Tài liệu Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của phytohormon đến sự phát sinh cơ quan của loài lan ý thảo

i TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HIÊN BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA PHYTOHORMON ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LOÀI LAN Ý THẢO (Dendrobium gratiosissimum) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sƣ phạm Sinh học Phú Thọ, 2017 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HIÊN BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA PHYTOHORMON ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LOÀI LAN Ý THẢO (Dendrobium gratiosissimum) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sƣ phạm Sinh học GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN: TS. CAO PHI BẰNG Phú Thọ, 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới giảng viên hƣớng dẫn thầy giáo TS. Cao Phi Bằng đã hƣớng tận tình, quan tâm hƣớng dẫn và động viên tôi hoàn thành khóa luận. Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh h c – Trƣờng Đ i h c H ng Vƣơng – Th xã Ph Th – T nh Ph Th đã t o điều kiện và gi p đỡ tôi sử dụng các trang thiết b , hóa chất...trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đ o trƣờng Đ i h c Hùng Vƣơng, c ng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Khoa h c Tự nhiên đã t o điều kiện gi p đỡ để tôi nghiên cứu và thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, b n bè, những ngƣời đã luôn bên c nh động viên, gi p đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Rất mong nhận đƣợc sự ch bảo, góp ý từ phía quý Thầy (Cô) để khóa luận của tôi đƣợc đầy đủ hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hiên ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC : Than ho t tính BAP : Benzylamino purine CTTN : Công thức thí nghiệm ĐC : Đối chứng GA3 : Axít giberellic IAA : Indole acetic acid KC : Knudson C MS : Murashige & Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid PLSs : Protocorm TDZ : Thidiazuzon iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là protocorm. ...........................22 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................23 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................25 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................25 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ..........................................................................................27 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ......................................................................................28 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................29 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của Kinetin đến số lá chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................30 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của Kinetin đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................30 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và NAA đến sự phát sinh chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) sau 8 tuần nuôi cấy .................................31 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa Kinetin và NAA đến sự phát sinh chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) sau 8 tuần nuôi cấy .............................32 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ................................................................33 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ................................................................34 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến chiều cao của chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ............................................................35 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng kéo dài chồi in vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .................................................................................................36 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .......................................................................................................37 iv DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là protocorm. .........................................23 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................24 Hình 3.3. Chồi cây in vitro trên công thức B1K0 và B0K0 ......................................24 Hình 3.4. Chồi cây in vitro trên công thức B0K0 và B1K0 ......................................26 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ...........................................................................................27 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .......................................................................................28 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................34 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................34 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến chiều cao của chồi in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................35 Hình 3.10. Chồi in vitro trên các công thức B0, B2, B15 và B25 ............................37 v MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài .........................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa h c và thực tiễn.................................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa h c ................................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .............................................3 1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng thảo (Dendrobium) ..........................................3 1.1.1. V trí phân lo i và phân bố ................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................3 1.1.3. Lan Ý thảo (D. gratiosissimum) .......................................................................5 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật........................................6 1.2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................6 1.2.2. L ch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................6 1.2.3. Cơ sở khoa h c của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật ..............................7 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào ..............................................................................7 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ....................................................7 1.2.3.3. Sự trẻ hóa .......................................................................................................8 1.2.4. Các giai đo n trong kỹ thuật nhân giống in vitro ..............................................8 1.2.5. Môi trƣờng nuôi cấy ..........................................................................................9 1.2.5.1. Thành phần của môi trường ...........................................................................9 1.2.5.2. pH của môi trường .......................................................................................11 1.2.5.3. Tính thẩm thấu của môi trường ...................................................................12 1.2.6. Tầm quan tr ng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................12 1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hoàng thảo ................................................................13 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................13 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................14 CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..17 2.1. Đối tƣợng và ph m vi nghiên cứu ......................................................................17 2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................17 2.3.1. Phƣơng pháp luận............................................................................................17 2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................17 vi 2.3.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu .......................................................................21 2.3.4. Phƣơng pháp phân t ch và xử l số liệu ..........................................................21 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................22 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .......................................................................................................22 3.2. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .......................................................................................................26 3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .................................................................................................27 3.4. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa Kinetin và NAA đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .........................................................31 3.5. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .........................................................33 3.6. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng kéo dài chồi in vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) ........................................................................................