Tài liệu Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL DISULFID LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL DISULFID LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.Nguyễn Hải Nam Nơi thực hiện đề tài: Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Bộ môn Hóa Dược cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại bộ môn. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Hải Nam, ThS. Trần Lan Hương đã tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập cũng như hướng dẫn khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy cô thì em nghĩ bài luận văn này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cám ơn thầy cô. Em cũng xin cám ơn tới thầy Lê Xuân Kỳ - Bộ môn Hóa lý, các anh chị kỹ thuật viên ở bộ môn Hóa Phân tích, các anh chị ở Khoa Hóa Pháp – Viện pháp y quốc gia, các anh chị đồng nghiệp ở chuyên ngành kiểm nghiệm lớp cao học 19 đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thiện luận văn này. Bài luận văn này được thực hiện trong khoảng thời gian dài. Bước đầu đi vào thực tế tìm hiểu về lĩnh vự sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức của em còn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được các ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô ở bộ môn Hóa Dược và GS.TS. Nguyễn Hải Nam, ThS.Trần Lan Hương thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Trân trọng cám ơn Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2015 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các tạp chuẩn đã được thiết lập bởi các cơ sở trong nước 2 Bảng 1.2: Một số chế phẩm có chứa Captopril 4 Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa thế điện cực với lượng Iod thêm vào 33 Bảng 3.2: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng cắn thu được Bảng 3.3: Tương quan giữa nồng độ và thể tích Iod thêm vào với khối lượng cắn Bảng 3.4: Tương quan giữa khối lượng cắn với pH đệm 38 Bảng 3.5: Tương quan giữa khối lượng cân và lượng dung môi thêm Vào Bảng 3.6: Thể tích dung môi cần thiết để hòa tan vừa đủ 1 lượng chất đã tổng hợp Bảng 3.7: Kết quả đo phổ hồng ngoại 41 Bảng 3.8 : Kết quả đo phổ khối lượng 45 Bảng 3.9: Kết quả đo phổ NMR của Captopril Disulfid 46 Bảng 3.10: Kết quả xác định độ tinh khiết bằng đo quét nhiệt vi sai 48 Bảng 3.11: Thông số sắc ký đồ của Captopril Disulfid 53 Bảng 3.12: Thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết khi chạy độ ổn định. Bảng 3.13: Cách pha dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính 53 Bảng 3.14: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic 55 Bảng 3.15: Kết quả độ chính xác của phương pháp 57 Bảng 3.16: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp 58 Bảng 3.17: Kết quả định lượng Captopril Disulfid trong mẫu tổng hợp 61 2 40 41 42 44 55 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của Captopril chuẩn 4 Hình 1.2: Kết quả sau khi chạy sắc ký 9 Hình 1.3: Phân tích thông số sắc ký 9 Hình 1.4: Phố khối lượng của sản phẩm sau khi phản ứng với KBrO3 15 Hình 1.5: Cấu trúc cột LC-DB 22 Hình 1.6: Cấu trúc cột có gốc Isopropyl 23 Hình 3.1: Biểu đồ mối tương quan giữa thế điện cực với lượng Iod thêm vào Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng khi chạy sản phẩm sau tổng hợp 33 Hình 3.3: Phân tích phổ khối lượng của sản phẩm 35 Hình 3.4: Mối tương quan giữa dE/dV với thể tích Iod thêm vào 36 Hình 3.5: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng cắn Hình 3.6: Kết quả đo phổ khối lượng 39 Hình 3.7: Nhiệt độ nóng chảy và điểm chảy 44 Hình 3.8: So sánh phổ hồng ngoại giữa Captopril Disulfid với Captopril Hình 3.9: Sắc ký đồ thể hiện sự tinh khiết của hợp chất 45 Hình 3.10: Sắc ký đồ khi chạy DSC 47 Hình 3.11: Sắc ký đồ chạy theo dược điển anh 49 Hình 3.12: Sắc ký đồ sau khi thay đổi thể tích tiêm 49 Hình 3.13: Sắc ký đồ chạy hệ dung môi I 50 Hình 3.14: Sắc ký đồ khi chạy hệ dung môi II 50 Hình 3.15: Sắc ký đồ khi chạy hệ dung môi III 50 Hình 3.16: Sắc ký đồ chạy với tốc độ dòng 1,0 ml/min 51 Hình 3.17: Sắc ký đồ chạy với tốc độ dòng 1,2 ml/min 51 Hình 3.18: Sắc ký đồ khi chạy với 2 bước sóng 52 34 42 47 Hình 3.19: Sắc ký đồ của Captopril Disulfid 52 Hình 3.20: Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu – mẫu trắng 54 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu chuẩn 54 Hình 3.22: Sắc ký đồ mẫu thử 54 Hình 3.23: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic 56 Hình 3.24: Tương quan giữa lượng thêm vào và lượng tìm lại 59 Hình 3.25: Độ mất khối lượng do làm khô 60 2 Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN....................................................................................................... 1 1.1. CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM .......................... 1 1.1.1. Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11].............................................................. 1 1.1.2. Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10]........................................................... 1 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL.................................................................................... 2 1.1.1. Công thức, tính chất .............................................................................................. 2 1.1.2. Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định : ...................................................................... 3 1.3. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ PHẨM CHỨA CAPTOPRIL ........................................................................................................................... 4 1.3.1. Định tính ............................................................................................................... 4 1.3.2. Định lượng............................................................................................................. 5 1.3.3. Tạp chất liên quan ................................................................................................. 6 1.4. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID ................................................................. 9 1.4.1. Công thức, tính chất .............................................................................................. 9 1.4.2. Độc tính [18] [24] [42] [44] [45]........................................................................... 10 1.4.3. Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid ............................................... 10 1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP LIÊN KẾT DISULFID ............................... 11 1.5.1. Phương pháp 1 [27] ............................................................................................. 11 1.5.2. Phương pháp 2 [32] ............................................................................................ 12 1.5.3. Phương pháp 3 [37] ............................................................................................ 12 1.5.4. Tác nhân oxy hóa là Na2 S4 O6 [28]........................................................................ 13 1.5.5. Tác nhân oxy hóa là K 3 (Fe(CN)6 ) [30] [38]........................................................... 14 1.5.6. Tác nhân oxy hóa là H 2 O2 [47]............................................................................. 15 1.5.7. Với tác nhân oxy hóa là Br2,KBrO3 [25] .............................................................. 15 1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ [5]............... 16 1.6.1. Phổ IR ................................................................................................................. 16 1.6.2. Phổ khối – Mass spectrum ................................................................................... 17 1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân................................................................................ 17 1.7. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [1][4][46] ............................. 18 1.7.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 18 1.7.2. Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký ............................................................ 18 1.7.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC....................................................... 20 1.7.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký............................................... 21 1.7.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................................. 24 1.8. QUÉT NHIỆT VI SAI ................................................................................................ 25 1.9. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [10]..................................................... 26 1.9.1. Yêu cầu chung ..................................................................................................... 26 1.9.2. Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp ......................................................... 26 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 28 2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................. 28 2.1.1. Hóa chất, thuốc thử ............................................................................................. 28 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 28 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 28 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 28 2.2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 29 2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả .................................................................... 32 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ....................................................................... 33 3.1 NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM.................................................................................................. 33 3.1.1 Lựa chọn phương pháp và khảo sát điều kiện tổng hợp Captopril Disulfid ......... 33 3.1.2 Tinh chế Captopril Disulfid ................................................................................. 42 3.1.3 Quy trình bán tổng hợp và tinh chế Captopril Disulfid ....................................... 43 3.2 XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CAPTOPRIL DISULFID....................................................................................................... 43 3.2.1 Đặc điểm cảm quan ............................................................................................. 43 3.2.2 Nhiệt độ nóng chảy - DSC.................................................................................... 43 3.2.3 Kết quả đo phổ .................................................................................................... 44 3.2.4 Độ tinh khiết của hợp chất................................................................................... 47 3.3 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU ........................................ 48 3.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích.................................................. 48 3.3.2 Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Capotpirl Disulfid trong mẫu đã tổng hợp được........................................................................................................ 60 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN ...................................................................................................... 62 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………….66 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Tạp chuẩn trong kiểm nghiệm dược phẩm là chất chuẩn của các tạp chất liên quan trong nguyên liệu làm thuốc hoặc thuốc thành phẩm. Các nguyên nhân dẫn đến xuất hiện tạp chất liên quan: có sẵn trong nguyên liệu điều chế, tạo ra trong quá trình điều chế, xuất hiện trong quá trình bảo quản nguyên liệu làm thuốc và thuốc thành phẩm. Thông thường giới hạn tạp chất liên quan được kiểm soát bằng cách so sánh đáp ứng (ví dụ: diện tích pic trong kỹ thuật HPLC) của tạp chất so với đáp ứng của hoạt chất chính trong cùng điều kiện. Tuy nhiên với những tạp chất ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả điều trị, tác dụng không mong muốn hoặc thường xuất hiện với tỷ lệ lớn thì có yêu cầu định lượng hàm lượng tạp chất. Việc định lượng này bắt buộc phải có tạp chuẩn để so sánh. Đối với các hội đồng Dược Điển Anh, Mỹ, Nhật Bản thì các tạp chuẩn cần thiết luôn được cung cấp bởi bộ phận chuyên trách thuộc hội đồng Dược Điển. Trong đó Captopril Disulfid là sản phẩm oxy hóa của Captopril. Trong các chuyên luận dược điển về nguyên liệu và các dạng bào chế của Captopril thường có chỉ tiêu yêu cầu định lượng tạp chất Captopril Disulfid. Lý do là vì tạp chất này thường xuất hiện với tỷ lệ cao, ảnh hưởng đến độ tinh khiết hóa học của thuốc. Hiện tại, tạp chuẩn Captopril Disulfid cũng như nhiều tạp chuẩn khác phải mua từ nước ngoài với giá cao. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn Captopril Disulfid” Mục tiêu đề tài: 1. Nghiên cứu bán tổng hợp được Captopril Disulfid từ Captopril ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Thiết lập được một số tiêu chí của tạp chuẩn Captopril Disulfid dùng trong kiểm nghiệm. CHƯƠNG I : TỔNG QUAN CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM 1.1. 1.1.1. Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11] Hiện nay, theo dược điển Việt Nam IV thì hầu các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm đều phải sử dụng chất chuẩn để so sánh và đối chiếu. Gồm có các dạng: Dạng nguyên chất - neat : ưu điểm của loại này là có hạn dài, có thể pha ra các loại nồng độ khác nhau. Tuy nhiên dạng này cũng đòi hỏi trình độ pha chế chuẩn, ngoài ra một số chất chuẩn đòi hỏi pha chế trong điều kiện tiêu chuẩn như Aflatoxin, Asen, đồng vị phóng xạ. Dạng pha chế sẵn - ready to use : ưu điểm là có nồng độ rất tin cậy, tuy nhiên khi đặt cần đặc biệt chú ý về dung môi của chất chuẩn. Các dung môi nên gần nhất với dung môi pha mẫu. Thông thường các dung môi là nước, Methanol, Aceton, Acetonitril, n-Hexan, Dichloromethan, acid HCl, HNO3. Hỗn hợp chuẩn - Mix là hỗn hợp các chất chuẩn pha trong một loại dung môi có nồng độ biết trước. hỗn hợp chuẩn có ưu điểm dùng trong phân tích đa thành phần với các yếu tố ảnh hưởng. Người sử dụng có thể quan sát thời gian lưu, cường độ tín hiệu tương đối của các cấu tử trên tài liệu đi kèm chất chuẩn. Mẫu chuẩn - Reference certified material : Gần như hỗn hợp chuẩn nhưng thành phần và nồng độ các cấu tử mô phỏng một mẫu có thật trong tự nhiên ví dụ mẫu nước thải, mẫu bùn thải, mẫu ngô nhiễm nấm, mẫu thép. 1.1.2. Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10] Theo dược điển Việt Nam 4 thì có hơn 20 chuyên luận về dạng bào chế có yêu cầu bắt buộc phải sử dụng tạp chuẩn. Trên thực tế hiện nay các cơ sở trong nước mới chỉ đáp ứng được một số tạp chuẩn như bảng sau: Bảng 1.1- Các tạp chuẩn đã được thiết lập bởi các cơ sở trong nước Tên Tạp Chuẩn STT 1 Acid 7-ADCA 2 4-Aminophenol Hoạt chất Các Cephalosporin Paracetamol Nguồn gốc tạp Nguyên liệu tổng hợp Nguyên liệu tổng hợp Sản phẩm phụ trong 3 4-Chloroacetanilid Paracetamol quá trình tổng hợp hoạt chất 2-amino-1-(44 nitrophenyl) propan-1,3- Cloramphenicol Sinh ra khi bảo quản diol Do nhu cầu sử dụng hạn chế, có ít nhà cung cấp nên giá thành của tạp chuẩn thường cao gấp nhiều lần so với chất chuẩn dược chất. Đặc biệt khác với chất chuẩn dược chất, một số tạp chuẩn thường không có sẵn ở nhà máy, mặt khác giá thành chất chuẩn của tạp chất là cao dẫn đến khó khăn triển khai các tiêu chuẩn này trên thực tế, khó tuân thủ các tiêu chuẩn dược điển của nguyên liệu và thành phẩm. 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL 1.1.1. Công thức, tính chất  Công thức hóa học :  Tên khoa học : Acid 1-(3-mercapto-2-methylpropanoyl) pyrolidin-2-carboxylic 2  Công thức phân tử :  Tính chất: C9H15NO3S ; M = 217,28; Bột kết tinh màu trắng ngà, ở 25oC: tan tốt trong nước (160 mg/ml), ethanol, methanol, methylclorid, tan trong glyceryl triacetat (20 mg/ml), trong dung dịch NaOH loãng, rất ít tan trong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml). Nhiệt độ nóng chảy: 105oC – 108oC. Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là αD25 = - 127,8o, hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5o. Hằng số phân ly trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH). Hệ số phân bố logP (octhanol/nước) = 0,34, logP (CH2Cl2/nước(pH=2)) = 1,39, logP (octhanol/HCl 0,1M) =1,9. [6] [12] [13] [14] 1.1.2. Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định : 1.1.2.1.Dược động học :[3] [8] Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có F tuyệt đối là 60% - 75%, Cmax trong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống. Captopril liên kết với protein khoảng 30%. Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40% - 50% đào thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành dạng Captopril Disulfid và Captopril-Cystein. Captopril có t1/2= 2–3h, Cls=13,33 ml/min/kg. 1.1.2.2.Dược lực học [3] [8] [33] Captopril có tác dụng ức chế enzym chuyển Angiotensin I→Angiotensin II, giảm tái hấp thu muối nước ở ống thận nên hạ huyết áp, giảm tiết các yếu tố gây phì đại cơ tim và phì đại mạch máu. Captopril được chỉ định trong điều trị tăng huyết áp, điều trị suy tim, đau thắt ngực, bệnh thận do tiểu đường phụ thuộc Insulin có protein niệu > 300mg/24h. 1.1.2.3.Chỉ định và tác dụng không mong muốn [3] [8] [33] Liều dùng: Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự tăng giảm phụ thuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày. Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75- 3 100 mg/ngày, với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉnh liều cho phù hợp với từng đối tượng. Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày ở bảng 1.2 Bảng 1.2 : Một số chế phẩm có chứa Captopril Biệt dược Lopril Ecazide Captopril STADA®25 DH-CaptoHasan 1.3. Nồng độ/Hàm lượng Captopril 25 mg Captopril 50 mg Captopril 50 mg + Hydroclothiazid 25mg Captopril 25 mg Captopril 25 mg Dạng thuốc Viên nén Hãng sản xuất Bristol-myers Ssquibb Bristrol-myers Ssquibb Stadapharm GmnH Hasan KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ PHẨM CHỨA CAPTOPRIL 1.3.1. Định tính 1.3.1.1. Nguyên liệu Captopril Dựa vào phổ hấp thụ hồng ngoại của nguyên liệu phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của Captopril chuẩn. [20] Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của Captopril chuẩn. 4 1.3.1.2. Chế phẩm chứa Captopril A. Cân một lượng bột viên tương ứng với 50 mg Captopril, thêm 5 ml ethanol 96% (TT), lắc kỹ 5 phút, lọc. Lấy 2 ml dịch lọc, thêm một vài tinh thể natri nitrat (TT) và 10 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT), lắc mạnh, xuất hiện màu đỏ. B.Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic Captopril trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn. 1.3.2. Định lượng 1.3.2.1. Nguyên liệu Captopril [17] Định lượng Captopril bằng phép đo Iod Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I2. Hòa tan 0,15g chế phẩm trong 30,0 ml nước cất. Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin). Phương trình phản ứng : 2R SH -2e R S S + R + 2H Nhận xét :  Phương pháp có trong dược điển Việt Nam (IV), dược điển anh (BP2009) và nhiều tiêu chuẩn cơ sở khác .  Phương pháp định lượng thực hiện đơn giản. Tuy vậy, nếu trong nguyên liệu có các tạp khử hoặc oxy hóa khác có thể dẫn đến sai số. Đồng thời, Captopril có nhiều mức oxy hóa nên bước nhảy thế có thể diễn ra ở nhiều mức khác nhau, điều này cũng sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng. 1.3.2.2. Chế phẩm chứa Captopril [17] Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng Pha động: Hỗn hợp methanol - nước - acid phosphoric (550 : 450 : 0,5). 5 Dung dịch chuẩn: Dung dịch có nồng độ Captopril chuẩn 0,01% và Captopril Disulfid chuẩn 0,0005% trong pha động. Dung dịch thử: Cân 20 viên (đã loại bỏ lớp vỏ bao, nếu là viên bao), nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg Captopril vào ống ly tâm, thêm 25,0 ml pha động, để siêu âm 15 phút và ly tâm. Pha loãng 1 ml dịch trong ở trên thành 10,0 ml với pha động. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (10 m). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 20 l. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị, khi hệ số phân giải giữa pic Captopril và pic Captopril Disulfid trong sắc ký đồ thu được ít nhất là 2,0. Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng Captopril, C9H15NO3S, trong viên dựa vào diện tích (hay chiều cao) pic Captopril thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nồng độ C9H15NO3S của dung dịch chuẩn 1.3.3. Tạp chất liên quan 1.3.3.1. Phương pháp 1: Phương pháp sắc ký lỏng (theo ĐVN IV) Đối với tạp chất là Captopril Disulfid Pha động:Acid phosphoric - methanol - nước (0,05 : 50 : 50). Dung dịch thử: Hoà tan 50 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng bằng pha động thành 100,0 ml. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 2,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha động. 6 Dung dịch đối chiếu (2): Hoà tan 10 mg chế phẩm trong pha động, thêm 1 ml dung dịch iod 0,05 M rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng pha động. Lấy 10,0 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm pha động đến vạch. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (12,5 cm  4 mm), chất nhồi octylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (TT) (5 µm). Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm. Thể tích tiêm: 20 µl. Thời gian chạy sắc ký: Gấp 3 lần thời gian lưu của Captopril. Cách tiến hành: Xác định tính thích hợp của hệ thống: Tiêm dung dịch đối chiếu (2). Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) có 3 pic. Độ phân giải giữa hai pic cuối ít nhất là 2,0. Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1): Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào không được lớn hơn ½ lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1,0%). Tổng diện tích của tất cả các pic phụ trừ các pic có diện tích bằng hoặc nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2%) và diện tích các pic có thời gian lưu nhỏ hơn 1,4 phút) không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). (2,0%). 1.3.3.2. Phương pháp 2: Chạy sắc ký lỏng – gradient [41] Dung dịch A: Methanol Dung dịch B: 0.1 % Acid Trifluoroacetic trong nước. Dung môi pha loãng: Acid Trifluoroacetic : Nước : acetonitrile = 0.1:90:10 Chương trình chạy Gradient: 7 Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B(%) 0.00 10 90 5.00 10 90 15.00 50 50 20.00 50 50 20.01 10 90 25.00 10 90 Dung dịch phù hợp: 0.50 mg/mL of USP Captorpril RS trong hệ dung môi pha loãng. Dung dịch chuẩn : 2.0µg/ml của USP Captopril RS, USP Captopril Disulfid RS, tạp USP Captopril B RS, tạp USP Captopril C RS, tạp USP Captopril D RS, tạp USP Captopril E RSvà tạp USP Captopril J RS trong hệ dung môi pha loãng. Dung dịch mẫu : 2.0 mg/mL của Captopril trong hệ dung môi pha loãng Điều kiện sắc ký : Phát hiện : UV : 220nm hoặc MS : ES Scan ( + hoặc –): Hiệu điện thế U= 500(V) Dòng khí : 8 lít/phút Phun sương : 35psig Nhiệt độ làm khô : 300oC. Cột : 15cm x 4,6mm; 2,7µm L60 Tốc độ dòng : 0.7 ml/min Nhiệt độ cột : 40oC Thể tích tiêm : 10µl 8 Hình 1.2: Kết quả sau khi chạy sắc ký Hình 1.3 : Phân tích thông số sắc ký 1.4. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID 1.4.1. Công thức, tính chất  Công thức hóa học: [32] 9  Tên khoa học: 1,1'-[Disulfanediylbis-[(2S)-2-methyl-1-oxopropane-3,1-diyl]]-bis[(2S)pyrrolidine-2-carboxylic] Acid  Công thức phân tử : C18H28N2O6S2 ;  Tính chất: M = 432,555; Bột kết tinh màu trắng ở 25oC. Độ tan trong nước ở 25oC (dự đoán) < 120mg/l (vì từ công thức chỉ thấy có 2 vị trí cho liên kết hydro). Dự đoán tan tốt trong các dung môi không phân cực như: ethyl acetat, Methanol, Acetonitril, Di methyl sulfoxid. Có 2 giá trị pKa: pKa1 < 3,7; pKa2 > 3,7. 1.4.2. Độc tính [18] [24] [42] [44] [45] Mắt: Rất nguy hiểm khi tiếp xúc với mắt – chất được tìm thấy gây mẫn cảm với mắt của chuột lang. Những dữ liệu về nghiên cứu trên người cho biết: khi tiếp xúc lâu dài có thể gây tổn thương thận, rối loạn thai sản (Thai nhi và trẻ sơ sinh bị chấn thương). Đã có báo cáo về trường hợp gây quái thai. Hiện đã có tụt huyết áp ở trẻ sơ sinh, suy thận, kém phát triển của hộp sọ và phổi, thiếu nước ối, và chậm phát triển và chi co ở thai. Thai chết lưu hoặc sẩy thai có thể xảy ra. Có thể gây ra tăng trưởng ở các tuyến, nhưng hiếm khi gây ra bệnh ung thư ác tính. Tiếp xúc với một lượng nhỏ có thể gây ra phản ứng quá mẫn cấp tính đặc trưng bởi sự co thắt phế quản, phát ban, phù chảy nước mũi (viêm mũi) và mờ mắt. Sốc phản vệ và phát ban da - ban xuất huyết có thể xảy ra. 1.4.3. Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid 1.4.3.1. Các sản phẩm oxy hóa (A) (B1) 10 (B2) (C) Thứ tự mức độ oxy hóa của Captopril: A→B1/B2 → C 1.4.3.2. Sản phẩm thủy phân (D1) 1.5. (D2) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP LIÊN KẾT DISULFID 1.5.1. Phương pháp 1 [27] Phương trình phản ứng: Cơ chế phản ứng : Theo cơ chế : kim loại có hóa trị thay đổi 11