Tài liệu Ảnh hưởng của cytokinin và auxin đến sự tạo chồi, rễ của loài lan ý thảo (dendrobium gratiosissimum)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ TIẾN ẢNH HƯỞNG CỦA CYTOKININ VÀ AUXIN ĐẾN SỰ TẠO CHỒI, RỄ CỦA LOÀI LAN Ý THẢO (Dendrobium gratiosissimum) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sư phạm Sinh học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ TIẾN ẢNH HƯỞNG CỦA CYTOKININ VÀ AUXIN ĐẾN SỰ TẠO CHỒI, RỄ CỦA LOÀI LAN Ý THẢO (Dendrobium gratiosissimum) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Sư phạm Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS. TS. CAO PHI BẰNG Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hướng dẫn PGS. TS. Cao Phi Bằng đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và động viên em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học trường Đại học Hùng Vương cùng các thầy cô giáo trong khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Hùng Vương đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, tháng 05 năm 2018 Sinh viên Phan Thị Tiến ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này thu được từ nghiên cứu mà tôi thực hiện, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận là trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép công bố. Phú Thọ, ngày 26 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực hiện Phan Thị Tiến iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................ii MỤC LỤC .....................................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................vi DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................. 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................... 2 NỘI DUNG .................................................................................................................... 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3 1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) và loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum)........................................................................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) ................................................... 3 1.1.1.1. Phân loại ............................................................................................................ 3 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum)............................................ 5 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật .................................. 6 1.2.1. Giới thiệu chung.................................................................................................. 6 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật..................................................................................................................................... 7 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ......................................... 9 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro............................................ 9 iv 1.2.5. Phytohormon trong nuôi cấy in vitro..............................................................10 1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ..............11 1.3. Tình hình nghiên cứu............................................................................................12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo ............................12 1.3.2. Nghiên cứu sử du ̣ng cytokinin và auxin trong nhân giống in vitro lan Hoàng thảo ................................................................................................................................14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..16 2.1. Đố i tượng và phạm vi nghiên cứu.....................................................................16 2.2. Nô ̣i dung nghiên cứu ..........................................................................................16 2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................16 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiê ̣m .........................................................................16 2.3.2. Phương pháp thu thâ ̣p số liê ̣u [11] ...................................................................20 2.3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liê ̣u [11] ...................................................21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................22 3.1. Ảnh hưởng của cytokinin đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo .......................22 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo...........................22 3.1.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo ......................26 3.2. Ảnh hưởng của auxin đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ...................................29 3.2.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ..................................29 3.2.2. Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ................................31 3.3. Ảnh hưởng của giá thể tới sự phát triển của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây .32 3.3.1. Hàm lượng sắc tố quang hợp ............................................................................32 3.3.2. Hoạt tính enzym catalase ..................................................................................34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................36 1. Kết luận .....................................................................................................................36 2. Kiến nghị...................................................................................................................36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................37 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC : Than hoạt tính BAP : Benzylamino purine ĐC : Đối chứng GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole acetic acid IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog NAA : Naphthalene acetic acid NOA : Naphthoxy acetic acid TDZ : Thidiazuzon vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến hệ số nhân, chiều cao và chất lượng chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo .........16 Bảng 2.2. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ của cây chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo ................................17 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân và sự phát triển chồi của cây lan Ý thảo ............................................................................................................................22 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo...........24 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Ý thảo......................................................................................................26 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Ý thảo ........28 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây Lan Ý thảo.................29 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo ................31 Bảng 3.7. Hàm lượng sắc tố quang hợp của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ..........33 Bảng 3.8. Hoạt độ catalase cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ....................................34 vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo ......23 Hình 3.2 Chồi cây in vitro trên môi trường có bổ sung BAP và trên môi trường đối chứng.......................................................................................................................23 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo ........24 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo .........25 Hình 3.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi của cây in vitro loài lan Ý thảo ................................................................................................................................26 Hình 3.6. Chồi cây in vitro trên các môi trường có bổ sung Kinetin và trên môi trường đối chứng ..........................................................................................................27 Hình 3.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến chiều cao của cây in vitro loài lan Ý thảo.27 Hình 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài............................28 lan Ý thảo ......................................................................................................................28 Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo...................30 Hình 3.10. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng tươi của cây lan Ý thảo ..............30 Hình 3.11. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo...............31 Hình 3.12. Ảnh hưởng của NAA đến khối lượng tươi của cây lan Ý thảo ............32 Hình 3.13. Hàm lượng sắc tố quang hợp của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ......33 Hình 3.14. Hoạt độ catalase cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây...................................35 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Phong lan gồm nhóm cây có hoa mang vẻ đẹp sang trọng, có giá trị kinh tế lại mang nhiều ý nghĩa nên được mọi người ưa chuộng. Từ trước tới nay, phong lan thường được dùng làm cảnh , trang trí. Bên cạnh đó, một số loài còn đươ ̣c sử du ̣ng làm dươ ̣c liêụ [16]. Họ Lan có số lượng loài rấ t lớn và đa dạng trong tự nhiên, và ngày càng phong phú do các loài lan được lai tạo. Hiện nay có khoảng hơn 25.000 loài Lan khác nhau. Ở Việt Nam, do yếu tố khi hậu phù hợp nên số lượng lan khá lớn, theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng [5]. Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan (Orchidaceae), chi này có khoảng 1400 loài, ở Việt Nam có 107 loài và một thứ phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển [19]. Trong chi này, có nhiều loài có hoa đẹp và được nhiều người yêu thích . Tuy nhiên do nhiều nguyên nhân tác động khác nhau mà hiện nay nhiều loài có số lượng suy giảm, bị đe dọa biến mất [7]. Lan Ý thảo (D. gratiosissimum) là một trong những loài lan thuộc nhóm Hoàng thảo (Dendrobium), hoa thường nở vào mùa xuân, khoảng từ tháng 3 đến tháng 5, cánh có màu trắng còn chóp có màu tím nhạt ở giữa có một đốm màu vàng, hoa rất đẹp nên được nhiều người yêu thích và ưa chuộng. Tuy nhiên hiện nay số lượng loài này trong tự nhiên còn khá ít và đặc biệt là khó nhân giống [18]. Ngày nay nuôi cấy in vitro đã được chứng minh mang lại hiệu quả cao trong việc nhân giống cũng như bảo tồn các loài lan quý hiếm [11]. Sử dụng phương pháp nhân giống in vitro ta có thể nhân hàng loạt với số lượng rất nhiều, trong khi đó thời gian lại tiết kiệm hơn so với các phương pháp truyền thống 2 (giâm cành, tách cành, gieo hạt,..), hơn nữa chúng lại có độ đồng đều và sạch bệnh. Trong nhân giống in vitro các chất điều hòa sinh trưởng, trong đó cytokinin và auxin, thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấ y, có vai trò đă ̣c biê ̣t quan tro ̣ng đố i với sự phát sinh chồ i, rễ. Chính vì vậy tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của cytokinin và auxin đến sự tạo chồi, rễ của loài lan Ý thảo (Dendrobium gratiosissimum).” Đề tài này được thực hiện sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cho loài lan có giá tri này. ̣ 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá được ảnh hưởng của cytokinin đến sự tạo chồi của loài lan Ý thảo. - Đánh giá được ảnh hưởng của auxin đến sự tạo rễ của loài lan Ý thảo. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ cây in vitro loài lan Ý thảo. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài được thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài lan có giá trị này. Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế trong sản xuất giống lan Ý thảo trên địa bàn tỉnh Phú Thọ 3 NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) và loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) 1.1.1. Giới thiệu về chi Hoàng thảo Dendrobium 1.1.1.1. Phân loại Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn thuộc Giới: Plantae, Bộ: Asparagales, Họ: Orchidaceae, Phân họ: Epidendroideae. Giống lan Dendrobium được đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium có nguồn gốc từ Hy Lạp. Hiện nay, chi này bao gồm hơn 1200 loài được chia thành 40 nhóm thuộc dòng Dendrobiinae. Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia, NewZealand, riêng ở Việt Nam có trên 110 loài phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển [5, 12]. Các đại diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, chúng thường mọc ở nơi ẩm, với độ cao 500 – 1500m so với mực nước biển, cũng có khi gặp chi lan này mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000m so với mực nước biển. Có người gọi là Hoàng lan, có người gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính: + Dạng đứng (D. phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và ra nhiều hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên… + Dạng thòng (D. mobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng… 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc 4 lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết [4]. Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [9]. Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V [4]. Các loài thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [1]. Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1]. - Cụm hoa chùm thường nhiều hoa hoặc ít hoa, dài thường rũ thõng xuống, nhiều loài hoa có giá trị làm cảnh [7]. - Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ, đa số có loài có hương thơm. Bao hoa chia hai vòng. Vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên. Vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi [7]. - Cằm được hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên dính nhau và dính với chân cột, có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều [7]. - Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước và trang trí (đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông 5 phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại). Nhiều loài có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa [7]. - Quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số loài khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát. Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hóa. Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [7]. - Hạt lan có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng hạt chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp hạt sẽ nảy mầm [7]. 1.1.2. Giới thiệu về loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) Lan Ý thảo hay Hoàng thảo ý thảo (D. gratiosissimum) là một loài lan thuộc chi Dendrobium của họ Orchidaceae. Là cây thân thảo, mọc thành cụm, với thân tròn có đốt được bao quanh bằng bao vỏ lâu rụng và chặt, sống chủ yếu là lâu năm, biểu sinh trên thân và cành cây thân gỗ chứa nhiều mùn, có quan hệ cộng sinh với nấm. Thân dài 25 – 40 cm, đường kính 0,5 - 0,7 cm, thòng xuống, gióng dài 2,5 - 2,7 cm. Lá trông giống như da, mép lá nhẵn, hình mác, xếp hai dãy, dài 8 – 10 cm, rộng 1,2 -1,8 cm, ở đầu 2 thùy lệch. Cụm hoa chứa 1-3 hoa dạng bên, mọc gần các đốt ở phần trên của thân không còn lá, hoa lộn ngược. Lá bắc nhỏ, hình mác, dài 0,5 cm, đầu tù. Hoa nở vào mùa xuân, đường kính 3–7 cm, cánh hoa và lá đài màu trắng với chóp màu tím nhạt. Các lá đài gần đều, hình mác, dài 2,3-2,5 cm, rộng 0,6-0,8 cm, đầu hơi nhọn. Lá đài ở lưng tự do, các lá đài bên hơi chếch tại đế. Cằm dài 0,5 cm, có đầu tù. Cánh hoa gần giống như lá đài ở lưng, hình mác, dài 2,4-2,5 cm, rộng 1-1,2 cm, đầu tù [6]. Cánh môi gần tròn, dài 2,5-2,7 cm, rộng 2,1-2,3 cm, gốc hơi thót và có các vạch chéo màu tím ở chóp, ở giữa có một đốm màu vàng. Trụ màu trắng, cao 0,3-0,4 cm. Nắp hình mũ cao, màu trắng, bề mặt phủ nhú mịn. Bầu dài 2,8-3,5 cm. Quả nang hình trứng thuôn dài [6]. Loài này có thể tái sinh bằng hạt và chồi [13]. 6 Lan Ý thảo được tìm thấy chủ yếu trong các rừng cây lá sớm rụng và khô cũng như các rừng thường xanh mưa ẩm vùng đất thấp hay miền núi tại Hải Nam (Trung Quốc), Assam (Ấn Độ), Lào, Thái Lan, Việt Nam và Myanma tại cao độ trong khoảng 0 tới 1.600 m. Tại Việt Nam, lan Ý thảo sống trong tự nhiên có tại các tỉnh Quảng Trị (huyện Hướng Hóa: Lao Bảo), Kon Tum (huyện Đắk Tô: rừng cấm Đắk Uy), Gia Lai (huyện Chư Păh: Gia Lu), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) [6]. Môi trường phát triển thích hợp với Lan Ý thảo có khí hậu từ mát tới nóng với lượng ánh sáng trung bình[6]. 1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1. Giới thiệu chung Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng có thể được tái sinh nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật có tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. 7 1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật Đầu tiên, năm 1983, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào. Nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính tồn tại của tế bào, nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ một số cây một lá mầm. Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông lại dùng những tế bào đã mất hết khả năng tái sinh [21]. Kotte cùng với Robbins (1922) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô). Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trường lỏng có chứa đường glucozơ và muối khoáng thu được hệ rễ nhỏ [21]. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên môi trường lỏng có chứa đường, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men [21]. Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin được nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic (NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…[21]. Skoog và Miller (1954) đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trưởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá. Một năm sau, chất đó được tổng hợp thành công và được Skoog gọi là kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của 8 rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đối của auxin/cytokinin và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hormon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay [21]. Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp...[21]. Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính địa lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa [21]. Guha & cộng sự (1966) đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống [21]. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ 9 các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [21]. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô- tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng rộng rãi trong đời sống [21]. 1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng của tế bào, sự phân hóa và phản phân hóa [21]. 1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào - Giả thuyết về tính toàn năng của tế bào theo Gottlibeb Haberlant (1902) là “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” [21]. Tính toàn năng là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [21]. 1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó được gọi là sự phản phân hóa tế bào [10]. 1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro Quá trình nuôi cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn: * Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả