng cách
Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi
cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực
nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,
vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào
của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường
nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn
hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất
nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor.
hiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng
phin lọc micropore để khử trùng.
Có
nguồn nhiễm tạp chính:
-
Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
-
Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy.
-
Trong quá trình thao tác.
SVT : G YỄ T Ị T
12
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Bảng 2.1: Th i gian tối thi u đ hấ kh trùng môi tr
ng nuôi cấy mô ở
1210C.
Th tích môi tr
ng (ml)
Th i gian tối thi u (phút)
20-25
24
50
26
100
28.5
250
31.5
500
35
1000
40
2000
48
3000
55
4000
63
2.1.5.3. Chọn mô cấy và x
ý đúng cách
Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô
trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ.
hi bắt
đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các
chồi nách và mô phân sinh ngọn.
guồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong
việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. ấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các
chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn
cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như
nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các
nguyên liệu thực vật khác.
Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp
vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà
phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng
sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như T een - 20, xà phòng.
Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất.
SVT : G YỄ T Ị T
13
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
goài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang
khử trùng.
Qui trình khử trùng bề mặt:
-
ửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng.
-
ửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút.
-
húng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp
lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng.
-
Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng.
Bảng 2.2: Nồng độ và th i gian
dụng 1 ố chất x
í mô cấy thực vật:
Th i gian kh
Stt
Chất kh trùng
Nồng độ
1
Hypochlorite calcium
9-10%
5-30
ất tốt
2
Hypochlorite sodium
0,5-5%
5-30
ất tốt
1-2%
2-10
Rất tốt
3
ước bromine
trùng (phút)
Hiệu uả
4
Oxy già
3-12%
5-15
Tốt
5
Chlorua thủy ngân
0,1-1%
2-10
Tốt
1%
5-30
Tốt
4-50mg/l
30-60
khá
6
itrate bạc
7
Kháng sinh
SVT : G YỄ T Ị T
14
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
2.2. Giới thiệu cây âm Ngọc Linh
2.2.1. Phân oại
L ch
Việt
thuộc họ
hân oại:
am có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm.
hưng chỉ có bốn loài Sâm
hân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây
gingseng C. A. Meyer là Sâm
gọc
hân Sâm Panax
inh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ
Diệp, đều là các cây thuốc quý.
ăm 19 8,
S. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm
gọc inh và tạm đặt tên nó là Sâm
Ban dân y
hu 5 do DS. Đào
hu 5.
gọc Linh tại vùng núi
ăm 197 , đoàn điều tra cây thuốc của
im ong dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc
hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi
gọc inh và tạm đặt tên là
Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae)
( guyễn Minh Đức,
00 ). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax
vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm
amarov ( iên Xô trước đây) nǎm 1985 do
raliaceae, công bố tại Viện thực vật
à Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt
tên (internet 4).
Hình 2.1: âm Ngọc Linh ngoài tự nhiên
SVT : G YỄ T Ị T
15
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
Phân oại:
-
Giới: Plantae
-
Ngành: Magnoliophyta
-
Bộ: Apiales
-
ọ: Cam Tùng (Araliaceae)
-
Chi: Panax
-
Loài: Panax
-
Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush
-
Tên khác: Sâm Việt
am, Sâm
gọc inh, Sâm
hu
ăm, Thuốc Dấu (Xê
Đăng).
-
Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.
Hình 2.2: Hình thái âm Ngọc Linh
2.2.2. Đặc đi m hình thái
Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m.
Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài
30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh
hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có
một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần
phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất.
ình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây
sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang
SVT : G YỄ T Ị T
16
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng
trưởng hàng năm rất r rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và
dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Sâm
gọc
inh trồng thường cao đến 1 m
mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường.
Thân khí sinh mảnh, th ng màu xanh hay hơi tím, mọc th ng, mang 2 -
lá
kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài
10 - 1 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía
răng nhỏ.
oa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 0 cm có
thể k m 1 -
tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính.
oa nhiều màu lục
vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá th ng với thân. Mỗi tán 0 - 100 hoa, cuống
hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy.
Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.
Lá kép, chân vịt mọc vòng với -5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá
chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.
Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình
thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi l m, có vân, quả mọc tập trung ở trung
tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt,
một số quả chứa
hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 0 quả.
Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9.
Hình 2.3: Cây âm Ngọc Linh
SVT : G YỄ T Ị T
17
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
2.2.3. inh thái và hân bố
Đặc đi m inh thái:
Sâm
gọc inh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao
từ 1. 00 – .100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ
dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây
mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 000 mm/ năm. Đất rừng ở đây
được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao
và chứa nhiều nước.
Sâm
gọc inh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân h . Mùa hoa quả từ tháng
5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống
đất, tồn tại qua mùa đông khoảng
tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau,
Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt.
Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo r . Mỗi năm từ
đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn
cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm.
Đặc đi m hân bố:
Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi hân Sâm (Panax), ở Việt
am có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm
gọc inh được
phát hiện sau cùng vào 197 . Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối
với khoa học. Đến nay Sâm
gọc inh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi
gọc inh thuộc hai tỉnh Quảng am và on Tum.
gọc inh là dãy núi cao thứ hai của Việt
am, có tọa độ địa lý từ 107 o50’ –
108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15 o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là
inh cao 598 m.
hững điểm vốn trước đây có sâm
cao khoảng 1500 m đến
gọc
gọc inh mọc tự nhiên từ độ
00 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 000 m, thuộc địa bàn
của hai huyện Đăk Tô (tỉnh
on Tum) và Trà My (tỉnh Quảng
am). Về giới hạn
cũng như phân bố của loài sâm này ở núi gọc inh hiện nay đã có nhiều thay đổi.
SVT : G YỄ T Ị T
18
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
2.2.4. Hiện trạng và tiềm năng của cây âm Ngọc Linh
Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác. Do là loài Sâm quí hiếm nên
số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 50 loài quí hiếm đang
có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm
gọc inh đã được đưa vào sách đỏ Việt am cần được bảo vệ.
Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để
duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng am và Kon Tum:
ăm 1979:
liệu Trà
ỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng
am đã cho thành lập Trại dược
inh. Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có
.000 cây con. Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm
gọc inh và phổ biến
cho nhân dân trong vùng thực hiện.
-
ăm 1995: Sở
hoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng
am đã đầu
tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm gọc inh.
hằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm
gọc inh và đưa cây Sâm trở thành loại
cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã
chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng
nguyên liệu sâm khu ăm tại xã Trà inh”.
-
ăm 00 : Viện Dược liệu à ội phối hợp với Sở
Môi Trường on Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm
được nhân giống trong năm 00 và trồng tập trung ở xã
hoa Học Công Nghệ và
gọc inh. Cây Sâm đã
gọc ay, huyện Đắk Tô.
ăng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây. Mục đích của dự án là quy hoạch
vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm
gọc
inh phát triển và tìm ra phương
pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa
đói giảm ngh o ở on Tum.
Sâm
gọc inh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng
dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng
thương hiệu sâm
gọc inh trên thị trường thế giới. Trong đó bước đầu tiên là hiện
đại hóa việc canh tác. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến
có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm gọc inh.
SVT : G YỄ T Ị T
19
TỐT G IỆP
GV D: BÙI VĂ T Ế VI
2.2.5. Thành hần hóa học
2.2.5.1. H
chất a onin:
Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật.
Việt
ợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm
am cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran
được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học.
Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 9 hợp chất saponin, gồm 5
saponin đã biết và
saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-
R24.
Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin
đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8.
Bảng 2.3: Hàm
Nguyên iệu
ng một ố a onin chính trong âm ( Đ trừ độ ẩm):
Hàm
ng a onin chính (%)
G-Rb1
GRd
G-Ry1
R2
Tổng cộng
Đầu mầm
0.943
0.898
1.359
2.859
6.059
Sâm tuổi
0.979
0.426
1.235
1.868
4.236
Sâm tuổi
0.846
0.678
1.419
2.409
5.352
tuổi
0.818
0.396
1.696
3.141
6.051
ễ củ 5 tuổi
1.721
0.518
2.219
3.816
8.674
ễ củ
1.824
0.632
2.285
4.166
9.474
tuổi
1.518
1.778
2.432
2.946
8.674
Thân rễ 5 tuổi
1.565
0.981
1.652
4.276
8.494
Thân rễ
2.716
0.840
3.648
5.342
12.546
ễ củ
Thân rễ
tuổi
tuổi
SVT : G YỄ T Ị T
20
- Xem thêm -