Tài liệu Chọn lọc một số chỉ thị ssr có mức độ đa hình cao phục vụ đánh giá đa dạng di truyền keo tai tượng (acacia mangium willd.) và keo lá tràm (acacia auriculiformis a.cunn. ex benth)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- DƢƠNG THỊ HOA CHỌN LỌC MỘT SỐ CHỈ THỊ SSR CÓ MỨC ĐỘ ĐA HÌNH CAO PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN KEO TAI TƢỢNG (Acacia mangium Willd.) VÀ KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis A.Cunn. ex Benth.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- DƢƠNG THỊ HOA CHỌN LỌC MỘT SỐ CHỈ THỊ SSR CÓ MỨC ĐỘ ĐA HÌNH CAO PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN KEO TAI TƢỢNG (Acacia mangium Willd.) VÀ KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis A.Cunn. ex Benth.) Chuyên ngành:Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HÀ HUY THỊNH TS. NGHIÊM QUỲNH CHI Hà Nội, 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành theo chương trình đào tạo Cao học hệ chính quy tập chung khóa 16 (2012 – 2014) tại trường Đại Học Thái Nguyên. Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Huy Thịnh, TS. Nghiêm Quỳnh Chi, ThS. Lê Sơn đã dành nhiều thời gian, công sức truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và dành những tình cảm tốt đẹp cho tác giả trong quá trình thực hiện luận văn. Tác giả chân thành cảm ơn phòng đào tạo Sau đại học – Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, các thầy cô giáo, đã quan tâm giúp đỡ tác giả trong quá trình nghiên cứu luận văn này. Tác giả cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học, các bạn đồng nghiệp và gia đình đã nhiệt tình giúp đỡ về tinh thần, vật chất và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho việc hoàn thiện luận văn. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do kinh nghiệm còn hạn chế, nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và các đồng nghiệp.. Tác giả xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 1 tháng 12 năm 2014 Tác giả Dƣơng Thị Hoa i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... i MỤC LỤC ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .......................................................................... vii ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ................................ 3 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu ........................................................... 3 1.1.1. Keo lá tràm (Acacia auriculiformis).......................................................... 3 1.1.2. Keo tai tượng (Acacia mangium) .............................................................. 4 1.2. Tổng quan về chỉ thị SSR ............................................................................ 5 1.2.1. Khái niệm chỉ thị SSR ................................................................................ 5 1.2.2. Tính chất của chỉ thị SSR .......................................................................... 6 1.2.3. Sự phát triển mồi của SSR ......................................................................... 7 1.2.4. Các loại chỉ thị SSR ................................................................................... 7 1.2.5. Cơ chế hình thành chỉ thị SSR .................................................................. 8 1.2.6.Vai trò của chỉ thị SSR ................................................................................ 9 1.2.7. Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR ....................................................... 10 1.2.8. Các phương pháp phát hiện chỉ thị SSR................................................. 11 1.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử với cây lâm nghiệp ......................................... 13 1.3.1. Vai trò của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu cải thiện giống cây rừng 14 1.3.2. Một số kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử với Keo lá tràm và Keo tai tượng…………………………………………………………………………..15 1.3.2.1.Kết quả nghiên cứu ngoài nước………………………………………15 1.3.2.2 Kết quả nghiên cứu trong nước…………………………………………….17 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................................................... 20 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 20 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20 2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 20 ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.4. Thời gian - địa điểm nghiên cứu: .............................................................. 20 2.5. Hóa chất và thiết bị phục vụ nghiên cứu............................................21 2.5.1. Hóa chất tách chiết ADN ................................................................21 2.5.2. Hóa chất tiến hành phản ứng PCR....................................................21 2.5.3. Hóa chất điện di..............................................................................22 2.5.4. Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu……………………………………..23 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 23 2.6.1. Phương pháp tách chiết ADN.................................................................. 23 2.6.2. Phương pháp sàng lọc mồi đa hình cao và đánh giá đa dạng di truyền24 2.6.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR .................................................. 25 2.6.3.1.Phương pháp PCR................................................................................... 26 2.6.3.2.Phương pháp PCR đa mồi (Muitlplex PCR) ........................................... 26 2.6.4. Phương pháp điện di trên gel poly acryamide………………………… 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 29 3.1. Sàng lọc các mồi hoạt động tốt trên hai loài Keo tai tƣợng và Keo lá tràm..................................................................................................................... 29 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN cho Keo tai tượng và Keo lá tràm ................... 29 3.1.2.Sàng lọc các mồi đa hình với số lượng mẫu nhỏ………………….........30 3.1.2. Sàng lọc các mồi đa hình với số lượn g mẫu lớn….………………...... 33 3.2. Hoàn thiện phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR) .............................. 36 3.3. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 2 loài nghiên cứu .................. 38 3.3.1. Đa dạng di truyền ở mức độ loài ............................................................. 38 3.3.2. Đa dạng di truyền giữa các xuất xứ ........................................................ 41 3.3.2.1. Đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Keo lá tràm................................... 41 3.3.2.2. Đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Keo tai tượng................................ 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ................................ 48 4.1. Kết luận ....................................................................................................... 48 4.2. Tồn tại.......................................................................................................... 49 4.3. Kiến nghị ..................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 50 iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TĂT STT Viết tắt Nghĩa đầy đủ 1 Aa Keo lá tràm 2 Am Keo tai tượng 3 Bp Base pair 4 SSR Trình tự lặp lại đơn giản 5 PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp 6 RFLP Đa hình về chiều dài các đoạn giới hạn 7 Na Số alen trung bình 8 Ho Tỉ lệ dị hợp tử quan sát 9 He Tỉ lệ dị hợp tử mong đợi 10 Tm Nhiệt độ bắt cặp 11 P% Tỉ lệ đa hình 12 F Hệ số cố định 13 Fis Hệ số tương đồng 14 Fst Hệ số cận huyết iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Thành phần phản ứng PCR 25 3.1 Kết quả đo nồng độ ADN và OD260nm/280nm 29 3.2 Kết quả sàng lọc mồi bằng phương pháp cho điểm 31 3.3 Một số cặp mồi có mức độ đa hình cao cho Keo lá tràm 34 3.4 Một số cặp mồi có mức độ đa hình cao cho Keo tai tượng 35 3.5 Kết quả hoàn thiện phản ứng PCR đa mồi 37 3.6 Đa dạng di truyền của 2 loài Keo nghiên cứu 39 3.7 Đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Keo lá tràm 41 3.8 Hệ số tương đồng di truyền các xuất xứ Keo lá tràm 43 3.9 Đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Keo tai tượng 44 3.10 Hệ số tương dồng di truyền các xuất xứ Keo tai tượng 47 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Chỉ thị SSR (Microsatellites) 6 1.2 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 8 1.3 Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã 9 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN 30 3.2 Hình ảnh điện di mức điểm 2 32 3.3 Hình ảnh điện di mức điểm 5 33 3.4 Hình ảnh điện di phản ứng đa mồi nhóm 1 37 3.5 Hình ảnh điện di phản ứng đa mồi nhóm 2 38 3.6 Hình ảnh điện di phản ứng đa mồi không hoạt động tốt cho tất cả các mồi thành phần 38 3.7 Quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Keo lá tràm 46 3.8 Quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Keo tai tượng 46 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Trang 3.1 Tỷ lệ đa hình đánh giá bằng phương pháp cho điểm 3.2 Tần số alen trung bình cho các locut trên cả 2 loài Keo nghiên cứu 3.3 Đa dạng di truyền mức độ loài cho 2 loài Keo nghiên cứu vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 32 35 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Keo tai tượng (Acacia mangium Willd.) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn. ex Benth) là những loài cây trồng rừng chủ lực trong chiến lược phát triển rừng đến năm 2020 bởi khả năng sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt và gỗ của chúng được sử dụng với nhiều mục đích: gỗ xẻ (đồ mộc, gỗ xây dựng, sàn nhà...), giấy và năng lượng. Kỹ thuật chỉ thị phân tử ADN (DNA- based markers) đã và đang là một công cụ hữu ích để đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu về tổ chức genome, bản đồ liên kết (linkage maps) và mức độ tiến hóa của nhiều loài cây rừng (Ahujia, 2001). Nhiều loại chỉ thị ADN đã được sử dụng trong những nghiên cứu này như RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), minisatellites (chỉ thị vệ tinh) và microsatellites (chỉ thị vi vệ tinh hay chỉ thị SSR).Trong đó, chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cho nhiều loài cây lâm nghiệp (Jeffrey et al. 2000; Wang et al. 2001). Hơn thế nữa, chỉ thị SSR cũng được ứng dụng trong nghiên cứu quản lý hệ thống rừng giống, vườn giống như nghiên cứu tỷ lệ giao phấn chéo, di cư gen, nhiễm phấn từ bên ngoài, nhầm lẫn trong rừng trồng, xác định bố mẹ lai giống và xác định phả hệ cho nhiều loài cây như keo, bạch đàn, thông...(Butcher,1999) [20]. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong đánh giá đa dạng di truyền một số loài keo trên thế giới đã được tiến hành và có những kết quả nhất định. Nhưng việc sử dụng các chỉ thị này tại Việt Nam cho cả 2 loài Keo tai tượng và Keo lá tràm còn có nhiều hạn chế, đặc biệt là với Keo lá tràm. Do khả năng khuyếch đại của các mồi SSR trên các loài keo này là tương đối khác nhau, các chỉ thị có thể hoạt động tốt trên Keo tai tượng nhưng lại không hoạt động cho Keo lá tràm hoặc ngược lại. Một hạn chế nữa là số lượng chỉ thị SSR ở các nghiên cứu trước đây chưa nhiều nên có thể kết quả đem lại không lớn. Vì thế, 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn việc xác định các chỉ thị SSR có tính đa hình có thể khuếch đại trong phản ứng PCR cho hai loài Keo tai tượng và Keo lá tràm sẽ mang lại nhiều ý nghĩa. Từ các cơ sở trên, đề tài “Chọn lọc một số chỉ thị SSR có mức độ đa hình cao phục vụ đánh giá đa dạng di truyền Keo tai tượng (Acacia mangium Willd.) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A.Cunn. ex Benth)” được đề xuất tiến hành. Đề tài nằm trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu chọn giống Keo lai sinh trưởng nhanh bằng chỉ thị phân tử” thuộc chương trình cải thiện một số loài keo đang được triển khai tại Viện Nghiên cứu Giống và CNSH Lâm nghiệp giai đoạn 2012 - 2016. Việc thực hiện đề tài sẽ là cơ sở xác định được sự khác biệt di truyền cho một số giống keo. Từ việc đánh giá đa dạng này có thể đưa ra định hướng chọn tạo giống phù hợp cho các quần thể chọn giống. Ví dụ: thu hái hạt, chọn lọc bố mẹ cho lai giống nếu quần thể có mức đa dạng di truyền cao hoặc bổ sung nguồn gen bên ngoài nếu mức độ đa dạng thấp. Ngoài ra, việc chọn lọc các mồi có tính đa hình cao với Keo lá tràm và Keo tai lượng có thể làm cơ sở cho chọn lọc các mồi đa hình với Keo lai (cây lai tự nhiên giữa Keo lá tràm và Keo tai tượng). Từ đó, kết hợp phân tích mối tương quan giữa tính trạng kiểu hình trên hiện trường và dữ liệu về mặt di truyền được xác định bởi kỹ thuật “finger printing” có thể xác định được mối tương quan giữa chúng cũng như xác định nguồn gốc di truyền của đối tượng (quần thể, cá thể) nghiên cứu để chọn lọc được những chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng sinh trưởng nhanh với Keo lai và cặp bố mẹ lai tốt nhất (Keo tai tượng và Keo lá tràm) cho con lai sinh trưởng nhanh. 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu Chi keo (Acacia) là một chi thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), họ Đậu (Legumimosae). Chi keo bao gồm 1381 loài có phân bố rộng ở Châu Á và châu Đại Dương. Riêng Australia có khoảng 850 loài keo, trong đó có hàng trăm loài có lá giả (Maslin, 2003) [34]. Ở Việt Nam có gần 20 loài keo được thử nghiệm gây trồng, Trong đó, Keo lá tràm và Keo tai tượng là những loài có khả năng thích nghi cao, sinh trưởng nhanh nên được đưa vào trồng phổ biến (Lê Đình Khả, 1999) [19]. 1.1.1. Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) là loại cây gỗ nhỏ đến trung bình, thường chỉ cao 8-20m, ở điều kiện thuận lợi có thể cao 25 đến 30m. Loài cây này phân cành thấp, tán rộng (Verdcourt (1979) [35]. Vỏ cây có rạn dọc, màu nâu xám, đường kính có thể lên tới 80cm với đoạn thẳng dài, cành nhỏ, tự tỉa cành tốt. Hoa tự dạng bông đuôi sóc, tràng hoa màu vàng. Quả khô hình xoắn, khi chín tự nứt để phát tán hạt. Hạt nhỏ, màu nâu đen (Verdcourt, 1979) [35]. Keo lá tràm phân bố tự nhiên ở nhiều nơi như ven biển Indonesia, vùng sa mạc nửa khô hạn Papua New Guinea, ở trung tâm và đông bắc Australia. Phạm vi phân bố nằm ở các vĩ độ 5-170o Nam, độ cao phân bố có thể lên đến 400 m nhưng thường phổ biến ở độ cao dưới 100m. Keo lá tràm thường gặp ở vùng khí hậu nóng ẩm tới cận ẩm, nhiệt độ bình quân 22-24oC, lượng mưa thay đổi từ 760mm-2000mm, nơi không có băng giá và sương muối (Turnbull, 1997) [34]. Trong những điều kiện thuận lợi về khí hậu, lượng mưa bình quân >2000mm, đất đai tốt thì Keo lá tràm sinh trưởng mạnh ở tuổi 10-12 cao từ 1518m đường kính 15-20cm và năng suất có thể đạt được 20-25m3/ha/năm tuy 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nhiên trên những vùng đất bạc màu bị xói mòn thì năng suất chỉ đạt 810m3/ha/năm điều này giống với năng suất rừng trồng Keo lá tràm quảng canh ở nước ta hiện nay. Về giá trị sử dụng Keo lá tràm, bên cạnh tính năng thích hợp với các công trình xây dựng như làm đồ gia dụng, bàn, ghế …thì trong công nghệ sản xuất bột giấy Keo lá tràm có tính chất gỗ tương đương với Bạch đàn (Chomcharn, 1986) [34]. Soetrisno (1990) [34] còn cho rằng Keo lá tràm còn có thể ghép vào những cây có tỉ trọng gỗ cao, sợi ngắn, thành phần lignin thấp, cho thành phần bột giấy có tính chất phù hợp với sản phẩm giấy có chất lượng cao. Ở nước ta hiện nay, Keo lá tràm được sử dụng làm nguyên liệu giấy sợi, gỗ xây dựng, gỗ chống lò, đóng đồ gia dụng, đồ mỹ nghệ. Do có vân đẹp và màu phù hợp nên còn được gọi là “Cẩm lai giả” (Lê Đình Khả, 2003) [9]. 1.1.2. Keo tai tượng (Acacia mangium) Keo tai tượng (Acacia mangium) có chiều cao biến động từ 7m đến 30m, đường kính từ 25-35cm, đôi khi trên 50cm. Thân thẳng, vỏ có màu nâu xám đến nâu, xù xì, có vết nứt dọc. Hoa tự hình bông dài gần bằng lá, mọc lẻ hoặc tập trung 2-4 hoa tự ở nách lá. Hoa đều, lưỡng tính có màu trắng nhạt hoặc màu kem, cây 18-24 tháng tuổi đã có thể ra hoa nhưng ra hoa nhiều nhất vào tuổi 4-5, mùa hoa chính thường vào tháng 6-7 (Lê Mộng Chân, 2000) [3].Quả đậu, dẹt, mỏng, khi già khô vỏ quả cong xoắn lại. Hạt hình trái xoan, màu đen và bóng, vỏ dày, cứng, có dính giải màu đỏ vàng, một kg hạt có từ 52.000-95.000 hạt. Rễ phát triển mạnh cả rễ cọc và rễ bàng, đầu rễ cám có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cộng sinh có khả năng cố định đạm [3]. Diện tích rừng trồng Keo tai tượng ngày càng tăng lên trong những năm gần đây. Trung Quốc, Ấn Độ và Malaysia, Indonesia là nước trồng Keo tai tượng nhiều nhất thế giới diện tích khoảng 1,2 triệu ha. Ở Việt Nam, trong giai đoạn 2006-2011, diện tích Keo tai tượng được trồng trên toàn quốc đạt khoảng 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn trên 500.000 ha. Mặc dù số liệu thống kê chưa đầy đủ cho tất cả các tỉnh nhưng kết quả tổng hợp thấy rằng Keo tai tượng được trồng ở hầu hết các vùng trong cả nước. Các vùng có diện tích Keo tai tượng lớn là vùng Đông Bắc (106,131ha), vùng Trung tâm (108,698ha) và