Tài liệu Bài giảng thực hành công nghệ enzyme

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CNSH- KTMT BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÀI GIẢNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME Hệ đại học TP. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014 Lưu hành nội bộ MỤC LỤC BÀI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3 1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC ...................................................................................................... 3 2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG .................................................................................................... 3 3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM.................................................................. 4 4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME ................. 8 BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME ........................................................... 11 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE ....................................................... 11 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 11 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 11 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 12 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 14 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 14 BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE ................................................. 15 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 15 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 15 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 17 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 21 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 21 BÀI 3. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN ........................................................... 22 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON ....................................................................................... 22 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 22 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 22 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 23 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 26 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 26 BÀI 4. NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE .................................................... 27 ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE .................................................................................. 27 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 27 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - H A CHẤT- MẪU VẬT............................................................ 27 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 28 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 30 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 30 BÀI 5. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE TÁCH TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ......................................................................................... 31 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 31 Bộ môn Công nghệ sinh học 1 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 31 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 32 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 35 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 35 BÀI 6. SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO ................................... 36 1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 36 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 36 3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 37 4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 41 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 42 TÀI LIỆU MÔN HỌC .......................................................................................................... 43 PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH .................................................................. 44 Bộ môn Công nghệ sinh học 2 BÀI MỞ ĐẦU 1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC Sau khi học xong môn học sinh viên có khả năng: - Chứng minh, củng cố lý thuyết, áp dụng kiến thức vào thực tế. - Có kỹ năng thao tác, sử dụng các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm. - Thực hiện nghiêm túc nội quy phòng thí nghiệm. - Hoàn thành bài thực hành theo thời gian quy định. 2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG 1. Sinh viên đọc và tóm tắt bài trước khi đến lớp. Tự soạn bài để tham khảo trong lúc làm thí nghiệm. Không được đem bài giảng vào (PTN. 2. Có phiếu điểm danh theo buổi quên, không mang bị trừ điểm và phải viết đơn để giáo viên xác nhận có đi buổi học đó. 3. Nghỉ phải có đơn xin phép GV dạy và xác nhận của GV dạy học bù. Phải viết bài báo cáo riêng buổi bù nộp cho GV mà sinh viên đó đăng ký môn học. 4. Viết báo cáo theo tổ, nộp file word cho nhóm trưởng. GV nhận được bài báo cáo sau 1 tuần của buổi học từ nhóm trưởng qua mail trước 0h của buổi kế tiếp. 5. Kết thúc môn học 1 tuần các nhóm gộp 6 bài lại thành 1 file gửi lại cho giáo viên. Sau đó in toàn bộ bài trên giấy A4 nộp lại. (SV có thể cập nhật lại bài nếu phát hiện ra lỗi so với bài đã gửi cho GV) 6. Địa chỉ mail: [email protected], [email protected], [email protected]. 7. SV phải xem kỹ bài thực hành trước khi vào PTN. Đầu buổi có kiểm tra bài trắc nghiệm, điền khuyết, câu hỏi nhỏ....(Lớp bỏ quỹ trả tiền photo đề trong các buổi kiểm tra). Nếu kiểm tra đầu giờ không đạt sẽ phải ra về ngay. Sau đó xin giấy vào lớp của phòng Công tác học sinh – Sinh viên với lý do không chuẩn bị bài. Rồi bố trí đi bù buổi thực hành khác. Phải có đơn đồng ý của GV dạy chính và GV dạy bù. 8. SV phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí nghiệm cho bài thực tập của mình. 9. SV phải có mặt ở phòng thí nghiệm (PTN) đúng giờ qui định: Sáng 7h, chiều 12h30 và phải có mặt tại PTN suốt thời gian thực hành. Đến trễ 10 phút không được vào lớp. Mặc áo blouse khi vào phòng thí nghiệm. 10. Mỗi nhóm cử một đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, bể) báo cáo ngay cho GVHD. SV phải rửa dụng cụ sạch sẽ trước và sau khi thí nghiệm. Kết thúc buổi thực tập mỗi nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ nhóm làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát, hư hỏng phải báo ngay GVHD và mua đền vào buổi học tuần kế tiếp. Bộ môn Công nghệ sinh học 3 11. Mỗi buổi thực hành, các nhóm làm theo phân công trong bảng. Nhóm trực nhật có nhiệm vụ: dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước và cửa trước khi ra về. Không hoàn thành nhiệm vụ kết quả bài thực hành đó đạt điểm 0 Công việc Buổi 1 Buổi 2 Buổi 3 Buổi 4 Buổi 4 Buổi 6 Dụng cụ 1 5 9 3 7 1,2 Hóa chất 2 6 10 4 8 3,4 Thiết bị 3 7 1 5 9 5,6 Vệ sinh 4 8 2 6 10 7,8,9,10 12. Nhóm sinh viên làm phúc trình theo yêu cầu của từng bài, nộp cho giáo viên vào buổi thực hành kế tiếp. Kết thúc môn có thi kiểm tra theo yêu cầu giáo viên. 13. Tiêu chuẩn đánh giá bài tập – thí nghiệm thực hành - Điểm môn học là điểm trung bình cộng của 6 bài - Nhóm trưởng sẽ được cộng 0,3 điểm thưởng/ điểm tổng kết môn học. STT 1 Tiêu chí đánh giá Nội dung Điểm tối đa Nguyên tắc 0.5 điểm Tiến trình thí nghiệm 2 điểm Giải thích thí nghiệm 2 điểm Kết quả 1 điểm Kết luận - Kiến nghị 0.5 điểm Trả lời câu hỏi cuối bài 1 điểm 2 An toàn, tổ chức 1 điểm 3 Thời gian 1 điểm 4 Kỹ năng thao tác 1 điểm 3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM Enzyme là một phân tử sinh học rất nhạy với sự thay đổi pH của môi trường, nên vấn đề pha và sử dụng dung dịch đệm trong chiết tách Enzyme là rất quan trọng. Vì giới hạn chương trình, nên chỉ trình bày cách pha và sử dụng những dung dịch đệm cần thiết. 3.1 Định nghĩa pH Giá trị của pH của một dung dịch được tính theo công thức: pH = - log aH+ Trong đó: - a H+ biểu thị hoạt động của ion có trong dung dịch và được tính theo biểu thức: aH = f. CH+ - Với: Bộ môn Công nghệ sinh học 4  CH+ là nồng độ H + trong dung dịch được tính theo đơn vị ion gam /l.  f là hoạt độ H+, f ≥ 1. Khi nồng độ H+ trong dung dịch tăng thì f giảm và ngược lại khi nồng độ của H+ rất nhỏ (dung dịch loãng) thì f = 1, lúc đó ta sẽ có: CH+ = aH+ Vì thế, trong các dung dịch loãng có thể tính pH gần đúng theo công thức: pH = -log CH+ Sự phát triển, diễn tiến của nhiều quá trình hóa học, sinh học, sinh hóa…. đòi hỏi phải ở những giá trị pH nhất định không đổi hoặc có thay đổi chỉ là trong mức độ rất nhỏ không đáng kể. Vì thế cần phải có các dung dịch đệm cho pH. 3.2. Định nghĩa dung dịch đệm Dung dịch đệm pH là dung dịch chứa các chất có tác dụng giữ giá trị pH trong giới hạn nhất định khi thêm acid mạnh hay kiềm mạnh vào dung dịch đó. Các dung dịch có tính chất này thường là dung dịch hỗn hợp của một cặp acid và base liên hợp, ví dụ: CH3COOH và CH3COONa, NH4+ và NH3, H2PO4- và HPO42-…. Nhưng phổ biến là các dung dịch hỗn hợp của acid yếu và base liên hợp với nó hay ngược lại. Vì thế tác dụng đệm chỉ có hiệu lực lớn hơn trong một phạm vi nhất định tùy thuộc vào bản chất của từng acid yếu và vùng đệm hiệu lực. Tính theo công thức: pH = pKa  1. Trong đó: pKa = - logKa với Ka là hằng số phân ly H+ của acid trong nước. Vì thế mỗi một hỗn hợp đệm chỉ có tác dụng trên từng thang đo pH. Do đó muốn đệm cho vùng pH rộng phải có dung dịch đệm của hỗn hợp nhiều hệ acid và base liên hợp. Ví dụ, dung dịch đệm gồm CH3COOH và CH3COONa có tác dụng tốt trong khoảng pH = 3,7  5,7. Trong khi đó dung dịch đệm gồm NH4+ và NH3 lại có tác dụng đệm tốt trong vùng pH = 8  11. Với hỗn hợp đệm gồm acid H3PO4 và muối của nó thường có tác dụng đệm tốt trong hai vùng pH, tương ứng với hai hằng số phân ly acid Ka1 và Ka2 vùng I có pH = 1  3,6 và vùng II pH = 6  8,3. 3.3. Hiệu ứng pha loãng dung dịch đệm Theo công thức pH của dung dịch đệm : pH = pKa – log (Ca/Cb) Ca: là nồng độ acid Cb: là nồng độ của base liên hợp Khi pha loãng, số lần pha loãng nồng độ Ca và Cb là như nhau nên tỷ số Ca/Cb không thay đổi, nhưng hằng số điện ly ra H+ của acid và hoạt độ của các ion trong dung dịch thay đổi. Vì thế khi pha loãng sẽ làm thay đổi một ít pH của dung dịch đệm. Bộ môn Công nghệ sinh học 5 Sự thay đổi pH này được gọi là hiệu ứng pha loãng của dung dịch đệm. Hiệu ứng này rất khác nhau đối với mỗi loại dung dịch đệm. Đặc trưng cho hiệu ứng này là  pH1/2.  pH1/2 là giá trị pH thay đổi của dung dịch đệm khi pha loãng gấp đôi bằng nước cất. Nếu khi pha loãng pH của dung dịch tăng, ta có hiệu ứng dương. Còn nếu pH giảm ta có hiệu ứng âm. Ví dụ khi pha loãng dung dịch đệm ta có  pH1/2 = -0.05, tức là pH của dung dịch đệm này đã giảm 0.05 đơn vị pH khi pha loãng gấp đôi nó. 3.4. Cách pha chế các dung dịch đệm Các hoá chất khi sử dụng cho pha dung dịch đệm đòi hỏi phải tinh khiết. Nước cất dùng để pha chế phải đun sôi, đuổi hết khí CO2 trước khi dùng, đồng thời phải đậy kín tránh khí CO2 từ không khí hòa tan vào khi để nguội. Nồng độ đặc trưng của các dung dịch đệm phải chính xác, nên hạn chế việc sử dụng các dung dịch quá loãng hoặc quá đậm so với nồng độ đặc trưng vì sẽ gây sai số. Các dung dịch đệm sau pha tốt nhất nên được sử dụng trong vòng một tháng. Có nhiều dung dịch đệm được pha với nhiều hóa chất khác nhau, tuy nhiên trong chiết tách Enzyme, những dung dịch đệm sau đây thường được dùng: 3.4.1. Hỗn hợp đệm KCl và HCl Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch KCl 0,2 M (14.9 g/l) và dung dịch HCl 0,2 M (18 ml HCl đặc 36%). Hỗn hợp đệm này chứa 25 ml dd KCl 0,2 M và x ml HCl 0,2 M theo bảng sau: pH ở 25oC X ml HCl 0.2 M  pH1/2 1,00 67,00 +0,04 1,10 1,20 1,30 52,80 42,50 33,60 1,40 1,50 1,60 1,70 1,80 1,90 2,00 2,10 2,20 26,60 20,70 16,20 13,00 10,20 8,10 6,50 5,10 3,90 +0,13 +0,27 3.4.2. Hỗn hợp đệm K2HPO4 – HCl Bộ môn Công nghệ sinh học 6 Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l)và dung dịch HCl 0,1 M (9 ml HCl đặc 36%). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K2HPO4 0,1 M và X ml HCl 0,1 M theo bảng sau: pH ở 25oC X ml HCl 0.1 M  pH1/2 2,20 2,30 49,50 45,80 +0,14 2,40 2,50 42,20 38,80 2,60 2,70 35,40 32,10 2,80 2,90 3,00 28,90 25,70 22,30 3,10 3,20 3,30 3,40 3,50 18,80 15,70 12,90 10,40 8,20 3,60 3,70 3,80 3,90 4,00 6,30 4,50 2,90 1,40 1,10 +0,08 +0,09 +0,04 3.4.3. Hỗn hợp đệm K2HPO4- NaOH Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l) và dung dịch NaOH 0,1M (4 gam NaOH/lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K2HPO4 0,1 M và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau: pH ở 25oC X ml NaOH 0,1 M  pH1/2 4.10 4.20 4.30 1.30 3.00 4.70 + 0.05 4.40 4.50 4.60 6.60 8.70 11.10 Bộ môn Công nghệ sinh học 7 4.70 13.60 4.80 4.90 5.00 5.10 16.50 19.40 22.60 25.50 5.20 5.30 28.80 31.60 5.40 5.50 34.10 36.60 5.60 5.70 38.80 40.60 5.80 5.90 42.30 43.70 + 0.06 + 0.06 + 0.14 3.4.4. Hỗn hợp đệm KH2PO4 – NaOH Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch KH2PO4 0,1 M (12,61 g/l) và dung dịch NaOH 0,1 M (4.00 g/ lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd KH2PO4 0,1 M và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau: pH ở 25oC X ml NaOH 0.1 M 5,80 5,90 6,00 6,10 6,20 3,60 4,60 5,60 6,80 8,10 6,30 6,40 6,50 6,60 6,70 6,80 6,90 9,70 11,60 13,90 16,40 19,30 22,40 25,90  pH1/2 pH ở 25oC X ml NaOH 0.1 M +0,07 7,00 7,10 7,20 7,30 7,40 29,10 32,10 34,70 37,00 39,10 7,50 7,60 7,70 7,80 7,90 8,00 40,90 42,40 43,50 44,50 45,30 46,10 +0,05  pH1/2 +0,08 +0,06 4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME Tùy theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làm sạch cho thích hợp. Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dù trình tự và các thủ thuật ở các bước có thể thay đổi, song vẫn có những nguyên tắc chung. Bộ môn Công nghệ sinh học 8  Phá vỡ tế bào Enzyme có trong tế bào chất của sinh vật và các cấu tử (nhân, lạp thể, ty thể, lysosome...) của tế bào. Nhưng các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.  Tác nhân cơ học Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Để việc phá vỡ có hiệu quả ở mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.  Tác nhân vật lý, hóa học Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate..) và chất detergent (chất tẩy). Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.  Chiết Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút: - Nhiệt độ: Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (30C ÷ 50C). Các thao tác phải nhanh. - Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. Khử màu: Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật, có trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt độ enzyme. Trong trường hợp này người ta còn cho thêm vào chất khử để loại màu. Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu. Người ta thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và enzyme không bị giữ. Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH. Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử - khác nhau như polysaccharid, nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.  Kết tủa Bộ môn Công nghệ sinh học 9 Cồn nồng độ cao (960 – 980 ) với tỉ lệ về thể tích 1 E : 3 cồn hay 1 E : 4 cồn. Các dung môi như isopropanol, aceton với tỉ lệ dung dịch Enzyme : dung môi là 1:1,5 hay 1: 2. Chú ý khi tủa E bằng các dung môi trên tốt nhất là nên ở nhiệt độ thấp từ 30C ÷ 50C, khuấy đều khi cho dung môi từ từ vào. Các dung dịch muối trung tính như NaCl, (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4…là tác nhân tủa tích cực. Thông thường hay dùng dung dịch (NH4)2SO4 vì độ hòa tan muối này cao (chiếm từ 50 – 60 % so với dịch enzyme) không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme. Với pepsin người ta hay dùng NaCl (20 – 25%) vì muối này rẻ, dễ tìm, không ảnh hưởng đến hoạt tính của E….  Tinh sạch Sau khi kết tủa E, ly tâm, phần E tủa lúc này còn chứa nhiều tạp chất như protein, muối, các chất có trọng lượng phân tử thấp khác, chất màu…. Nên ta cần tiến hành tinh sạch theo các biện pháp sau: - Tách chất có trọng lượng phân tử thấp (như muối..) bằng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm. - Tách một phần các chất tạp bằng nồng độ rượu thấp (40 – 45%) khi đó E chủ yếu nằm trong dung dịch. - Có thể hòa tan E bằng lượng nước tối thiểu, lọc bỏ chất không tan, rồi kết tủa lại bằng rượu cao độ. - Hiện nay việc chiết tách, tinh sạch E đã được tiến hành với hiệu suất tương đối cao bằng các kỹ thuật hiện đại như lọc gel, hấp phụ chọn lọc, sắc ký trao đổi ion…. Bộ môn Công nghệ sinh học 10 BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE 1. MỤC ĐÍCH - Xây dựng phương trình động học Michaelis-Menten. - Xác định thông số động học Vm, Kmax. 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT Dụng cụ, hóa chất, thiết bị sử dụng cho bài thực hành được kê theo bảng 1.1. ảng 1.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành (cho nhóm g m sinh viên A. HÓA CHẤT: STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT Lít 1 1 Nước cất 2 lần 2 Casein g 3 3 Enzyme Savinase ml 200 4 Folin ml 50 5 Tyrosine g 1 6 Giấy lọc Hộp 1 7 ml 200 8 Đệm photphat pH =8 Dung dịch casein 12mM/ đệm photphat pH = 8 ml 200 9 TCA 5% ml 500 10 NaOH 0,5N ml 500 11 HCl 0,2N 12 ml 500 0 ml 600 TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT Cồn 70 GHI CHÚ PTN, cả lớp B. DỤNG CỤ: STT 1 Ống nghiệm Ф 18 cái 18 2 Pipet 10 cái 1 3 Pipet 1 cái 1 4 Pipet 5 cái 1 5 Quả bóp cái 1 6 Bình tia cái 1 7 Đũa thủy tinh cái 1 8 Cốc 100 cái 1 9 Cốc 250 cái 1 Bộ môn Công nghệ sinh học GHI CHÚ 1 tổ 11 10 Phễu Ф 60 cái 3 11 Bình định mức 250 Cái 1 QUY CÁCH SL/ĐVT C.THIẾT BỊ: STT TÊN THIẾT BỊ 1 Máy đo quang phổ Cái 2 2 Cân 2 số Cái 2 3 Máy ổn nhiệt Cái 1 4 Máy khuấy từ Cái 1 5 Máy Votex Cái 2 GHI CHÚ Cả lớp Tổ 1: Pha dung dịch casein 12 mM: Cân 2g casein vào cốc pha, thêm vào khoảng 20-30 ml dung dịch NaOH 0,5N, đặt lên máy khuấy từ ở 50-600C khuấy cho casein tan hết, vẫn để dung dịch trên máy khuấy từ, tiếp tục khuấy nhưng không gia nhiệt nữa; dùng HCl có nồng độ tương ứng nhỏ vào từ từ đến khi pH đạt từ 7,5-8 (nhớ nhỏ HCl vào từ từ để tránh casein bị tủa và pH tăng quá nhanh), dùng đệm phosphate pH = 8 định mức đến 200 ml. Tổ 2: Pha dung dịch đệm phosphate: - Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 23,9 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ 1000 ml. - Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 9,07 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 1000 ml. Trộn 969 ml Na2HPO4 1/15M với 31 ml KH2PO4 1/15M thu được 1000 ml dung dịch đệm phosphate pH = 8 Tổ 3: Pha dung dịch chuẩn Tyrosine (1mM): 181,19 mg Tyrosine hòa tan trong HCl 0,2N đủ 1 lít. Tổ 4: Pha dung dịch savinase 2%: Hút 8 ml enzyme Savinase thương mại hòa tan trong 392 ml nước cất. 3. NỘI DUNG Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis Km. Tốc độ của phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Do đó chúng tôi khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thuỷ phân casein của savinase bằng cách thay đổi nồng độ casein từ 2.4 – 12 mM để tìm khoảng nồng độ casein mà trong đó enzym chưa bị bão hoà bởi cơ chất. Bộ môn Công nghệ sinh học 12 Xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thuỷ phân của enzym và nồng độ cơ chất theo phương trình Lineweaver – Burk 1 1 K 1   M. v v max v max S Enzyme Savinase được sản xuất bởi quá trình lên men của các vi sinh vật biến đổi gen (Bacillus amyloliquefaciens). Sau khi kết thúc quá trình lên men, savinase được tách chiết và tinh sạch từ các sản phẩm lên men. Enzyme này được ứng dụng trong việc sản xuất bột giặt, nước rửa chén vì chúng giúp tẩy sạch các vết bẩn trên quần áo có nguồn gốc từ thức ăn: trứng, thịt...hoặc vết máu, bùn...Savinase có tác dụng thủy phân protein thành các peptide ngắn, tan trong nước. Enzyme Savinase hoạt động trong môi trường kiềm cao, pH dao động từ 8 – 12 (tối ưu pH = 10), nhiệt độ hoạt động của nó từ 20-600C (tối ưu ở 550C), được bảo quản ở nhiệt độ từ 3 – 50C. 3.1. Lập đƣờng chuẩn Tyrosine Nhóm cử 1 tổ chẵn, 1 tổ lẻ làm đường chuẩn Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dd tyrosine chuẩn (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Tyrosine tương ứng (µmol) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 HCl 0.2N (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 ? ? ? NaOH 0.5N 10 Folin pha loãng 3 lần 1 Lắc mạnh, để yên trong 10 phút Đo OD (Abs) tại λ =660 nm 0 ? ? Dựng đường chuẩn tyrosine biểu diễn sự tương quan giữa lượng tyrosine và OD. Ống 0 là ống mẫu, các ống khác là ống thí nghiệm. 3.2. Xác định thông số động học của enzyme savinase Tiến hành thí nghiệm Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Casein 12 mM (ml) 0 1 2 3 4 5 Đệm phosphate (ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ Casein (mM) 0 2.4 4.8 7.2 9.6 12 Savinase 2% (ml) 5 Để yên ở 50-550C trong 2 phút TCA 5% (ml) Bộ môn Công nghệ sinh học 5 Để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới 13 Ống nghiệm 0 1 2 3 Dịch lọc 5 NaOH 0.5N (ml) 10 Folin pha loãng 3 lần (ml) 1 4 5 ? ? Lắc mạnh, sau đó để yên trong 10 phút Đo OD (Abs) 0 tại λ =660 nm ? ? ? Dựa vào đồ thị chuẩn ta suy ra lượng Tyrosine tương ứng. Ống nghiệm 1 2 3 4 5 OD (y) Lượng tyrosine (x) Tính vận tốc phản ứng (V) ở các nồng độ cơ chất tương ứng: V = d(P)/dt = Lượng tyrosine/thời gian. Lập đồ thị thể hiện mối tương quan giữa 1/S và 1/V dựa vào bản sau: Ống nghiệm 1 2 3 4 Lƣợng casein (S) 1/S V 1/V 5 Sử dụng phần mềm Excel hoặc áp dụng phương pháp bình phương cực tiểu để xây dựng đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng. Tham khảo bài 10 trang 66 sách Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Trần Bích Lam NXB ĐHQG TP HCM 4. BÁO CÁO 1. Vẽ đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V dựa trên kết quả thực nghiệm. 2. Xác định thông số động học Km và Vmax. 5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ Theo yêu cầu chung môn học. Bộ môn Công nghệ sinh học 14 BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE 1. MỤC ĐÍCH Sau khi học xong bài sinh viên có khả năng: - Viết quy trình tách chiết, thu nhận dung dịch enzyme bromeline thô. Xác định hoạt tính enzyme bromeline. - Viết quy trình thu nhận enzyme bromeline ở dạng paste. 2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ảng 2.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành (cho nhóm g m sinh viên A. HÓA CHẤT TÊN HÓA CHẤT STT 1 SL/ĐVT gam 100 2 Cồn 90o lit 3 3 Thơm (dứa) xanh trái 5 4 Vải lọc m 1 5 DD NaOH 0.5 N ml 250 6 DD NaOH 1.0 N ml 100 7 DD HCl 0.2 N ml 300 8 DD HCl 2 N ml 100 9 Folin Ciocaltue ml 80 Acid tricloacetic TCA 10 (Cl3COOH) 5% ml 200 11 KH2PO4 1M ml 100 12 Hemoglobin gam 5,0 13 Tyrosine gam 3 14 Urê gam 80 Túi colodion hoặc 15 cellophane túi 10 Đệm phosphate có pH = 7, 16 nồng độ 0,01M lit 3 17 Nước cất 2 lần lit 3 Hộp 1 18 (NH4)2SO4 QUY CÁCH Giấy lọc GHI CHÚ PTN HS mua B. DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ Bộ môn Công nghệ sinh học QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 15 1 Ống đong 50ml Cái 1 2 Ống nghiệm phi 18 Cái 10 3 Giá ống nghiệm Cái 1 4 Pipep man 100 -1000µl Cái 1 5 Pipep 1ml Cái 1 6 Pipep 2ml Cái 1 7 Pipep 5ml Cái 1 8 Phễu thủy tinh Cái 1 9 Bình tia nước cất Cái 1 10 Dao inox Cái 1 11 Quả bóp Cái 1 12 Bình định mức 100 Cái 1 13 Cốc 100 cái 3 14 Bình tam giác nút mài 100 cái 1 15 Đũa thủy tinh cái 10 16 Cốc thủy tinh 500ml Cái 2 17 Cồn kế 50-100 Cái 1 18 Cốc thủy tinh 1000ml Cái 10 1 tổ cả lớp C.THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT 1 Máy đo quang phổ Cái 2 2 Cân 2 số Cái 1 3 Máy ly tâm 6000v/p Cái 1 4 Máy xay sinh tố Cái 1 5 Máy khấy từ Cái 2 GHI CHÚ cả lớp Chuẩn bị hóa chất:  Tổ 5: Pha dung dịch acid Trichloroacetic 5%: Cân 5 g pha với nước cất thành 100ml.  Tổ 6: Pha Dung dịch đệm KH2PO4 1M: Cân 13.6 g pha với nước cất thành 100ml.  Tổ 7: Pha dung dịch Tyrosine 1/400N mẫu: Cân 45 mg Tyrosine pha trong 100ml HCl 0.2N.  Tổ 8: Pha dung dịch Hemoglobin 2%: Cân 2g Hb + 36g Ure + 8 ml dung dịch NaOH 1N hòa trong 40 ml nước cất. Để ở 25oC trong 60 phút. Thêm 10 ml dung dịch Bộ môn Công nghệ sinh học 16 đệm KH2PO4 1M, điều chỉnh lại pH =6 với dung dịch HCl 2N. Thêm nước đầy tới vạch mức 100ml. Bảo quản trong tủ lạnh. 3. NỘI DUNG 3.1. Nguyên tắc Bromeline là một enzyme thuộc nhóm protease có nhiều trong trái thơm. Chúng ta tiến hành khảo sát bromeline qua khả năng thủy phân các cơ chất protein (Hemoglobin, Casein, Albumin….) tạo ra các sản phẩm tan trong dung dịch TCA là các peptide có chứa Tyrosine. Việc định lượng Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân của enzyme. 3.2. Chiết dịch thơm có chứa Enzyme Nguyên liệu: ngọn (đỉnh sinh trưởng), vỏ quả, thịt và lõi thơm. Tổ 3: Dứa gọt vỏ, bỏ lõi, cân khối lượng m (g), xay nhỏ bằng máy xay sinh tố  lọc qua vải màn 2 lớp 1 lần, qua bông 1 lần, bỏ cặn, thu dịch  ly tâm 4500 vòng /10 phút thu V ml dịch lọc thô có chứa bromeline. Chia về các tổ, mỗi tổ 50 ml thực hiện thí nghiệm: 10ml dành cho thử hoạt tính, 20ml dành cho tủa bằng Ethanol, 20ml dành cho tủa bằng muối (NH4)2SO4. Quy trình trích ly và thu nhận bromeline dạng thô Dứa Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Bã Ly tâm 4500 v/ 10ph Bã Dịch enzyme thô 3.3. Phƣơng pháp tủa bromeline a. Phƣơng pháp tủa bằng dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton) Bộ môn Công nghệ sinh học 17 Cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu). Tiến hành ở nhiệt độ thấp (≤ 50C), có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme. Khi kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy li tâm. Phương pháp này lợi thế là không cần loại muối, nhưng nhược điểm là hay có màu. Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. Quy trình kết tủa enzym Bromeline bằng cồn 80% Cồn 80%, 40C Dịch enzyme thô Tủa cồn 4oC / 1 giờ Ly tâm 4500 v/p 10 phút Thu tủa Bỏ dịch trong Sấy khô Bromeline Bộ môn Công nghệ sinh học 18 Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn). Phƣơng pháp tủa bằng muối: Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Quy trình thu nhận enzym Bromeline bằng muối (NH4)2SO4 Ammonium sulfate 70% bão hòa Dịch enzyme thô Để yên, ở nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 4500 v/p, trong 10 phút Thu tủa Bỏ dịch trong Thẩm tích Sấy khô Bromeline Lưu ý: Để có muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml nước thơm. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu. Phƣơng pháp thẩm tích Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào Bộ môn Công nghệ sinh học 19