Tài liệu Chế tạo hạt nano vàng gắn kháng thể ứng dụng cho phát hiện nhanh viruts cúm a

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PHẠM VĂN ĐỒNG CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PHẠM VĂN ĐỒNG CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ Hà Nội – 2010 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU....................................................3 1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại ...............................................................................3 1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại. ................................3 1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học ...........................................................5 1.3.1. Các hạt nano kim loại.............................................................................. 5 1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ.................................................................... 6 1.3.3. Hạt nano từ tính....................................................................................... 6 1.3.4. Chấm lượng tử......................................................................................... 7 1.4. Hạt nano vàng...........................................................................................................7 1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng..................................................................9 1.5.1. Phương pháp Turkevich ........................................................................ 10 1.5.2. Phương pháp Brust................................................................................ 11 1.5.3. Phương pháp Perrault............................................................................ 11 1.5.4. Phương pháp Martin.............................................................................. 11 1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis) ................................................. 12 1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs............................................................12 1.6.1. Đánh dấu sinh học................................................................................. 13 1.6.2. Phân phát thuốc và chuyển gen............................................................. 13 1.6.3. Sensor sinh học ...................................................................................... 14 1.7. Kit chẩn đoán bệnh bằng que thử nhanh ................................................................14 1.7.1. Giới thiệu............................................................................................... 14 1.7.2. Sơ đồ nguyên lý của que thử nhanh ...................................................... 15 1.8. Kháng thể................................................................................................................17 1.8.1. Giới thiệu chung.................................................................................... 17 1.8.2. Giới thiệu về vùng biến đổi của kháng thể (Single Chain Variable Fragmet-scFv) ................................................................................................. 18 1.9. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ...................................................................................19 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...............................................................22 2.1. Vật liệu ...................................................................................................................22 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................22 2.2.1. Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs) ........................... 22 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu 25 2.2.2.1. Thời gian phản ứng ............................................................................ 25 2.2.2.2. Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3 ............................................... 25 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái và cấu trúc hóa học của AuNPs. ............................................................................................................ 26 2.2.3.1. Phân tích bằng phổ hấp thụ UV ......................................................... 26 2.2.3.2. Phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM)........................................ 27 2.2.3.3. Phân tích bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR ................................... 28 2.2.4. Phương pháp gắn kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 lên bề mặt hạt nano vàng ........................................................................................................ 30 2.2.4.1. Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng ................ 30 2.2.4.2. Tạo phức hợp kháng thể gắn trên bề mặt hạt nano vàng (kháng thể/nano vàng) ................................................................................................. 31 2.2.5. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1 sử dụng phức hợp kháng thể/nano vàng. ................................................................................................. 32 2.2.5.1. Thiết kế que thử nhanh đơn giản........................................................ 32 2.2.5.2. Kiểm tra sự hoạt động của phức hợp kháng thể/nano vàng............... 33 2.2.5.2.1. Kiểm tra bằng Dot blot.................................................................... 33 2.2.5.2.2. Phương pháp que thử nhanh............................................................ 34 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................36 3.1. Kết quả chế tạo hạt nano vàng................................................................................36 3.1.1. Kích thước, hình thái............................................................................. 36 3.1.2 Phân tích thành phần EDX..................................................................... 38 3.1.3. Đặc trưng quang học của AuNPs.......................................................... 38 3.1.4. Cấu trúc hóa học của AuNPs. ............................................................... 39 3.1.5. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng AuNPs ................... 40 3.1.5.1. Thời gian phản ứng ............................................................................ 40 3.1.5.2. Thay đổi lượng chất khử natri citrate................................................. 41 3.1.5.3. Thời gian và điều kiện bảo quản hạt AuNPs ..................................... 42 3. 2. Tạo phức hợp AuNPs gắn kháng thể cúm A .........................................................43 3. 2.1. pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể/nano vàng .............................. 43 3. 2.2. Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn .............................. 44 3.3. Kiểm tra phát hiện virus cúm A/H5N1 bằng phức hợp kháng thể/nano vàng .......48 3.3.1. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus cúm A bằng Dot blot............... 48 3.3.2. Kết quả kiểm tra thử nghiệm bằng que thử đơn giản............................ 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................52 PHỤ LỤC ......................................................................................................................57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT SEM quét Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử FTIR Fourier Tranform Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại UV Ultraviolet photospectroscopy Phổ UV AuNPs Gold nanoparticles Hạt nano vàng SPR Surface Plasmon Resonance BSA Bovine serum albumin Cộng hưởng Plasmon bề mặt. Huyết thanh bò DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus) được làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua 3 Hình 1.2. Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện môi. 4 Hình 1.3. Hình 1.4. Hình 1.5. Hình 1.6. Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc xung quanh hạt. A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo theo phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch. Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím (trên) và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới). (A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích thước 15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850 4 5 8 8 Hình 1.7. Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62] 8 Hình 1.8. Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich 9 Hình 1.9. AuNPs có rất nhiều ứng dụng trong sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc hiệu, phân phát thuốc và DNA vào tế bào 12 Hình 1.10. Mô hình que thử nhanh cơ bản [63] 15 Hình 1.11. Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng 16 Hình 1.12. 17 Cấu Trúc của kháng thể Hình 1.13. Sơ đồ tạo scFv 19 Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử của Turkevich 23 Hình 2.2. Kích thước và hình dạng của hạt nano vàng theo thời gian phản ứng trong khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây 23 Hình 2.3. Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia 27 Hình 2.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của kính hiển vi điện tử quét 27 Hình 2.5. Mô hình một máy quang phổ FTIR cơ bản 29 Hình 2.6. Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31 Hình 2.7. Mô hình que thử nhanh với hai vạch kháng thể (test line và control line) 33 Hình 2.8. Mô hình tiến hành thí nghiệm Dot Blot để kiểm tra sự hoạt động của phức hợp kháng thể/nano vàng. 34 Hình 2.9. Mô hình thí nghiệm que thử nhanh: Que thử gắn vạch kháng thể được nhúng vào dung dịch chứa phức hợp kháng thể/nano vàng. 35 Hình 3.1. Ảnh SEM của AuNPs (A, B) và phân bố kích thước của hạt (C). 37 Hình 3.2. Phổ phân tích thành phần vật liệu EDX của mẫu nano vàng 38 Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch AuNPs 39 Hình 3.4. Phổ hồng ngoại (FTIR) của AuNPs 39 Hình 3.5. Phổ hấp thụ UV của các mẫu vàng trong các khoảng thời gian phản ứng khác nhau. 40 Hình 3.6. Phổ hấp thụ của các mẫu dung dịch AuNPs theo bảng với hàm lượng citrate khác nhau. 42 Hình 3.7. Phổ hấp thụ của mẫu AuNPs ban đầu và sau thời gian 60 ngày 43 Hình 3.8. Sự thay đổi màu dung dịch với lượng kháng thể gắn như nhau ở các pH khác nhau từ trái sang lần lượt từ pH 5 - pH 11. 43 Hình 3.9. Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng trước (đường a ) và sau khi gắn kháng thể (đường b) 44 Hình 3.10. Phổ hấp thụ FTIR của mẫu nano vàng không gắn kháng thể (A) và mẫu sau khi gắn kháng thể lên bề mặt (B). 46 Hình 3.11. Các hạt AuNPs trước (A) và sau khi gắn kháng thể (B) 46 Hình 3.12. (A) Từ trái sang với các mẫu gắn lượng protein thay đổi từ (1 -100 µl kháng thể nồng độ 100µg/ml trên 1ml dung dịch AuNPs). (B) Phổ hấp thụ của các mẫu sau khi bổ sung dung dịch NaCl để kích thích kết tủa của dung dịch. 48 Hình 3.13. Kết quả kiểm tra bằng Dot Blot với các nồng độ kháng nguyên khác nhau cố định trên màng 48 Hình 3.14. Vạch kháng thể kháng virus cúm A được cố định trên màng nitrocellulose bắt các hạt kháng thể/nano vàng và tập hợp thành vạch. Vạch có thể quan sát dễ dàng bằng mắt thường sau thời gian kiểm tra từ 5-10 phút. 49 MỞ ĐẦU Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọi loài chim, trong đó có gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất cao. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO), tính đến tháng 10 năm 2010, tổng số ca mắc cúm A/H5N1trên thế giới lên tới 507, trong đó, 302 trường hợp đã tử vong. Trong đó, Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 gây nên. Để ngăn chặn sự lây lan của bệnh và có các biện pháp điều trị kịp thời thì việc chẩn đoán nhanh và chính xác cúm A/H5N1 là rất cần thiết. Chẩn đoán và phát hiện nhanh virus cúm tại hiện trường đồng thời tiến hành các công tác dập dịch là công việc rất quan trọng. Hiện nay có một thiết bị chẩn đoán nhanh các loại bệnh dịch với thời gian kiểm tra nhanh và cho kết quả rất đáng tin cậy đó là que thử nhanh. Đây là một thiết bị chẩn đoán được thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch đặc hiệu (immunochromatographic assays), và được sử dụng phổ biến cho các xét nghiệm nhanh từ cuối những năm 1980. Que thử nhanh được phát triển bằng việc sử dụng các hạt nano vàng hoặc các loại hạt khác kích thước nano ở dạng huyền phù gắn kháng thể đơn dòng. Trong thiết bị này, các hạt kích thước nano được sử dụng cho việc đánh dấu quang học, đóng vai trò như một sensor màu dùng để phát hiện sự tồn tại của các chất có trong mẫu thử. Que thử nhanh cho phép phát hiện rất nhiều đối tượng bao gồm kháng nguyên, kháng thể, thậm chí trong kiểm tra sự tồn tại của các loại hợp chất khác. Que thử nhanh rất tiện dụng, thân thiện với người dùng, giá thành sản xuất thấp và cũng như tính linh hoạt cao trong sử dụng, có thể được sử dụng ở phạm vi rộng, không chỉ trong bệnh viện hoặc các trung tâm y tế hiện đại. Công nghệ nano hiện nay đã và đang trở thành một lĩnh vực hứa hẹn cho rất nhiều ứng dụng trong khoa học và đời sống. Công nghệ nano sinh học tạo ra các sản phẩm khả năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực dược phẩm, y sinh. Trong các loại vật liệu nano hiện nay, hạt nano vàng (AuNPs) là một trong những loại vật liệu nano được nghiên cứu rộng rãi nhất. Với kích thước trong khoảng 10- 100 nm, các hạt nano vàng tạo ra hiệu ứng cộng hưởng plasmon đặc trưng dưới tác động của các photon. Các hạt nano vàng có thể được gắn với các phân tử sinh học, đã và đang trở thành một sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học, trong chẩn đoán và điều trị các tế bào ung thư [7, 48] và đặc biệt trong công nghệ chế tạo các loại kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh truyền nhiễm [14]. 1 Ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng các loại vật liệu nano là một lĩnh vực nghiên cứu mới được quan tâm, đặc biệt là trong công tác chẩn đoán và chữa trị các loại bệnh nguy hiểm. Bệnh cúm A hiện nay đang là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm đã gây nên nhiều đợt dịch trên người và gia cầm thời gian vừa qua. Chính vì thế, việc nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian chẩn đoán, qua đó góp phần cho công tác phòng chống bệnh kịp thời sẽ là đóng góp quan trọng trong việc dập tắt các đợi đại dịch. Để có cơ sở lý thuyết và thực nghiệm cho việc chủ động chế tạo được kit chẩn đoán dựa trên các ưu điểm của vật liệu nano, góp phần đóng góp cho công tác phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan của virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài: “Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) gắn kháng thể ứng dụng cho phát hiện nhanh virus cúm A”. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm việc chế tạo vật liệu nano vàng có gắn kháng thể kháng virus cúm A và bước đầu tiến hành việc phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1. Nội dung nghiên cứu + Chế tạo các hạt nano vàng (AuNPs) + Nghiên cứu các đặc tính vật lý và hóa học của hạt nano vàng chế tạo được + Nghiên cứu chế tạo phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể. + Ứng dụng các hạt nano vàng đã được gắn kháng thể để phát hiện sự có mặt của virus cúm A/H5N1. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại Các hạt nano kim loại có ít nhất kích thước một chiều dao động trong khoảng 1- 100 nm [45]. Ở kích thước nano mét, chúng có những tính chất đặc biệt và khác biệt so với vật liệu khối cùng loại (tính chất điện, tính chất xúc tác, tính chất quang, tính chất từ, cấu trúc và tính chất cơ). Việc tổng hợp các hạt nano không chỉ được phát triển trong khoa học hiện đại ngày nay mà đã có từ rất lâu trong lịch sử loài người. Các nhà giả kim học đã chế tạo được những hạt nano vàng và họ tin rằng đó là thứ thuốc giúp con người trường thọ [9]. Các loại hạt nano kim loại khác đã được dùng để trang trí các cánh cửa nhà thờ, cung điện cho các màu sắc rực rỡ của chúng. Hình 1.1. Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus) được làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua [60]. Ngày nay việc nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng của các hạt nano kim loại đã góp phần tạo nên một bước tiến nhảy vọt trong khoa học cũng như đời sống do chúng sở hữu những thuộc tính vật liệu khác biệt, nổi trội và quý giá so với các vật liệu khối thông thường. 1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại. Các hạt nano kim loại với kích thước nhỏ hơn bước sóng trong vùng khả kiến bộc lộ đặc tính tự nhiên liên quan đến cộng hưởng plasmon bề mặt phụ thuộc vào đặc tính hình học của hạt nano khi chúng bị kích thích bởi trường điện từ [25]. Trên bề mặt của hạt kim loại, plasmon là dạng sóng được truyền dọc theo bề mặt của vật dẫn ở phần chuyển tiếp giữa kim loại và vật liệu điện môi chứa hạt. 3 Hình 1.2. Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện môi. Plasmon bề mặt (sóng điện từ) bị kích thích khi các photon của bước sóng tới đập vào khu vực chuyển tiếp kim loại/điện môi và kích thích dao động cộng hưởng ở bề mặt, tạo nên một dạng sóng truyền (plasmon bề mặt) [27, 50]. Đối với các hạt nano kim loại, kích thước nhỏ tạo ra một sự hấp thụ cường độ mạnh trong khu vực khả kiến/gần UV. Các điện tử dẫn tạo nên một dao động chọn lọc đặc trưng, tạo nên dải Plasmon có thể quan sát trong khu vực gần 530 nm với các hạt nano kích thước từ 5-20 nm. Đặc tính này được gọi là dao động cộng hưởng Plasmon định xứ [31]. Tần số cộng hưởng Plasmon của các hạt nano phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ cục bộ. Một sự thay đổi nhỏ với chỉ số này sẽ dẫn đến việc dịch chuyển tần số dao động và do đó sẽ tạo nên sự dao động tỉ số khúc xạ. Ví dụ, nếu bề mặt của hạt nano được nhúng trong trong dung dịch đệm lỏng và sau đó được nhúng trong dung dịch với tỉ số khúc xạ lớn hơn, điều này sẽ làm tăng tỉ số khúc xạ có thể được phát hiện bởi sự dịch chuyển trong cộng hưởng plasmon (hay kích thích) của hạt nano. Increase absorbance Increaseinin extinctionat at selected selectedwavelength wavelengthdue duetoto shift shiftininplasmon plasmonresonance resonance band band Extinction Absorbance Extinction at Absorbance at selected wavelength wavelength Wavelength Hình 1.3. Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc xung quanh hạt [31]. 4 Hiện tượng dịch chuyển đỉnh hấp thụ là do các tác nhân bọc xunh quanh hạt nano, sự dịch chuyển này có thể phù hợp với các ứng dụng trong chế tạo các sensor cảm biến sinh học bằng việc bọc chúng với kháng thể. Độ nhạy cảm của plasmon bề mặt phụ thuộc vào đặc điểm hình thái (kích thước và hình dạng), môi trường điện môi (tác nhân bọc, môi trường xung quanh, chất nền), tương tác giữa các hạt (trạng thái co cụm). Hình 1.4 minh họa thuộc tính quang học của các hạt nano vàng và nano bạc được tổng hợp theo các quy trình khác nhau tạo ra các hình dạng và kích thước hạt nano khác nhau. Do đó, màu sắc dung dịch chứa các hạt nano do cộng hưởng plasmon cũng thay đổi, phổ hấp thụ UV thể hiện ở các đường hấp thụ với các đỉnh cực đại hấp thụ ở các vị trí bước sóng khác nhau. Hình 1.4. A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo theo phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch [31]. 1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học 1.3.1. Các hạt nano kim loại Hạt nano kim loại là dạng phân tán của các pha rắn trong một môi trường chất lỏng, hầu hết các hạt nano kim loại với kích thước từ vài nm đến µm (Au [5], Ag [40], Pt [57], Pa [58], Cu, Fe, và Hg [22]). Các loại hạt nano kim loại quan trọng nhất được nghiên cứu và ứng dụng là nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs). Các hạt nano vàng được hình thành từ một nguyên tử khởi đầu, sau đó được bao bọc bởi số lượng các nguyên tử vàng nhất định xung quanh, số lượng các hạt xung quanh được tính bởi công thức [10n2+2] [41], với n là số các lớp nguyên tử trong hạt. Như vậy hạt nano vàng nhỏ nhất sẽ bao gồm 13 nguyên tử vàng (Au). Các hạt khác tương tự có cấu trúc gần với khối 20 mặt (icosahedrons) và khối 12 mặt (dodecahedrons) xấp xỉ dạng hình cầu cùng với đường kính tăng dần. 5 1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ Các hạt nano kim loại có cấu trúc lõi/vỏ (core/shell nanoparticles) có những đặc tính quang học rất đặc trưng. Chúng có hai dao động cộng hưởng plasmon bề mặt tương ứng với dải điện tử của các thành phần kim loại tinh khiết trong cấu tạo hạt kim loại (của cả lõi và vỏ) [1]. Đặc tính quang học của các hạt nano kim loại được giải thích bằng lý thuyết Mie cho các hạt bị bọc bởi một lớp khác [10, 41] . So với các thể dị hướng, các hạt nano kim loại cấu trúc lõi vỏ được tổng hợp, ví dụ như dạng hợp kim bởi quá trình phát xạ laser, chỉ thể hiện một đỉnh Plasmon, nằm giữa các vùng hấp thụ của kim loại nguyên chất. Các hạt nano kim loại lõi- vỏ đóng vai trò rất quan trọng việc chẩn đoán sinh học [8]. Hơn nữa, các hạt nano kim loại thuần nhất bộc lộ một số khuyết điểm liên quan đến độ bền hóa học hoặc khi được sử dụng trong các dung môi khác nhau. Để ngăn chặn hiện tượng kết đám, các hạt huyền phù có thể được bọc bởi một lớp vỏ cách điện, ví dụ vỏ silica [34]. Sau khi bọc các hạt nano kim loại bằng lớp vỏ điện môi, chúng có thể được sử dụng trong các môi trường dung môi khác nhau. Độ dày của lớp vỏ silica trong suốt có thể được kiểm soát trong quá trình tổng hợp. Việc thay đổi độ dày của lớp silica và chỉ số khúc xạ của dung môi cho phép kiểm soát thuộc tính quang học thông qua độ phân tán. Với việc tăng độ dày của lớp vỏ silica lên tới một kích thước nhất định, cường độ của dải plasmon tăng và đỉnh hấp thụ sẽ dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn (redshift) do chỉ số khúc xạ cục bộ tăng xunh quanh hạt. Tuy nhiên, khi kích thước của cấu trúc vượt lên trên 80 nm, hiện tượng tán xạ trở nên đáng kể, tạo nên một sự gia tăng mạnh trong phổ hấp thụ của các bước sóng ngắn hơn (blue-shift) tương tự như đặc điểm của hạt nano vàng không có lớp vỏ silica. Kết quả tương tự đối với các lớp phân tử sinh học, hoặc polymer được hấp thụ lên bề mặt của các hạt nano kim loại. Lớp vỏ polymer cũng sẽ làm thay đổi các thông số hình học, điện môi của hạt [23]. Một loại hạt nano composite khác có cấu trúc vỏ kim loại bọc xung quanh một lõi điện môi . Thuộc tính quang học của những hạt nano silica đơn phân tán (còn gọi là các hạt Stöber [55]) có thể bị ảnh hưởng bởi việc bọc xunh quanh một lớp vỏ kim loại mỏng và đồng đều. Khi giữ nguyên kích thước của lõi điện môi, sự dịch chuyển của hấp thụ quang tương đối nhạy với độ dày của lớp vỏ. 1.3.3. Hạt nano từ tính Các hạt nano từ hầu hết là các hợp chất của oxit sắt (Fe3O4 /magnetite Fe2O3 /maghemite) do đó không phải là những hạt kim loại nguyên chất. Tuy nhiên chúng là một trong những công cụ mạnh mẽ và hiệu quả nhất trong sinh học và y học. Có hai loại hạt nano từ tính: (1) các đầu magnetic chứa các hạt nano oxit sắt được bọc bởi mạng lưới polymer-silica và (2) các hạt oxit kim loại nguyên chất trong một dải nm. Các hạt oxit sắt ferromagnetic phân tán đơn domain được gọi là chất lỏng từ và có thể được sử dụng trong các ứng dụng sinh học nếu nó có tính hợp sinh cao. Việc biến tính các đầu magnetic hoặc hạt nano, cho phép chúng có thể gắn với protein hoặc DNA và 6 do đó, sử dụng trong các ứnh dụng phát hiện, chẩn đoán và là tiềm năng trong việc ứng dụng chế tạo các công cụ chẩn đoán và chữa trị hiện đại, ví dụ như trong nhiệt trị tế bào ung thư [58] mà chỉ có các hạt nano từ tính hợp sinh học mới có thể được sử dụng. Hoặc việc sử dụng các hạt nano từ tính và các đầu từ (magnetic bead) làm tác nhân làm mạnh ảnh chụp cộng hưởng từ (MRI) cũng như phát hiện các phân tử sinh học bằng các sensor từ tính. Một ứng dụng khác có thể kể đến là việc tách chiết các phân tử sinh học sử dụng hạt nano từ tính là một trong những kỹ thuật trong các phòng thí nghiệm đang được chuẩn hóa trên toàn thế giới vì ưu điểm tiện lợi, nhanh và rẻ tiền. Ho và các cộng sự (2010) sử dụng các hạt từ tính gắn kháng thể như một đầu dò ái lực hiệu quả cho việc làm giàu có chọn lọc các vi khuẩn từ mẫu dung dịch lỏng [16]. 1.3.4. Chấm lượng tử Chấm lượng tử là những cấu trúc nano tinh thể có thể phát xạ khi bị kích thích trong một dải tần số ánh sáng nào đó. Các loại chấm lượng tử có cấu trúc nano như CdSe, CdS, CdTe trong khoảng 200- 10,000 nguyên tử, đặc điểm nổi bật của chấm lượng tử là thể hiện đặc tính quang học phụ thuộc mạnh vào kích thước và tính chất điện tử [2]. Hình 1.5. Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím (trên) và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới) [61]. Các chấm có thể phát xạ với phổ ánh sáng năng lượng thấp trong một dải rộng, phổ kích thích liên tục, và hơn nữa, chúng rất bền dưới phản ứng quang hóa. Do đặc tính quang học phụ thuộc kích thước, tín hiệu phát quang có thể bao gồm toàn bộ phổ bức xạ vùng nhìn thấy. Đặc điểm này tạo điều kiện cho việc kích thích các chấm lượng tử với kích thước khác nhau ở cùng một thời điểm và làm cho chúng phù hợp với vai trò là các đầu dò phát quang cho việc đánh dấu trong hệ thống sinh học [43]. 1.4. Hạt nano vàng Vàng khối (Au) đứng ở vị trí thứ 79th trong bảng hệ thống tuần hoàn, nó là một trong những vật liệu đầu tiên được con người khám phá, khai thác và sử dụng. Vàng sở hữu bốn tính chất nổi bật: kim loại sáng màu vàng, khả năng chống oxi hóa và ăn 7 mòn rất tốt, độ dẻo cao và khối lượng riêng lớn (19.32 g/cm3). Cấu hình điện tử của vàng (1s2 2s2p6 3s2p6d10 4s2p6d10f14 5s2p6d10 6s1) quyết định thuộc tính quang học, hoạt tính hóa học và cấu trúc tinh thể. Vàng khối có cấu trúc tinh thể lập phương tâm diện (fcc). Mật độ nguyên tử lớn giúp vàng trở nên tương đối khó truyền qua khi bị tác dụng bởi tia X và nó tương tác mạnh với các điện tử trong các kỹ thuật hiển vi điện tử quét (SEM) và hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Vàng được sử dụng làm vật dụng và đồ trang sức quý giá cho con người từ rất xa xưa cho đến ngày nay. Khi vàng khối thông thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano mét, chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. Hạt nano vàng (AuNPs) là các hạt nano tồn tại ở dạng dung dịch huyền phù có độ bền cao của các cụm nguyên tử vàng với các kích thước nằm trong khoảng 1- 100 nm. A C B Hình 1.6. (A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích thước 15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850[38]. Khi ở kích thước nano mét, AuNPs sở hữu nhiều tính chất lý hóa khác nhau so với vật liệu vàng khối [2, 12]. Một ví dụ điển hình nhất đó là sự thay đổi màu sắc từ màu vàng đến đỏ ruby khi vàng khối được chuyển thành các hạt vàng phân tán dạng hạt có kích thước nano mét. Hình 1.7. Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62] 8 Theo thuyết Plasmon, khi trường điện từ của ánh sáng tới đập vào cụm các nguyên tử vàng, các electron tự do bề mặt (6 electron trong trường hợp AuNPs) tồn tại trong vùng dẫn của AuNPs dao động qua lại, do đó tạo nên vùng cộng hưởng plasmon, tại đó có đỉnh hấp thụ trong vùng khả kiến 530-540 nm [26]. Vùng plasmon bề mặt được sử dụng như một chất chỉ thị cho việc hình thành nên các hạt nano vàng từ muối của chúng. Độ nhạy của hấp thụ plasmon bề mặt được làm cơ sở cho cơ chế phát hiện liên quan đến các thiết bị cảm biến sử dụng AuNPs [42]. Các tính chất vật lý của AuNPs phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khoảng cách giữa các hạt (mật độ) và bản chất của chất hoạt động bề mặt được sử dụng để ngăn cản việc kết đám giữa các hạt [2]. Theo lý thuyết Mie, hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt bị biến mất khi kích thước hạt nhỏ hơn 2 nm và lớn hơn 500 nm [12]. Các thanh nano vàng (nanorod) có hai dải cộng hưởng plasmon, một dải là cộng hưởng theo chiều dọc của thanh ở 550-600 nm và một dải còn lại theo chiều vuông góc với thanh ở 520 nm [33]. Dải bước sóng theo chiều dọc của thanh rất nhạy cảm và sự thay đổi hệ số tỉ lệ của thanh sẽ thay đổi vùng hấp thụ từ vùng nhìn thấy tới vùng gần hồng ngoại đỏ (near-infra red-NIR) [32]. Thuộc tính này quang học duy nhất này của các thanh nano vàng được sử dụng trong chữa trị bằng tia hồng ngoại gần và tán xạ Raman được kích thích của các phân tử sinh học được hấp thụ . Do đó, bằng việc thay đổi kích thước và hình dạng của AuNPs, cộng hưởng plasmon có thể phù hợp và đáp ứng với các ứng dụng trong hiện ảnh tế bào, phân phát thuốc và chữa trị. Sáu điện tử tồn tại trong vùng dẫn của hạt nano vàng là đặc điểm khiến chúng trở nên dễ dàng liên kết được với các nhóm thiol và amine [29]. Do đó, AuNPs có thể dễ dàng được gắn bằng các loại protein hoặc các phân tử sinh học giàu axit amine, dẫn đến các ứng dụng sinh học quan trọng bao gồm phân phát thuốc hướng đích [44, 52], hiện ảnh tế bào [4], và biosensor [47]. Hơn nữa, các điện tử tự do khiến cho AuNPs trở nên hữu ích như một tác nhân làm tăng cường độ tương phản [3] . Các nghiên cứu về hiện ảnh được dựa trên các so sánh về độ tương phản bằng việc thay đổi mật độ điện tử trong các mô khác nhau. Với mật độ điện tử cao, AuNPs đóng vai trò như một tác nhân làm tăng độ tương phản một cách tuyệt vời trong việc phát hiện các khối u, vùng đích trong cơ thể. 1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng Nhìn chung, các hạt nano vàng được tổng hợp trong pha lỏng (phương pháp hóa ướt) bằng việc khử axit chloauric (HAuCl4) mặc dù có rất nhiều các phương pháp tiên tiến và độ chính xác cao đã được phát triển. Sau khi hòa tan muối HAuCl4, dung dịch được khuấy nhanh trong khi bổ sung thêm chất khử (natri citrate). Các ion Au3+ được khử về các nguyên tử Au0. Khi ngày càng nhiều các nguyên tử được tạo thành, dung dịch trở nên bão hòa, và các nguyên tử vàng bắt đầu kết hợp lại với nhau để hình thành nên các hạt kích thước bán nano. Các nguyên tử còn lại sẽ tiếp tục bám 9 vào hạt sẵn có, nếu dung dịch được khuấy ở tốc độ phù hợp, các hạt sẽ tồn tại ở dạng đồng đều và bền trong môi trường lỏng và ở dạng huyền phù. Để ngăn cản sự kết đám của các hạt nano vàng, các tác nhân làm bền cũng được sử dụng để bọc lên bề mặt hạt. Các hạt cũng có thể được biến tính bằng với các loại phân đoạn hữu cơ khác nhau để tạo nên dạng hạt lai hữu cơ -vô cơ với những chức năng tiêu biểu [49]. Các hạt nano vàng cũng có thể được tổng hợp bằng phương pháp bắn phá laser. 1.5.1. Phương pháp Turkevich Phương pháp này được phát minh bởi J. Turkevich và các cộng sự vào vào năm 1951 [18, 24] và sau đó được cải tiến bởi G. Frens vào những năm 1970 [13], và là một phương pháp tổng hợp dung dịch nano vàng đơn giản nhất tính cho đến thời điểm hiện tại. Nhìn chung, phương pháp này tạo ra các hạt nano vàng đơn phân tán hình cầu tan trong nước với kích thước đặc trưng từ 10-20 nm. Các hạt lớn hơn cũng có thể được tạo ra bằng phương pháp này nhưng sẽ mất nhiều quy trình công nghệ hơn trong việc duy trì tính phân tán cũng như hình dạng hạt. Quy trình tạo hạt nano vàng liên quan đến phản ứng giữa một lượng dung dịch nóng chloauric HAuCl4 với dung dịch natri citrate. Hạt nano vàng sẽ hình thành bởi vì các ion citrate sẽ bao xung quanh bề mặt lõi vàng, nó đóng cả hai vai trò làm tác nhân khử cũng như tác nhân làm bền hạt nano. Hình 1.8. Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich Để tạo ra các hạt nano vàng lớn hơn, yêu cầu một lượng citrate ít hơn (có thể dưới 0.05% và tuy nhiên, một lượng citrate quá nhỏ sẽ không thể kích thích phản ứng khử hết các ion Au3+). Việc khử bởi một lượng natri citrate sẽ giảm lượng ion citrate sẵn có cho việc bọc xunh quanh hạt nano vàng, điều này sẽ làm cho các hạt nhỏ kết đám với nhau và tạo nên những hạt lớn hơn (cho đến khi tổng diện tích bề mặt của các hạt trở nên đủ nhỏ để được bọc bởi tất cả các ion citrate tồn tại trong dung dịch). 10 1.5.2. Phương pháp Brust Phương pháp này được phát hiện bởi Brust và Schiffrin vào đầu những năm 1990 [37] và có thể được sử dụng để tổng hợp các hạt nano vàng trong dung môi hữu cơ mà thông thường không thể trộn lẫn trong nước (như toluence). Phản ứng đặc của phương pháp giữa axit chloauric và tetraoctylammonium bromide (TOAB) trong toluence và natri borohydrate đóng vai trò lần lượt như chất chống kết tủa và chất khử. Các hạt nano vàng chế tạo theo phương pháp này có kích thước trung bình 5-6 nm. NaBH4 đóng vai trò tác nhân khử, trong khi TOAB đóng vai trò là chất xúc tác chuyển pha và chất làm bền. Một điều quan trọng là TOAB không bọc xung quanh hạt nano một cách vững chắc, nhưng dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2 tuần. Để hạn chế hiện tượng này, một tác nhân làm bền mạnh có thể được sử dụng như thiol (alkanethiol), có thể liên kết cộng hóa trị với hạt nano vàng, tạo ra một dung dịch gần như vĩnh cửu. Alkanethiol bảo vệ hạt nano vàng có thể bị kết tủa nhưng sau đó sẽ được hòa tan lại. Một số tác nhân chuyển pha có thể duy trì việc bọc với các hạt nano sau khi đã làm sạch, việc này có thể gây ảnh hưởng đến thuộc tính vật lý của hạt như tính tan. 1.5.3. Phương pháp Perrault Phương pháp này được phát minh bởi Perrault và Chan trong năm 2009 [51], sử dụng hydroquione để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt nano vàng. Phương pháp này tương tự với phương pháp sử dụng trong việc phát triển film tạo ảnh, trong đó các hạt bạc (Ag) bên trong film lớn dần lên trong khi có sự bổ sung của các nguyên tử bạc được khử ngay trên bề mặt. Tương tự như thế, các hạt nano vàng có thể đóng vai trò là chất cầu nối với hydroquinone để xúc tác việc khử các ion vàng trên bề mặt. Sự tồn tai các chất ổn định như các ion citrate có thể tạo ra việc mọc các hạt có kiểm soát. Phương pháp này có thể tạo ra các hạt nano với kích thước rất lớn trong khoảng 30-250 nm. 1.5.4. Phương pháp Martin Phương pháp này được phát minh bởi nhóm Eah vào năm 2010 [39], phương pháp này tạo ra các hạt nano vàng dạng “trần” trong nước bằng việc khử HAuCl4 với NaBH4 Mặc dù không sử dụng các chất hoạt động bề mặt như citrate, các hạt nano vàng phân tán rất bền. Phân bố kích thước gần như đơn phân tán với đường kính có thể chính xác và tái tổng hợp trong khoảng 3.2 đến 5.2 nm. Chìa khóa cho việc làm bền HAuCl4 và NaBH4 trong dung dịch stock với HCl và NaOH lần lượt trong hơn 3 tháng và hơn 3 giờ. Hơn nữa, tỷ số của các ion NaBH4-NaOH với HAuCl4-HCl phải được kiểm soát chính xác trong vùng gọi là “sweet zone”. Các hạt nano “trần” được bọc với một đơn lớp 1-dodecanethiol và sau đó chuyển pha thành hexane bằng việc lắc hỗn hợp của nước, acetone và hexane trong 30 giây. Do đó, tất các sản phẩm phản 11 ứng kết hợp tồn tại ở pha nước-acetone. Lượng 1-dodecanethiol chỉ chiếm 10% nguyên tử vàng trong tổng số. Tất cả các quy trình phản ứng này chỉ mất dưới 10 phút. Những hạt nano vàng được bọc bởi lớp phân tử hữu cơ kỵ nước có tính chất đặc biệt cho khả năng tự sắp xếp 2 chiều và tính điện trong dung môi không phân cực. Chúng nổi lên ra ngoài phía bề mặt của hạt toluene trong không khí và hình thành một lớp màng mỏng, và hình thành nên đơn lớp và có thể phủ lên bất kỳ loại đế nào khi toluence bay hơi mà không cần bất kỳ thiết bị phức tạp nào. Loại màng đơn lớp chứa các hạt nano vàng gần như đồng đều ở tất cả các kích thước nm, µm và mm, phương pháp này không hạn chế về kích thước chế tạo, do đó nó có thể bao phủ bề mặt của cả miếng silicon tới 3 inch. Việc kiểm soát kích thước chính xác trong khoảng 3.2 – 5.2 nm rất quan trọng cho cả việc chuyển pha của các hạt nano vàng từ nước sang toluence và sự sắp xếp chiều của chúng trên giọt toluence. 1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis) Một phương pháp khác được sử dụng để tạo ra các hạt nano vàng đó là phương pháp rung siêu âm. Phương pháp này dựa trên việc sử dụng sóng siêu âm, nó kích thích phản ứng giữa muối vàng chloauric và dung dịch glucose, các tác nhân khử là các nhóm hydroxyl (hình thành giữa khư vực biên giới của giữa các lỗ trống hỗn loạn và nước dạng khối). Dạng hình thái hạt nano vàng đạt được là các dây nano dạng mảnh (nanoribbon) với chiều rộng khoảng 30-50 nm và chiều dài lên tới vài micromets. Những dải dây nano này rất dẻo và linh hoạt và có thể uốn cong với góc lớn hơn 900. Khi glucose được thay thế bởi cyclodextrin (một loại phân đoạn của glucose) thì có các hạt nano hình cầu được hình thành, điều này chứng minh cho viêcn glucose đóng vai trò rất quan trọng trong việc quyết định hình thái và kích thước của cấu trúc nano vàng. 1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs Hạt nano vàng là một vật liệu quý, ít nhất là ở kích thước nano mét, chúng thu hút được chú ý rất lớn của các nhà khoa học cùng với vô số những ứng dụng đang gia tăng hàng ngày. Một trong những lĩnh vực đã được phát triển rất mạnh trong những thập kỷ qua đó là việc sử dụng các hạt nano vàng trong lĩnh vực y sinh học hay khoa học sự sống. Những ứng dụng y sinh này có thể chia thành bốn lĩnh vực: đánh dấu sinh học, phân phát thuốc, đốt nhiệt và cảm ứng [54]. 12