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................38 1. Kết luận .................................................................................................................38 2. Kiến ngh ...............................................................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................39 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay với nền kinh tế ngày càng phát triển, thì nhu cầu vật chất của con ngƣời ngày càng đƣợc cải thiện và nâng cao. Và đặc biệt nhu cầu tinh thần của ngƣời dân là không thể thiếu. Một trong những cách mà con ngƣời đã ch n để làm đẹp cho cuộc sống của mình là trồng hoa và cây cảnh. Việc lựa ch n từng lo i hoa trồng tùy theo sở thích, vẻ đẹp của hoa và điều kiện nuôi trồng. Trong đó, hoa lan là một trong những giống hoa đƣợc nhiều ngƣời ƣa th ch bởi không ch về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp sang tr ng và trang nhã. Hoa lan là loài hoa vƣơng giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trò quan tr ng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngoài ra chúng có hình dáng, màu sắc, k ch thƣớc phong ph và đa d ng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nên ch ng đƣợc sản xuất khá phổ biến [1]. T nh đến hiện nay có hơn 25.000 loài lan khác nhau, ở Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng [5]. Trong số đó, Dendrobium là giống khá phong phú từ màu sắc, d ng hoa cho đến giống, loài. Mặt khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, siêng hoa và lâu tàn. Do đó, nó đƣợc ƣa chuộng và đƣợc trồng phổ biến ở nƣớc ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống. Lan Ý thảo hay lan Hoàng thảo Ý thảo, Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum) là một trong những loài lan thuộc nhóm Dendrobium, hoa thƣờng nở vào m a xuân thƣờng nở vào khoảng từ tháng 3 đến tháng 5, cánh có màu trắng với chóp có màu tím nh t ở giữa có một đốm màu vàng. Đây là loài lan đƣợc m i ngƣời ch n lựa trên th trƣờng bởi vẻ đẹp và giá tr của nó [12]. Ở Việt Nam phần lớn lan đƣợc trồng hiện nay là đƣợc đem từ rừng về hoặc nhân giống bằng các phƣơng pháp truyền thống nhƣ tách nhánh, gieo h t… Nhƣng hiệu quả không cao, chất lƣợng cây giống không đảm bảo, khó đáp ứng đủ nhu cầu cho ngƣời tiêu d ng trong nƣớc cũng nhƣ xuất khẩu. Mặt khác, Ý thảo là loài lan đơn thân nên việc nhân giống bằng phƣơng pháp truyền thống cho hệ số nhân không cao, không đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời dùng. Trong khi đó, nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro khắc phục đƣợc những h n chế của các phƣơng pháp nhân giống truyền thống và có nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, t o ra cây 2 giống s ch bệnh, cây con t o ra đồng đều về mặt di truyền, có chất lƣợng tốt, có sức kháng bệnh rất cao, giảm chi ph sản xuất [1, 26]. Trong quá trình nhân giống in vitro, các điều kiện môi trƣờng dinh dƣỡng, các chất điều hoà sinh trƣởng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng không nhỏ đến hệ số nhân của chồi, quá trình t o các cơ quan hình thái của cây cũng nhƣ sự sinh trƣởng phát triển và chất lƣợng của cây [3]. Vì vậy, tôi đã lựa ch n đề tài: "Bƣớc đầu nghiên cứu ảnh hƣởng của phytohormon đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Ý thảo (Dendrobium gratiosissimum) ”. . M c ti u đề tài Bƣớc đầu đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hoà sinh trƣởng đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum). 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa h c làm cơ sở đánh giá những tác động của chất điều hòa sinh trƣởng đến hệ số nhân và chất lƣợng chồi cây in vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum). 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum), góp phần sản xuất giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên đ a bàn t nh Phú Th . 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố Giới: Plantae Bộ: Asparagales H : Orchidaceae Phân h : Epidendroideae Chi: Dendrobium Giống lan Dendrobium đƣợc đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium có nguồn gốc từ Hy L p, Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống. Dendrobium rất phong phú về chủng với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Châu Úc [6]. Trên thế giới chi lan Hoàng thảo có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các v ng n i từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển [15]. Các đ i diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc m n trên đá, ch ng thƣờng m c ở nơi ẩm, với độ cao 500 – 1500m so với mực nƣớc biển, cũng có khi gặp chi lan này m c ở độ cao 200m hoặc tới 2000m so với mực nƣớc biển. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Lan Dendrobium có thể chia thành hai nhóm theo d ng thân của chúng: - D ng thòng (Nobile) là d ng thân mền thƣờng ở vùng có khí hậu mát mẻ, hoa đƣợc t o ra từ chồi sơ khởi của giả hành đã trƣởng thành, gồm: Giả h c, H c vĩ, Long tu, Phi điệp vàng… - D ng đứng (Phalaenopsis) là d ng thân cứng thƣờng sống ở vùng khí hậu nóng hơn, hoa đƣợc m c ở giả hành cú lẫn giả hành mới. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở ng n là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa, gồm: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo h , Ý thảo, Thủy tiên… Chi Hoàng thảo có một số đặc điểm sau: - Thân: Chi lan Hoàng thảo là cây thân thảo m c cụm, thẳng đứng hoặc rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số t các loài sống bám trên đá, 4 trong rừng ẩm. Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhƣng l i chứa diệp lục, dự trữ nƣớc và nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới. Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã c ng với lá làm nhiệm vụ quang hợp [6]. Thân của các đ i diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình ch y, ... có chiều dài từ 2-3cm đến 120cm. Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, đôi khi hình 4 c nh thay đổi từ 0,3-1,5cm. Phần gốc, nơi xuất phát của rễ thƣởng nhỏ mảnh nhƣng cũng có thể phình to [7]. - Rễ: Rễ của các đ i diện chi Hoàng thảo là rễ kh sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, ch ng thƣờng ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống. Ở một số loài đƣợc bao b c bởi lớp mô h t ẩm dày bao gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy không kh do đó có ánh lên màu xám b c. Chiều dài rễ từ 0,10,3cm; rễ thƣờng m c từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân một vài loài. - Lá: Lá m c thành hai dãy so le, không có cuống mà ch có bẹ ôm lấy thân. Lá thƣờng cứng, d ng đa bóng, bề mặt thƣờng nhẵn, đôi khi bề mặt và bẹ lá (thƣờng khi lá non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng [7]. - Cụm hoa: Cụm hoa ch m thƣờng nhiều hoa hoặc t hoa. Cụm hoa dài thƣờng rũ thõng xuống, nhiều loài hoa có giá tr làm cảnh [7]. - Hoa: Hoa lƣỡng t nh, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa d ng, sặc sỡ. Hoa đa số có loài có hƣơng thơm. Bao hoa chia hai vòng. Vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên. Vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi [7]. - Cằm: Là một bộ phận đƣợc hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên d nh nhau và d nh với chân cột. Cằm có các hình bán cầu, hình t i đến hình cựa, hình trụ cong t nhiều [7]. - Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn l i của bao hoa cả về màu sắc, k ch thƣớc và trang tr . Trang tr đa d ng trên cánh môi nhƣ đốm, v ch, diềm tua, u lồi, đƣờng sống, lông phủ chiếm v tr khá quan tr ng trong phân lo i. Nhiều loài có gốc cánh môi dính với chân cột t o thành cựa [7]. - Quả: Quả nang thƣờng hình ch y hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều h t nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. H t rất nhỏ, hầu nhƣ không tr ng lƣợng, bao quanh h t là lớp màng d ng mắt võng, trong suốt chứa đầy không kh dễ dàng bay cùng h t trong không kh nhờ gió [7]. 5 - H t: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 h t, đôi khi đến 3 triệu h t nên h t lan có k ch thƣớc rất nhỏ, phôi h t chƣa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng h t chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tƣơng th ch trong điều kiện phù hợp h t sẽ nảy mầm [7]. 1.1.3. Lan Ý thảo (D. gratiosissimum) Lan Ý thảo là cây thân thảo, m c thành cụm, với thân tròn có đốt đƣợc bao quanh bằng bao vỏ lâu rụng và chặt, sống chủ yếu là lâu năm, biểu sinh trên thân và cành cây thân gỗ chứa nhiều m n, có quan hệ cộng sinh với nấm. Thân dài 25 – 40 cm, đƣờng k nh 0,5 - 0,7 cm, thòng xuống, gióng dài 2,5 - 2,7 cm. Lá trông giống nhƣ da, mép lá nhẵn, hình mác, xếp hai dãy, dài 8 – 10 cm, rộng 1,2 -1,8 cm, ở đầu 2 th y lệch. Cụm hoa chứa 1-3 hoa d ng bên, m c gần các đốt ở phần trên của thân không còn lá, hoa lộn ngƣợc. Tái sinh bằng h t và chồi [12]. Lá bắc nhỏ, hình mác, dài 0,5 cm, đầu t . Hoa nở vào m a xuân, đƣờng k nh 3–7 cm, cánh hoa và lá đài màu trắng với chóp màu t m nh t. Các lá đài gần đều, hình mác, dài 2,3-2,5 cm, rộng 0,6-0,8 cm, đầu hơi nh n. Lá đài ở lƣng tự do, các lá đài bên hơi chếch t i đế. Cằm dài 0,5 cm, có đầu t . Cánh hoa gần giống nhƣ lá đài ở lƣng, hình mác, dài 2,4-2,5 cm, rộng 1-1,2 cm, đầu t [6]. Cánh môi gần tròn, dài 2,5-2,7 cm, rộng 2,1-2,3 cm, gốc hơi thót và có các v ch chéo màu t m ở chóp, ở giữa có một đốm màu vàng. Trụ màu trắng, cao 0,30,4 cm. Nắp hình mũ cao, màu trắng, bề mặt phủ nh m n. Bầu dài 2,8-3,5 cm. Quả nang hình trứng thuôn dài [6]. Phân bố chủ yếu trong các rừng cây lá sớm rụng và khô cũng nhƣ các rừng thƣờng xanh mƣa ẩm v ng đất thấp hay miền n i t i Hải Nam (Trung Quốc), Assam (Ấn Độ), Lào, Thái Lan, Việt Nam và Myanma t i cao độ trong khoảng 0 tới 1.600 m. T i Việt Nam, lan Ý thảo sống trong tự nhiên có t i các t nh Quảng Tr (huyện Hƣớng Hóa: Lao Bảo), Kon Tum (huyện Đắk Tô: rừng cấm Đắk Uy), Gia Lai (huyện Chƣ Păh: Gia Lu), Lâm Đồng (Đà L t, Bảo Lộc) [6]. Lan Ý thảo phát triển trong môi trƣờng có kh hậu từ mát tới nóng với lƣợng ánh sáng trung bình. Cần duy trì cho cây ẩm ƣớt và bón phân trong m a sinh trƣởng. Trong m a đông nên giảm tƣới nƣớc cho tới khi các chồi mới xuất hiện. Trồng trong hỗn hợp của rêu nƣớc (Sphagnum spp.) khô hay môi trƣờng là vỏ linh sam (Abies spp.) có khả năng thoát nƣớc tốt [6]. 6 1. . Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Giới thiệu chung Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, rễ, củ hoặc đ nh sinh trƣởng. Hiện nay các nhà khoa h c sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan tới thực vật nhƣ sinh l h c, sinh hóa h c, di truyền h c và cấu trúc thực vật. Đồng thời mở rộng tiềm năng nhân giống vô t nh đối với những loài cây trồng quan tr ng, có giá tr về mặt kinh tế và thƣơng m i trong đời sống hàng ngày của con ngƣời [11]. 1.2.2. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhƣng không thành công [16]. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác đ nh đƣợc vai trò của IAA, hormon thực vật thuộc nhóm Auxin có khả năng k ch th ch sự tăng trƣởng và phân chia tế bào thực vật [16]. Năm 1939, ba nhà khoa h c Gautheret, Nobecourt và White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) ở trên các đối tƣợng cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trƣởng liên tục [16]. Năm 1960 – 1964, từ những nghiên cứu của mình, Morel đƣa ra kết luận có thể nhân giống vô t nh đ a lan bằng nuôi cấy đ nh sinh trƣởng. Từ đó, lan là cây nuôi cấy mô đầu tiên đƣợc đem vào nhân giống với quy mô công nghiệp [16]. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong t o đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt [16]. Năm 1971, Takebe và cộng sự đã thành công trong tái sinh đƣợc cây từ tế bào trần mô th t lá ở thuốc lá [16]. Năm 1978, Melcher và cộng sự thực hiện thí nghiệm trên cà chua và thuốc lá và t o đƣợc cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng kĩ thuật dung hợp tế bào trần [16]. 7 Từ năm 1980 đến nay, ngƣời ta chuyển gen vào tế bào thông qua việc nuôi cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium đƣợc triển khai rộng rãi, sau đó đƣa vào môi trƣờng nuôi [16]. Tháng 6 năm 2006, S. Aktar & cộng sự t i Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh h c USDA, Sở Công nghệ sinh h c, Đ i h c Nông nghiệp Bangladesh, Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong môi trƣờng có chứa nồng độ khác nhau của IBA (0, 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0 mg/l) và 1% than ho t tính. Kết quả ra rễ tốt nhất thu đƣợc từ môi trƣờng chứa 1,0 mg/l IBA [17]. 1.2.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa h c là t nh toàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa. 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào T nh toàn năng của tế bào: Theo quan niệm sinh h c hiện đ i thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền tƣơng đƣơng với lƣợng thông tin di truyền của cơ thể hoàn ch nh. Khi gặp điều kiện môi trƣờng thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn ch nh thông qua quá trình phân hóa và phản phân hóa [11]. 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Mỗi cơ thể là một ch nh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan thực hiện chức năng khác nhau, mỗi cơ quan do nhiều tế bào cùng thực hiện một chức năng t o nên. Tuy nhiên, các lo i tế bào đó đều có nguồn gốc một từ tế bào đầu tiên là hợp tử. Hợp tử phân chia tiếp tục t o thành nhiều tế bào phôi sinh chƣa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) . Sau đó từ các tế bào phôi sinh này đƣợc biệt hóa thực hiện các chức năng khác nhau t o nên các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu th : Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, các tế bào đã chuyên hóa cũng có khả năng phân hóa khi gặp điều kiện thuận lợi, trong trƣờng hợp cần thiết các tế bào này l i quay trở về d ng phôi sinh và phân chia liên tiếp. Đó g i là quá trình phản phân hóa tế bào. 8 Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có đ nh hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở t nh toàn năng của tế bào thực vật [11]. 1.2.3.3. Sự trẻ hóa Trong nuôi cấy in vitro, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Vì vậy để ch n mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào tr ng thái sinh lý hay tuổi mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng m nh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn. Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan tr ng nhất trong nhân giống sinh dƣỡng [11]. 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro Bước 1: Ch n l c và chuẩn b mẫu cấy: Mẫu cấy là các cây s ch bệnh, khỏe m nh. Cần lƣu đến độ tuổi sinh lý của cơ quan d ng làm mẫu, vụ mùa lấy mẫu, k ch thƣớc và v trí lấy mẫu. Bước 2: T o vật liệu khởi đầu: Là giai đo n khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đo n này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn t i và sinh trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần ch n đ ng mô, đ ng giai đo n phát triển của cây, quan tr ng nhất là đ nh chồi ng n, đ nh chồi nách sau đó đến đ nh chồi hoa và cuối c ng là đo n thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh là giai đo n kích thích mô nuôi cấy pháp sinh hình thái và tăng nhanh số lƣợng. Điều kiện nuôi cấy thích hợp gi p cho quá trình tăng sinh 9 diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở tr ng thái trẻ hóa và đƣợc duy trì trong thời gian dài. Bước 4: T o cây in vitro hoàn ch nh là giai đo n t o cây con hoàn ch nh có đầy đủ thân, lá và rễ. Các chất có tác dụng t o chồi đƣợc lo i bỏ. Để t o rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi trƣờng t o rễ. Môi trƣờng t o rễ bổ sung lƣợng nhỏ auxin giúp kích thích sự ra rễ nhanh. Bước 5: Chuyển cây con ra ngoài vƣờn ƣơm: Cây con ra rễ đƣợc lấy ra ngoài ống nghiệm, cây đƣợc đặt trong chậu nơi có độ ẩm cao, cƣờng độ chiếu sáng thấp… Sau khoảng 2 tuần, cây thích nghi với điều kiện bên ngoài và đƣợc đem đi trồng. Đây là giai đo n quan tr ng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con dễ b chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể s ch, tơi xốp, thoát nƣớc. Phải chủ động điều ch nh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờm ƣơm, cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [11]. 1.2.5. Môi trường nuôi cấy 1.2.5.1. Thành phần của môi trường Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, lo i tế bào, mô và cơ quan đƣợc nuôi cấy. Mặc dù có sự đa d ng về thành phần và nồng độ các chất, nhƣng tất cả các lo i môi trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:  Thành phần hữu cơ - Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor của các phản ứng sinh hóa. + Thiamin cần cho trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp một số aminoaxit, hàm lƣợng sử dụng 0,1 – 5 mg/l. + Axít nicotinic tham gia t o coenzyme của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1 – 5 mg/l. + Pyridoxin là một coenzyme quan tr ng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử dụng 0,1 – 1 mg/l. - Myo – inositol: tham gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi hydratcacbon. - Các aminoaxit amit: có vai trò quan tr ng trong việc phát sinh hình thái. - Các thành phần hữu cơ phức t p: Cazein thủy phân, d ch chiết nấm men, nƣớc ép hoa quả… cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất [16]. 10  Thành phần vô cơ Gồm các muối khoáng, các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho, kali và sắt. - Nitơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở 2 d ng: nitrat và amôn với hàm lƣợng nitrat là 25mM. - Phospho đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở d ng muối phosphate và 2 lo i muỗi đƣợc sử dụng nhiều nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. - Kali đƣợc cung cấp dƣới d ng KNO3, KCl và KH2PO4. Hàm lƣợng kali trong môi trƣờng nuôi cấy thay đổi từ 2 – 25mM. - Sắt là nguyên tố vi lƣợng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở d ng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3... nhƣng cây rất khó hấp thụ, phải cho vào môi trƣờng Na2EDTA để t o ra muối phức NaFeEDTA để cây dễ dàng hấp thụ [16].  Nguồn cacbon Lo i hydratcacbon đƣợc sử dụng để đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy phổ biến là đƣờng saccarozơ với hàm lƣợng 6% (W/v). Những lo i đƣờng khác nhƣ: fructozơ, glucozơ, maltozơ, lactozơ,... ch dùng trong những trƣờng hợp cá biệt. Hàm lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần, ngƣợc l i các hàm lƣợng đƣờng cao hơn có thể dùng cho nuôi cấy h t phấn, phôi [16].  Chất điều hòa sinh trưởng Các chất điều hòa sinh trƣởng là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng nuôi cấy, có vai trò quan tr ng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hòa sinh trƣởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, ho t tính vốn có của chất điều hòa sinh trƣởng, mẫu nuôi cấy [9]. Các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật đƣợc chia thành các nhóm ch nh sau đây: Auxin, Cytokinin, Gibberellin,.. - Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm th c đẩy sự sinh trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính ... (Epstein&cs, 1989) . Các lo i Auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy: + IAA (Indole acetic acid) + IBA (Indole butyric acid) + NOA (Naphthoxy acetic acid) + α- NAA (α- Naphthaleneacetic acid) 11 + 2,4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid) ... IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lƣợng cao 1,0-3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm lƣợng sử dụng từ 0,1-2,0 mg/l. - Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự t o rễ và sinh trƣởng của mô sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng t nh rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Các lo i Cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô là: + Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine). + Kinetin (6-furfurylamino purine). + BAP (Bezylamino purine). + TDZ (Thidiazuzon). + 2-ip (isopentenyi adenine). Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng thời ức chế m nh sự t o rễ của chồi nuôi cấy. Trong các lo i Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai lo i đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả. Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau [16]. - Nhóm Gibberellin: Ngoài hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô ngƣời ta còn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó làm tăng k ch thƣớc của chồi nuôi cấy... GA3 là lo i Gibberellin đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải l c qua màng l c vô trùng rồi mới đƣa vào môi trƣờng [16].  Các thành phần khác - Tác nhân t o gel: quyết đ nh tr ng thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy. Chất t o gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar; Hàm lƣợng sử dụng của agar 0,5 – 10% (W/v) . - Than ho t t nh: đƣợc dụng để hấp thụ các chất màu các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp [16]. 1.2.5.2. pH của môi trường pH của đa số các lo i môi trƣờng nuôi cấy đều đƣợc điều ch nh trong ph m vi 5,5 – 6. pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang tr ng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 12 agar có thể rất cứng. Nếu trong môi trƣờng có GA3 thì phải điều ch nh giá tr pH trong ph m vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang d ng không có ho t tính. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trƣờng có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ [16]. 1.2.5.3.. Tính thẩm thấu của môi trường: Hấp thụ nƣớc của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy b chi phối bởi thế năng của nƣớc trong d ch bào và trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Các thành phần chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong môi trƣờng bao gồm: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khoáng. Đƣờng vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn tham gia vào điều ch nh khả năng thẩm thấu của môi trƣờng. Hàm lƣợng đƣờng cao, mô nuôi cấy khó h t đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tƣợng thuỷ tinh hoá ở mẫu nuôi cấy, đây là trở ng i chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm hoặc đồng ruộng [16]. 1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - Về mặt lý luận sinh h c: Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho biết mối tƣơng quan giữa các bộ phận trong cây. Tách và nuôi cấy mô phân sinh từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa g i là mô sẹo, từ mô sẹo có thể k ch th ch để tái sinh cây hoàn ch nh. Phƣơng pháp nuôi cấy mô có thể biết đƣợc từng giai đo n và chu kỳ phát triển của từng cá thể. T o thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trƣởng, phát triển cùng mối quan hệ giữ chúng với bên ngoài. Từ đó tìm ra quy luật thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo ý muốn [9]. - Về mặt thực tiễn: Với phƣơng pháp nhân giống này, đảm bảo t o ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn đ nh về mặt di truyền), cây con không b nhiễm bệnh và t o đƣợc một số lƣợng cây con trong thời gian ngắn Phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc sử d ng để bảo quản, nhân nhanh các giống cây quý, có giá tr kinh tế. Hiện nay, phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong công tác giống cây trồng. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, ch sau một thời gian ngắn có thể t o đƣợc một sinh khối lớn có ho t chất: sinh khối đƣợc t o ra vẫn giữ nguyên