vùng Bắc Trung bộ (199,771ha). Các vùng có diện tích trồng nhỏ hơn là Tây Nguyên (1,616 ha) và Tây Bắc (22,371ha), (Tổng cục Lâm nghiệp, 2011) [17]. Sinh trưởng của Keo tai tượng ở một số vùng sinh thái với nhiều dạng lập địa sinh trưởng rất khác nhau. Năng suất của Keo tai tượng khi trồng thâm canh ở Gia Lai đạt 21,24m3/ha/năm, nhưng khi trồng quảng canh thì năng suất chỉ đạt 11,50m3/ha/năm. Còn khi trồng bán thâm canh thì năng suất rất khác nhau giữa các địa điểm trồng và biến động trong khoảng từ 7,34 đến 15,75m 3/ha/năm (Nguyễn Huy Sơn, 2004) [14]. Các nghiên cứu về chọn tạo giống các loài Keo tại việt Nam đã được tiến hành từ những năm 1980, với rất nhiều các nghiên cứu về tính chất gỗ, khả năng sinh trưởng, năng suất cho Keo lá tràm và Keo tai tượng. Song có rất ít nghiên cứu ở mức độ phân tử, đặc biệt là nghiên cứu về chỉ thị vệ tinh với các loài keo này. 1.2. Tổng quan về chỉ thị SSR 1.2.1. Khái niệm chỉ thị SSR Chỉ thị SSR (chỉ thị vi vệ tinh hay microsatelites) là kĩ thuật khuếch đại các đoạn trình tự đơn giản (2-6 nucleotit) do Lit và Luty giới thiệu năm 1989 khi nghiên cứu genome một số sinh vật phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotit lặp lại một cách có trình tự (Bùi Chí Bửu, 1999) [2]. 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Sequence microsatellite Chiều Điện di Hình 1.1. Chỉ thị SSR (http.universe review.ca/SSR.jpg) 1.2.2. Tính chất của chỉ thị SSR Chỉ thị SSR có ở bộ gen thực vật thấp hơn 5 lần so với động vật có vú. Ước tính tần số xuất hiện chỉ thị SSR từ 3,3kb ở lúa mạch đến 1,2Mb ở cà chua. Trung bình sự xuất hiện chỉ thị SSR là 21,2kb ở thực vật hai lá mầm và 64,5kb ở thực vật một lá mầm (Wang, 1994) [6]. Chỉ thị SSR sinh ra đa hình từ nhiều vùng tương ứng do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ việc sử dụng 2 đoạn mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Do bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, nên chỉ thị này cũng dễ dàng phát hiện được phát hiện bằng phản ứng PCR [6]. Chỉ thị SSR thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của ADN. Tần số đột biến từ 10-4-5.10-6, tuân theo định luật Mendel. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trượt trong suốt quá trình sao chép ADN trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa (Kashi, 1999) [6]. 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.2.3. Sự phát triển mồi của chỉ thị SSR Mồi của chỉ thị SSR được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn ADN. Những đoạn này được chèn vào plasmit hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn E.coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotit được đánh dấu huỳnh quang và lai với trình tự lặp lại trên đoạn ADN. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn ADN được đọc trình tự và mồi PCR sẽ được thiết kế từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác định vị trí đặc trưng (Kashi, 1999) [6]. Mồi SSR đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locut trên mỗi alen) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự mồi và trình tự của vùng flanking (vùng nằm ở 2 bên trình tự mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự mồi đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể (Kashi, 1999). 1.2.4. Các loại chỉ thị vi vệ tinh Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có 4 loại chỉ thị SSR (Ma &ctv, 1995) [6]: - Mononucleotit SSR (AAAAAAAAAAA): là các đoạn trình tự lặp lại 1 lần mà có thể cấu tạo tới vài phần trăm của hệ gen. Mononucleotit SSR thường tập trung ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó ít khi được sử dụng trong phân biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản đồ gen ở gần vùng tâm động. - Dinucleotit SSR (GT)6: có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10 bp cho tới 0,5-30 kb. - Trinucleotit SSR (CTG)4: là dạng có 3 loại base trong trình tự lặp lai. VD: ATGATGATGATG 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Tetranucleotit SSR (ACTC)4: là dạng có 4 loại base trong trình tự lặp lại. VD: ACGTACGTACGTACGT Trinucleotit SSR xuất hiện ít hơn dinucleotit SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotit SSR còn hiếm hơn nữa. 1.2.5. Cơ chế hình thành SSR Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành chỉ thị SSR là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong giảm phân và quá trình trượt lỗi trong sao mã Quá trình trượt lỗi trong sao mã (Moxon, 1999) [6] được coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các chỉ thị vi vệ tinh, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử ADN mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn . Hình 1.2: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân (Moxon, 1999). 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 1.3: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã (Moxon, 1999) 1.2.6. Vai trò của chỉ thị SSR Chỉ thị SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài. Đây là một công cụ hiệu quả để phân tích liên kết kiểu hình với sự đa dạng của kiểu gen cho những nhà chọn giống. Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen, xây dựng bản đồ liên kết gen, chọn lọc các tính trạng mong muốn. Ngoài ra nó còn có thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locut (Bùi Chí Bửu, 1999) [2]. Rất nhiều chỉ thị SSR đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền (Kashi, 1999) [6]. Có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự SSR cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa bởi chúng được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hệ với vùng mã hoá. Số lượng khác nhau các đoạn lặp lại này ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen (Kashi, 1999). Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của SSR cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor.Vị trí của SSR gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa SSR hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn SSR có thể làm giảm chức năng của gen (Ma, 1995) 1.2.7. Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR Ưu điểm: Thuận lợi to lớn của chỉ thị SSR là phương pháp này biểu hiện một số lượng lớn đa hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locut được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong nghiên cứu xác định cây trội và phân biệt mối quan hệ cha con (Hokanson, 1998) [6]. Đây là loại chỉ thị đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định, tính đồng trội của chỉ thị vi vệ tinh sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của phép tính toán di truyền quần thể của chỉ thị này so với các chỉ thị khác như AFLP, RADP. Hơn nữa việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, phân tích lai giống dễ dàng hơn (Scholetter, 1990). Khi các mồi SSR được xác định việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kĩ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định các mồi SSR thích hợp không cần thiêt trong những loài có quan hệ gần (Hokanson, 1998). Hạn chế Hạn chế của chỉ thị SSR là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn ba gồm nhiều loài có mối quan hệ di truyền xa nhau. Nguyên nhân là do chỉ thị SSR có tỉ lệ đột biến cao dẫn đến 2 trở ngại: Thứ nhất là vùng flanking 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn thường khác nhau giữa các loài do đột biến vì vậy không thể áp dụng mồi của loài này cho loài khác. Thứ hai là khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với một chỉ thị SSR chúng ta không thể kết luận chúng có cùng mối quan hệ tổ tiên. 1.2.8. Các phương pháp phát hiện chỉ thị SSR Có 2 phương pháp để phát hiện SSR: phương pháp lai và phương pháp PCR. Phương pháp lai Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu chỉ thị SSR bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu chỉ thị bằng các mẫu dò khác nhau. Trong phương pháp lai có 3 cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ, phương pháp nhuộm bạc và phương pháp điện di mao quản: - Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém (Nguyễn Quang Thạch, 2006) [1]. - Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ): Nhuộm bạc là một phương pháp rất nhạy dùng để phát hiện protein và acid nucleic trên gel polyacrylamide. Gần đây, phương pháp này được sử dụng rộng rãi để phát hiện acid nucleic trong phân tích marker phân tử như SSR (simple sequence repeat), SSCP (single-strand conformation polymorphism) và AFLP (amplified fragment-length polymorphism). Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn