Tài liệu ảnh hưởng của 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4 d) và muối nacl lên sự tạo thành và sinh trƣởng của mô sẹo và chồi cây mè đen (sesamum indicum l.) in vitro

MỤC LỤC Lời cam đoan ........................................................................................ iii Lời cảm tạ ............................................................................................. iv Tiểu sử cá nhân .......................................................................................v Mục lục ................................................................................................. vi Số bảng................................................................................................ viii Danh sách hình. ..................................................................................... ix Danh sách chữ viết tắt .............................................................................x Tóm lƣợc ............................................................................................... xi Mở đầu ................................................................................................. xii CHƢƠNG 1 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................1 1.1 Sơ lƣợc về cây mè ...............................................................................................1 1.1.1 Phân loại ........................................................................................1 1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố ..............................................................1 1.1.3 Đặc điểm thực vật ..........................................................................2 1.1.4. Tình hình sản xuất.........................................................................3 1.1.5. Công dụng và giá trị kinh tế .........................................................4 1.1.6. Giá trị dinh dưỡng. .......................................................................5 1.2 Sơ lƣợc nuôi cấy mô thực vật. ............................................................................5 1.2.1. Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cây tế bào thực vật. ................5 1.2.2 Ưu điểm của công nghệ nuôi cây tế bào thực vật. .........................6 1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô .....................................................6 1.2.4 Môi trường nuôi cấy ......................................................................7 1.2.5 Sơ lược về chất điều hòa sinh trưởng ............................................9 1.3 Sự hình thành và phát triển mô sẹo...................................................................11 1.3.1.Khái niệm mô sẹo .........................................................................11 1.3.2 Sự hình thành mô sẹo ...................................................................11 1.3.3 Đặc điểm của mô sẹo ...................................................................12 1.3.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến mô sẹo .....................................12 1.3.5 Sự tái sinh từ mô sẹo. ...................................................................13 vi 1.4 Một số công trình nghiên cứu tạo mô sẹo và khả năng chịu mặn trên cây mè .13 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG TIỆN PHƢƠNG PHÁP ...........................................................16 2.1 Phƣơng tiện .......................................................................................................16 2.2 Phƣơng pháp .....................................................................................................16 2.3 Xử lí số liệu ....................................................................................................... 19 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................20 3.1 Hiệu quả của 2,4-d trên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp. ................................20 3.1.1 Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo ..............................................................................20 3.1.2 Màu sắc của mô sẹo .....................................................................21 3.1.3 Kích thước mô sẹo .......................................................................22 3.2 Hiệu quả của BA và IAA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo tử diệp ......................23 3.2.1 Kích thước mô sẹo .......................................................................23 3.2.2 Tỷ lệ (%) mô sẹo tái sinh .............................................................24 3.3 Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh chồi ............................................................26 3.3.1 Tỷ lệ sống của tử diệp ..................................................................26 3.4.2 Tỷ lệ tái sinh chồi của tử diệp ......................................................26 3.4 Ảnh hƣởng của 2,4-D và muối nacl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo ................28 3.4.1 Tỷ lệ (%) sống ..............................................................................28 3.4.2 Sự biến đổi màu sắc của mô sẹo ..................................................29 3.4.3 Kích thước mô sẹo .......................................................................30 3.5 Ảnh hƣởng NaCl lên sự sinh trƣờng và phát triển của chồi in vitro.. ......... 30 3.5.1 Chiều cao gia tăng của chồi mè ..................................................31 3.5.2 Số lá gia tăng của cây mè ............................................................32 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ..........................................................................34 4.1 Kết luận .............................................................................................................34 4.2 Kiến nghị ...........................................................................................................34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................35 PHỤ CHƢƠNG 1............................................................................................................40 PHỤ CHƢƠNG 2............................................................................................................50 vii SỐ BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 3.1 Tỷ lệ (%) tạo sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D vào lúc 3 tuần và 5 tuần 21 3.2 Tỷ lệ (%) màu sắc trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D vào lúc 3 tuần và 5 tuần 22 3.3 Kích thƣớc (cm2) của mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D ở thời điểm 3 TSKC và 5 TSKC 23 3.4 Kích thƣớc (cm2) của mô sẹo trên môi trƣờng BA và IAA kết hợp 24 3.5 Tỷ lệ (%) mô sẹo tái sinh trên môi trƣờng BA và IAA kết hợp 25 3.6 Tỷ lệ sống (%) và tỷ lệ (%) tạo chồi ở thời điểm 3 TSKC 26 3.7 Kích thƣớc (cm2 ) tử diệp 27 3.8 Tỷ lệ (%) mẫu sống trên môi trƣờng 2,4-D 0,5mg/l có bổ sung muối NaCl với các nồng độ vào lúc 3 tuần và 5 tuần 28 3.9 Tỷ lệ màu sắc (%) màu sắc trên môi trƣờng MS + 2,4-D 0,5mg/l có bổ sung muối NaCl với các nồng độ vào lúc 3 tuần và 5 tuần 29 3.10 Kích thƣớc (cm2) của mô sẹo trên môi trƣờng MS + 2,4-D 0,5mg/l có bổ sung muối NaCl với các nồng độ vào lúc 3 tuần và 5 tuần 30 3.11 Chiều cao gia tăng trên môi trƣờng BA 0,5mg/l có bổ sung muối NaCl với các nồng độ ở thời điểm 1,2,3,4 TSKC 32 3.12 Số lá gia tăng trên môi trƣờng BA 0,5mg/l có bổ sung muối NaCl với các nồng độ ở thời điểm 1,2,3,4 TSKC. 32 viii DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 2.1 Vị trí loại bỏ phôi 17 3.1 Tử diệp mè đƣợc cấy trên môi trƣờng bổ sung 2,4-D 0,5 mg/l, (A): 1 TSKC. (B): 2 TSKC 20 3.2 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 2,4-D ở thời điểm 5 TSKC. A: 0,5mg/l, B: 1 mg/l, C: 2 mg/l. 23 3.3 Mô sẹo ở 3 tuần tuổi trên các môi trƣờng. A: BA 2 mg/l + IAA 0,5 mg/l, B: BA 4 mg/l + IAA 1 mg/l,C: BA 6 mg/l + IAA 1,5 mg/l 25 3.4 Tái sinh trực tiếp từ tử diệp mè. A: BA 6 mg/l, B: BA 8 mg/l. 26 3.5 Kích thƣớc tử diệp 2 TSKC trên nồng độ BA A:2 mg/l, B: 4 mg/l, C: 6 mg/l, D: 8 mg/l 28 3.6 Mô sẹo trên môi trƣờng có 2,4-D 0,5 mg/l và bổ sung ở thời điểm 5 TSKC. A: NaCl 0‰ B: NaCl 4‰, C NaCl 8‰ 30 3.7 Chiều cao và số lá gia tăng ở cây mè sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng môi trƣờng MS + BA 0,5mg/l đƣợc bổ sung NaCl A: NaCl 0‰, B: NaCl 4‰, C: NaCl 6‰, D: NaCl 8‰ 33 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4 – Dichlophenoxyacetic acid BA: Benzyl adenine Ctv: Cộng tác viên EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid HgCl2: Thủy ngân clorua. IAA: indole-3-acetic acid MS: Murashige and Skoog (1962) TSKC: Tuần sau khi cấy x NGUYỄN HOÀNG MINH SANG. “Ảnh hƣởng của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4d) và muối NaCl lên sự tạo thành và sinh trƣởng của mô sẹo và chồi cây mè đen (Sesamum indicum L.) in vitro ”. Luận văn tối nghiệp ngành Cử Nhân Sinh Học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hƣớng dẫn: PGs.Ts Lâm Ngọc Phƣơng. TÓM LƢỢC Cây mè là một cây trồng phổ biến có giá trị kinh tế và có khả năng chịu mặn. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng rất hiệu quả trong việc chọn lọc những giống kháng mặn. Mục đích của đề tài này là đánh giá khả năng kháng mặn của mô sẹo và cây con cây mè đen. Đề tài gồm 5 thí nghiệm về ảnh hƣởng của 2,4-D lên sự tạo mô sẹo, hiệu quả của BA và IAA lên sự tái sinh chồi, tái sinh trực tiếp từ tử diệp, ảnh hƣởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau lên sự phát triển của cụm sẹo, ảnh hƣởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau lên sự phát triển của cây. Kết quả cho thấy: Nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l đạt tỷ lệ sống, màu sắc, kích thƣớc tốt hơn nghiệm thức còn lại; Nghiệm thức BA 6 mg/l + IAA 1,5 mg/l có tỷ lệ sống, tỷ lệ tạo chồi, kích thƣớc cao hơn nghiệm thức còn lại; Nghiệm thức NaCl 8‰ có tỷ lệ sống, màu sắc, kích thƣớc thấp hơn các nghiệm thức còn lại; Nghiệm thức NaCl 8‰ có chiều cao gia tăng, số lá gia tăng, số rễ, chiều dài rễ thấp hơn các nghiệm thức còn lại. xi MỞ ĐẦU Mè ( Sesamum indicum L.) còn gọi là vừng, là loại cây có dầu, cây thực phẩm hiện đang đƣợc rất nhiều quốc gia quan tâm và có định hƣớng phát triển do có hàm lƣợng dầu cao, chất lƣợng tốt, chứa chất chống oxi hóa nhƣ sesamin, sesamolin, (Nguyễn Văn Chƣơng và Võ Văn Quang 2013). Là "Nữ hoàng của các loại cây trồng hạt dầu", mè đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, nó còn có nhiều ứng dụng nhƣ công nghiệp, kỹ thuật và dƣợc phẩm. Ở Đồng Bằng Sông Cữu Long mè là một cây trồng phổ biến, có thể trong luân canh với cây lúa. Ở Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích 700.000 ha đất bị nhiễm mặn và theo kịch bản biến đổi khí hậu trong 10-20 năm tới diện tích đất bị nhiễm mặn sẽ tăng thêm 300.000 ha ảnh hƣởng nặng nề đến diện tích đất trồng (Viện Khoa học Thủy lợi Miền Nam, 2011). Hơn nữa một số ngƣời dân chuyển canh tác sang nuôi tôm, khi muốn quay lại canh tác thì đất đã bị nhiễm mặn. Vì thế công tác lai tạo và tuyển chọn giống cây kháng mặn Đồng bằng sông Cửu Long là vấn đề cần thiết. Chính vì thế đề tài “Ảnh hƣởng của 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và muối NaCl lên sự tạo thành và sinh trƣởng của mô sẹo và chồi cây mè đen Sesamum indicum L.) in vitro” đƣợc tiến hành. xii CHƢƠNG 1 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY MÈ 1.1.1 Phân loại Mè còn gọi là vừng (Sesamum indicum L.) thuộc họ Vừng (Pedaliaceae) và đã đƣợc mô tả nhƣ là cây có dầu cổ xƣa nhất cây trồng và một nguồn dầu ăn có chất lƣợng cao và protein (Jeyamaryi và Jayabalan, 1997), đƣợc tôn vinh là "Nữ hoàng của các loại cây trồng hạt dầu" (Weiss, 1971). Một số giống mè phổ biến hiện nay  Nhóm mè đen Mè đen Trà Ôn (Vĩnh Long) trổ hoa ở thời điểm 35 NSKG, phân cành nhiều (4 - 6 cành/cây), chiều cao 90 cm, thời gian sinh trƣởng 95 ngày, năng suất khá cao (1,4 tấn/ha), trái có từ 4 - 6 ngăn (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2005). Mè đen có nguồn gốc từ Trung Quốc và Thái Lan (Morris, 2002).  Nhóm mè trắng Mè trắng V6: đây là giống đƣợc chọn lọc từ tập đoàn mè giống do công ty Mitsui của Nhật Bản đƣa vào Nghệ An (1994). Thời gian sinh trƣởng ngắn 75 - 80 ngày, thích nghi rộng, tỷ lệ dầu 52 - 53%. Năng suất 0,8 - 1,2 tấn/ha. Là giống mè chủ lực ở các tỉnh phía Nam, tuy nhiên kháng bệnh kém (Nguyễn Văn Chƣơng và Võ Văn Quang, 2013). Hạt mè trắng nhập khẩu từ Mexico, Guatemala và El Salvador (Morris, 2002).  Nhóm mè vàng Mè vàng Châu Phú (An Giang): trổ hoa ở thời điểm 30 NSKG, phân cành ít (2 - 3 cành trên cây), chiều cao khoảng 80 cm, thời gian sinh trƣởng ngắn 85 ngày. Năng suất bình quân 1,2 tấn/ha, trái có 8 ngăn (Phạm Hữu Trinh và ctv., 1986). Mè vàng Cồn Khƣơng (Cần Thơ): trổ hoa ở thời điểm 35 NSKG, phân cành 4 - 6 cành/cây), chiều cao 90 cm, thời gian sinh trƣởng 75 ngày, năng suất 1,4 tấn/ha, trái có 4 - 6 ngăn (Phan Văn Bằng Phi, 2010). 1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố Mè là một trong những cây trồng có dầu lâu đời nhất đƣợc trồng trên thế giới. Mè đƣợc đánh giá cao của ở Babylon và Assyria vào 4.000 năm trƣớc. Ngày nay, Ấn Độ và Trung Quốc là nơi sản xuất mè lớn nhất thế giới, tiếp theo là Miến Điện, Sudan, Mexico, Nigeria, Venezuela, Thổ Nhĩ Kỳ, Uganda và Ethiopia. Sản xuất thế giới năm 1985 là 2,53 triệu tấn trên 16,3 triệu mẫu Anh (Oplinger và ctv.,1997). Nó đƣợc trồng với tổng diện tích hơn 7,7 triệu ha với tổng sản lƣợng 3,3 triệu tấn (FAOSTAT, 2008). 1 Tuy nhiên nguồn gốc tự nhiên chính xác của cây mè vẫn chƣa đƣợc xác định, dù nhiều loài cây trong hoang dã có liên quan hiện diện ở Châu Phi và một số loài ở Ấn Độ. Đây là một cây đƣợc thuần hóa ở các vùng nhiệt đới khắp thế giới và đƣợc trồng để lấy hạt ăn do hạt có hàm lƣợng chất béo và chất đạm cao (Oplinger và ctv.,1997) . 1.1.3 Đặc điểm thực vật - Thân: Thân mọc thẳng đứng, cao 60-150 mét, có thể đến 3 mét. Thân thƣờng có hình 4 cạnh với những tiết diện vuông và những rãnh dọc. Tuy nhiên, có những dạng thân rất rỗng hình chữ nhật. Thân có thể tròn, trên thân có nhiều lóng hoặc ít lóng. Đặc tính này cũng để phân biệt giống. Trong điều kiện hạn, thân có thể thấp hơn, thân và cành hóa gỗ khi cây đã già.Màu sắc của thân thay đổi từ màu xanh nhạt đến tím, phổ biến nhất là màu xanh đậm (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006). - Cành: Xuất phát từ thân chính, cành có thể mọc cách hay mọc đối nhau, cành sẽ mang hoa và trái, trên các cành chính còn có cành cấp hai. Sự phân cành trên thân chính cũng là một yếu tố để phân biệt các giống mè, thƣờng màu của cành trên thân giống nhƣ thân chính.(Nguyễn Vy, 2003). - Rễ: Thuộc loại rễ cọc, rễ chính ăn sâu. Đồng thời hệ rễ bên của mè cũng rất phát triển về bề ngang. Rễ mè phân bố chủ yếu ở lớp đất từ 0 - 25 cm. Nếu mè ở vùng đất cát, vùng khô hạn, rễ cái có thể ăn sâu từ 1 m đến 1,2 m để tìm nguồn nƣớc ngầm ( Nguyễn Bảo Vệ và ctv.,2011). - Lá: Lá mè rất biến đổi về dạng và kích thƣớc trên cùng một cây và giữa các giống. Lá dƣới thƣờng rộng đôi khi có thùy, mép (rìa) hình răng cƣa hƣớng ra ngoài lá giữa thƣờng nguyên hình móc, đôi khi răng cƣa lá trên hẹp hơn. Lá mọc đối hay luân phiên tùy giống, cách sắp xếp lá ảnh hƣởng đến số hoa mang trên nách lá và năng suất hạt trên cây. Lá có màu xanh đậm, xanh nhạt tùy thuộc vào giống. Mặt trên của lá có lông tơ bao phủ (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007; Nguyễn Mạnh Cƣờng, 2008). - Hoa: hoa mè có dạng hình chuông. Cuống hoa ngắn, tràng hoa gồm 5 cánh màu trắng hoặc màu tím nhạt. Đài hoa màu xanh có 5 cánh cạn. Ống hoa dài 3 - 4 cm. Hoa mọc ở nách lá, thân và cành. Hoa thƣờng mọc đơn, cũng có trƣờng hợp mọc thành chùm. Mỗi chùm có 4 - 8 hoa. Hoa có 5 nhị đực nhƣng có 1 bất dục. Bầu nhụy nằm trên đài hoa, có 2 ngăn với nhiều vách giả. Hoa trắng mọc từ những cây có thân màu xanh, hoa tím mọc trên những cây có thân màu tím, hay những cây có thân màu xanh đã hóa gỗ (Mộc Hoa Lê, 2011; Đặng Văn Phú, 1981). - Quả: Là một loại quả nang, tiết diện hình chữ nhật, có rãnh sâu, có đầu nhọn hình tam giác ngắn. Hình dạng của quả cũng là một yếu tố để phân biệt các giống. Quả mở ra bằng cách chẻ dọc vách ngăn từ trên xuống. Mức độ mở quả là đặc tính quan trọng khi chọn giống để trồng cho phù hợp với điều kiện thu hoạch Chất lƣợng quả cũng khác nhau tùy vị trí đóng quả. Thƣờng quả ở vị trí thấp có hạt lớn hơn ở vị trí cao (Phạm Đức Toàn, 2008; Nguyễn Vy, 2003). 2 - Hạt: Hạt mè là hạt song tử diệp. Cấu tạo hạt có nội phôi nhủ (thịt hạt). Hạt mè nhỏ thƣờng có hình trứng hơi dẹp, trọng lƣợng 1000 hạt từ 2,0 – 4,0 g. Hạt mè tƣơng đối mảnh và chứa rất nhiều dầu, do đó, dễ mất sức nảy mầm sau khi thu hoạch. Một số giống mè có tính miên trạng kéo dài đến 6 tháng sau khi thu hoạch. Giống có trái nhiều khía thì hạt nhỏ hơn giống có trái ít khía (Nguyễn Mạnh Cƣờng, 2008; Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2005, Đinh Văn Lữ và ctv., 1970). 1.1.4. Tình hình sản xuất Trƣớc thế chiến thứ hai, diện tích trồng mè từ 5 triệu ha vào năm 1939, đạt sản lƣợng 1,5 tấn trong đó Ấn Độ là quốc gia trồng nhiều nhất với diện tích 2,5 triệu ha, kế đó là Trung Quốc 1,2 triệu ha, Miến Điện 700.000 ha, Soudan 400.000 ha, Mehico 200.000 ha. Các quốc gia có diện tích trồng >50.000 ha gồm: Pakistan, Thổ Nhĩ Kỳ, Ouganda, Megeria. Hiện nay, tuy với diện tích không nhiều mè đã đƣợc trồng khắp các châu lục trên thế giới. Sản lƣợng mè hằng năm trên thế giới khoảng 2 triệu tấn. Trong đó Châu Á : Sản xuất 55 - 60% sản lƣợng trên thế giới, Châu Mỹ: 18 - 20%, Châu Phi: 18 - 20%,Châu Âu và Châu Đại Dƣơng cũng có trồng rãi rác nhƣng không đáng kể. Hàng năm, có khoảng 6 triệu ha mè đƣợc gieo trồng và tập trung chủ yếu ở một số nƣớc khu vực Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ với tổng sản lƣợng gần 2,4 triệu tấn. Trong đó các nƣớc khu vực Châu Á chiếm 55% diện tích và 62% sản lƣợng, Châu Phi chiếm 33,58% (21,76% sản lƣợng) và còn lại là các nƣớc ở Châu Mỹ và các nƣớc khác (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2011). Các nƣớc trồng nhiều mè trên thế giới: Ấn Độ: Đứng đầu thế giới với sản lƣợng khoảng 4000.000 tấn/năm,Trung Quốc nƣớc sản xuất lớn thứ 2: 320.000 - 350.000 tấn, Sudan (Châu Phi): 150 - 200 ngàn tấn, Mexico (Châu Mỹ): 150 - 180 ngàn tấn. Các nƣớc có sản lƣợng tƣơng đối lớn khác là: Burma, Pakistan, Thailan (châu Á); Nigiêria, Tanazania, Uganda (Châu Phi); Colombia, Venezuela (Châu Mỹ). Năng suất mè nói chung còn thấp. Năng suất bình quân thế giới chỉ khoảng 300 - 400 kg/ha . Năng suất mè bình quân trên thế giới rất thấp (0,39 tấn/ha). Chỉ có hai quốc gia có năng suất mè tƣơng đối cao là Ai Cập (1,18 tấn/ha) và Trung Quốc (0,81 tấn/ha), năng suất thấp do đất đƣợc chọn để canh tác thƣờng là đất xấu, nghèo dinh dƣỡng, trình độ thâm canh và khả năng áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất còn hạn chế giữa các nƣớc (Nguyễn Mạnh Cƣờng, 2008).  Tình hình sản xuất mè ở nƣớc ta Ở nƣớc ta mè đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Miền Đông Nam Bộ và Trung Bộ (riêng tỉnh An Giang, diện tích trồng mè hiện nay tăng lên đến 16.000 ha). Tại vùng Châu Phú An Giang, năng suất đạt từ 400 - 600 kg/ha. Trong những năm gần đây, tại ĐBSCL diện tích mè đang có chiều hƣớng gia tăng nhanh bởi hiệu ứng của việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở một số địa phƣơng. Tại An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp và Long An ƣớc có khoảng gần 7000 ha mè, chiếm 17% diện tích mè cả 3 nƣớc, trong đó Đồng Tháp và An Giang là 2 tỉnh có năng suất bình quân cao nhất 1,2 – 1,4 tấn/ha . Tại Bình Thuận, trồng giống mè đen 2 vỏ Bình Thuận với khoảng cách 60cm x 15 cm x 2 - 3 hạt/ hốc, lƣợng phân bón 120N + 60 kg P2O5+60 K2O + 300 kg vôi/ha cho năng suất 1.000 kg/ha, mang lại lợi nhuận 14 triệu đồng/ha. Trồng giống mè địa phƣơng chƣa đƣợc phục tráng bằng phƣơng pháp sạ hàng, lƣợng phân bón là 250 kg NPK (16-168) cho năng suất 400 kg/ha, mang lại lợi nhuận 2,5 triệu đồng/ha, giá trị lợi nhuận tăng thêm từ mô hình so với đối chứng là 11,5 triệu đồng/ha (Nguyễn Văn Chƣơng và Võ Văn Quang, 2013). Năm 2004, diện tích gieo trồng cả nƣớc đạt 40.800 ha, tăng đến 16.000 ha so với năm 2000. Diện tích tăng chủ yếu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (5.800 ha) và Duyên hải Nam Trung Bộ (1.100 ha), diện tích lại giảm mạnh ở khu vực Tây Nguyên (3,000 ha) (Đoàn Thị Thanh Nhàn và ctv., 1996; Đặng Văn Phú, 1981). Về năng suất, năm 2004 cả nƣớc đạt 0,51 tấn/ha tăng không đáng kể so với năm 2000 (0,46 tấn/ha). Ở đồng bằng sông Cửu Long (0,9 tấn/ha), đồng bằng sông Hồng (0,75 tấn/ha), các vùng khác đạt 0,5 tấn/ha. (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006). Năm 2011, toàn thành phố Cần Thơ gieo trồng trên 5.700 ha cây công nghiệp ngắn ngày, trong đó cây mè chiếm 3/4 diện tích trực thuộc 2 quận Thốt Nốt (2.851 ha) và Ô Môn (1.400 ha) ( Văn Công và Anh Khoa, 2011; Phan Văn Bằng Phi, 2010). Với điều kiện đất đai và khí hậu thời tiết thuận lợi, giá lúa thấp, sản xuất lúa rủi ro cao, cây mè có thời gian sinh trƣởng ngắn, chi phí đầu tƣ thấp, giá bán nguyên liệu ổn định, nguyên liệu có nhu cầu cao trên thị trƣờng, giá mè thƣơng phẩm khoảng 30.000 – 35.000 đồng/kg, với năng suất bình quân 1,0 - 1,3 tấn/ha thì lợi nhuận do cây mè mang lại rất lớn gấp 2 -3 lần so với cây lúa. Mè là cây trồng cần quan tâm phát triển để chuyển đổi cơ cấu trong giai đoạn hiện nay trong các mô hình luân canh, xen canh và gối vụ, đem lại hiệu quả kinh tế cho ngƣời dân và đảm bảo nguồn nguyên liệu sản xuất dầu thực vật (Nguyễn Văn Chƣơng và Võ Văn Quang, 2013). 1.1.5. Công dụng và giá trị kinh tế a. Hạt mè Hạt mè chứa khoảng 50% protein và 25% dầu đƣợc sử dụng trong nấu nƣớng, làm kẹo, và các ngành công nghiệp thực phẩm khác. Trong thực phẩm, hạt mè là thành phần quan trọng trong rất nhiều món ăn nhằm tăng cƣờng khoáng chất và hƣơng vị (khoảng 70% sản lƣợng thế giới). Trong dầu mè có chứa chất chóng oxi hóa nhƣ sesamin, sesamolin, sesaminol và sesaminol glucosides, không chuyển thành mùi khó chịu nên kéo dài thời gian bảo quản. Ở Việt Nam hạt mè phần lớn dùng trong chế biến thức ăn (bánh kẹo, ép lấy dầu) (Phạm Đức Toàn, 2009). 4 b. Dầu mè Dầu mè còn thể đƣợc sử dụng trong sản xuất xà phòng, sơn, nƣớc hoa, dƣợc phẩm và thuốc trừ sâu. Sau khi dầu mè đƣợc ép từ hạt giống, nó một cao-protein tuyệt vời (3450%) thức ăn cho gia cầm và chăn nuôi. Trong kỹ nghệ, dầu mè sử dụng để bôi trơn máy móc cao cấp: máy bay, máy dùng trong khoa học kỹ thuật, dầu dùng để pha sơn, pha vecni rất tốt vì có màu láng bóng (Oplinger và ctv.,1997). Dầu làm giảm cholesterol do hàm lƣợng chất béo không bão hòa cao trong dầu, là một loại thuốc chữa bệnh răng miệng, và kem đánh răng (Morris, 2002). Dầu mè còn là một nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất dầu diesel sinh học, không độc hại, và thân thiện với môi trƣờng, có số octan cao hơn so với dầu diesel thông thƣờng. (Eriola and Tunde, 2013). 1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng. Trong dƣợc phẩm, dầu mè có chứa γ - tocopherol cùng với sự hoạt động của vitamin E có tác dụng ngăn ngừa ung thƣ, tim mạch, giảm huyết áp, hạn chế lƣợng NaCl đƣa vào cơ thể . Ashri, (1993) đã báo cáo rằng lecithin (58 - 395 ppm) và myristic axít (328 - 1.728 ppm) có hiệu quả để làm giảm sự nhiễm mỡ trong gan và điều trị thành công bệnh viêm da, khô da… Mè có giá trị dinh dƣỡng cao, trong hạt mè có chứa: 45 - 55% dầu, 19 - 20% Protein, 8 - 11% đƣờng, 5% nƣớc, 4 - 6% chất tro. Thành phần axit hữu cơ chủ yếu của dầu mè là 2 loại acid béo chƣa no sau: - Axit oleic (C18 H34 O2): 45,3 - 49,4%. - Axit linoleic (C18 H32 O2): 37,7 - 41,2%. Nếu so sánh hàm lƣợng acid amin có trong bột mè và trong thịt, ta thấy các acid amin có trong bột mè gần tƣơng đƣơng với acid amin có trong thịt. 1.2 SƠ LƢỢC NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo. 1.2.1 Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cây tế bào thực vật. Theo Haberlandt (1902) mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Thành, 2000). Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 5 1.2.2 Ƣu điểm của công nghệ nuôi cây tế bào thực vật. Theo Nguyễn Đức Thành (2000), phƣơng pháp nuôi cấy mô có nhiều ƣu điểm sau: + Nhân một số lƣợng cây con lớn với diện tích nhỏ. + Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đƣa giống vào sản xuất. + Có thể tạo đƣợc một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vitro. + Không bị ảnh hƣởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy mô phải đƣợc thực hiên với một quy trình nghiêm túc và Tỷ mĩ, điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, các mẫu vật phát triển trên một môi trƣờng vô trùng. 1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô Nuôi cấy mô đƣợc chia làm bốn giai đoạn. Mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).  Giai đoạn 0: chuẩn bị cây mẹ. Khởi đầu của quá trình vi nhân giống cần phải có sự lựa chọn cẩn thận và cải thiện thật tốt điều kiện vệ sinh của cây mẹ. Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng nhƣ nguồn dùng làm mẫu cấy có thể đƣợc cải thiện bởi một số kỹ thuật nhƣ tƣới nhỏ giọt, ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) làm cho mẫu cấy non hơn và sạch hơn. Ngoài ra, các thủ tục để phát hiện và làm giảm hay loại trừ các mầm bệnh về vi khuẩn, virus là điều cần thiết (George, 1993)  Giai đoạn 1: Giai đoạn khử trùng Đây là sự kết hợp giữa một phƣơng pháp khử trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của mẫu cấy không bị nhiễm. Thực tế điều này khó đạt 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu. Để nâng cao tỉ lệ tuyệt trùng, cần chú ý đến nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng. Nồng độ và thời gian khử trùng thay đổi tuỳ theo loài và kích thƣớc của mẫu cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).  Giai đoạn 2: Nhân chồi Nguyễn Xuân Linh (1998) cho rằng toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Vì vậy giai đoạn này đƣợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình. George (1993) cho rằng số lƣợng chồi đƣợc nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và nồng độ kích thích tố sử dụng trong môi trƣờng. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lƣợng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lƣợng chồi bên, tạo chồi bất định. Chồi bên và chồi ngọn có thể đƣợc cảm ứng trên in vitro bằng cách làm tăng số chồi đang hiện hữu. Một mẫu cấy có mang chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm chồi tuỳ thuộc vào loài thực vật và môi trƣờng nuôi cấy. Sau vài lần cấy chuyền các chồi đƣợc tạo ra và chuyền sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). 6 Có 3 phƣơng pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận đƣợc từ mô thực vật nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô thực vật không thông qua mô sẹo và phƣơng pháp nhân chồi bên (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Trong đó phƣơng pháp khá đơn giản để nhân nhanh số chồi là phƣơng pháp nhân chồi bên. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế vì nó đơn giản hơn phƣơng pháp khác, tốc độ nhân giống cao, sản phẩm ổn định về mặt di truyền, cây con tăng trƣởng rất tốt có lẽ là do đã đƣợc trẻ hoá (Dƣơng Công Kiên, 2002).  Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dƣỡng. Những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng kích thích rễ. Trong môi trƣờng này cần phải bổ sung auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thƣờng giảm hơn so với môi trƣờng tăng sinh. Tuy nhiên, một số loài ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin. Những loại auxin thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để cảm ứng ra rễ là IAA, IBA, NAA. Sự đáp ứng của chồi với auxin và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loại thực vật, đôi khi chính cytokinin còn tồn tại trong môi trƣờng nhân giống đã cản sự ra rễ của chồi trong giai đoạn tạo rễ (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).  Giai đoạn 4: thuần dƣỡng Mục đích của giai đoạn này là làm giảm mức độ chết của cây con in vitro khi chuyển từ trạng thái sống dị dƣỡng sang tự dƣỡng trong nhà lƣới. Để tăng tỉ lệ sống sót bên ngoài thì cây con nhất thiết phải trải qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần giống bên ngoài nhƣ tăng cƣờng ánh sáng, nhiệt độ. George (1993) cho biết là tƣới phun sƣơng trong giai đoạn này rất hiệu quả để duy trì độ ẩm. 1.2.4 Môi trƣờng nuôi cấy Năm 1902 Haberlandt đầu tiên đề xƣớng phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, nhƣng không thành công trong các thí nghiệm của mình. Vì lúc bấy giờ những hiểu biết về nhu cầu dinh dƣỡng khoáng của tế bào thực vật còn hạn chế và đặc biệt là vai trò của các chất điều khiển sinh trƣởng đối với quá trình phân chia và phân hóa của tế bào còn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Lựa chọn môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy là một yếu tố rất quan trọng ảnh hƣởng đến sự thành công trong nhân giống. Thực vật phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa chọn thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng. Do nhu cầu dinh dƣỡng cho sinh trƣởng tối ƣu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể ít nhiều có sự khác nhau (Murashige và Skoog, 1962). Đến nay, hầu hết các môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đƣợc sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm những thành phần sau: Nước Phẩm chất nƣớc là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nƣớc sử dụng trong nuôi cấy thƣờng là nƣớc cất một lần. Trong một số trƣờng hợp ngƣời ta cũng sử dụng nƣớc cất hai lần hoặc nƣớc khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). 7 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng a.Các nguyên tố khoáng đa lƣợng Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dƣới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau. Tất cả các nguyên tốnày là rất cần thiết cho sinh trƣởng của mô và tế bào thực vật. Các nguyên tố khoáng đa lƣợng đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở nồng độ 30mg/l (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Nitơ thì thông thƣờng đƣợc cung cấp nhƣ ion nitrat (từ KNO3) và ion amonium (từ NH4NO3). Về mặt lý thuyết, có sự thuận lợi khi cung cấp nitơ từ ion amonium và nitrat nhƣng thực tế thì hàm lƣợng nitơ cần phải đƣợc giảm khi kết hợp với các phân tử đa lƣợng vì nếu nhƣ nồng độ cao ion amonium sẽ gây độc cho cây trồng (Butenko, 1964; trích bởi Nguyễn Đức Thành, 2000). Photpho thƣờng đƣợc cung cấp dƣới dạng ion photphat của muối natri và muối kali. Nồng độ photphat cao có thể gây kết tủa môi trƣờng hoặc là không hòa tan đƣợc muối photphat. b. Các nguyên tố vi lƣợng Các nguyên tố vi lƣợng là thành phần của các enzyme, tuy chiếm tỷ lệ nhỏ nhƣng lại là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng nuôi cấy mô đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Trong môi trƣờng nuôi cấy, sắt thƣờng đƣợc bổ sung dƣới dạng chelate Fe-EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate) hay Fe-EDDHA (Ethylenediamine Di-o hydroxyphenylacetic Acid), ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng từ từ vào môi trƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định, Khi thiếu sắt, tế bào mất đi khả năng phân chia. Các vitamin Để có thể sinh trƣởng tố, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trƣờng một hay nhiều loại vitamin và amino axit. Trong các loại vitamin, thiamin (B1) đƣợc xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật, Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng đƣợc bổ sung và môi trƣờng nuôi cấy nhằm tăng cƣờng sức sống cho mô (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Myo-inositol có vai trò trong sự sinh tổng hợp thành tế bào và thƣờng đƣợc dùng với hàm lƣợng lớn 50-100 mg/l. 8 Agar Việc làm đông đặc môi trƣờng nuôi cấy dựa vào các hợp chấp polysaccharide cao phân tử, chúng giữ nƣớc và môi trƣờng cung cấp cho cây, có thể dùng agar. Nồng độ agar thƣờng đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật là 510% (Vũ Văn Vụ, 1999). Nồng độ agar đƣợc sử dụng ảnh hƣởng tới thế năng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy, độ cứng của môi trƣờng, sự sinh trƣởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy nhƣ sự thừa nƣớc (hyperhydricity), sự hoạt động của cytokinin trong môi trƣờng có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Nước dừa Nƣớc dừa có chứa khá nhiều hợp chất nitrogen dạng khử nhƣ các acid amine, ngoài ra trong nƣớc dừa còn chứa các hormone sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinine. Lƣợng nƣớc dừa dùng trong môi trƣơng nuôi cấy khoảng 10% thể tích môi trƣờng (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống nhƣ cytokinin là chất chính trong nƣớc dừa (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Nguồn Carbon Các nguồn carbon (sucrose, glucose) là một thành phần quan trọng môi trƣờng nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy là quang trọng cho sự phát triển rẽ và nhân chời, vừa làm tăng chiều cao cây của cây con. Ngoài ra nguồn cacbonhydrat còn có tác dụng điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trƣờng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Hai dạng đƣờng thƣờng gặp nhất là sucrose và glucose, nhƣng hiện nay sucrose đƣợc sử dụng phổ biến hơn và nồng độ sucrose biến đổi từ 1-8 % (Bùi Bá Bổng, 1995). pH Murashige và Shoog (1962) nhận thấy rằng pH 5,7-5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan chất khoáng trong môi trƣờng nuôi cấy MS. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trƣờng rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar.Độ pH của môi trƣờng đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch 10% KOH, NaOH, HCl. Có hể đo pH bằng máy để bàn hoặc máy đo pH cầm tay. Thƣờng thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính pH của môi trƣờng. Than hoạt tính Than hoạt tính đƣợc đƣa vào môi trƣờng nhằm mục đích làm tối môi trƣờng nuôi cấy, hấp thu các phân tử, các phân tử thích hợp có cấu trúc vòng (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Tuy nhiên than hoạt tính cũng có một số tác dụng khác nhƣ hút các chất hữu cơ nhƣ Phytohoocmon, Vitamin, Sắt EDTA, Kẽm,… làm giảm hiệu quả của chất điều hòa sinh trƣởng, vitamin và các khoáng (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) 1.2.5 Sơ lƣợc về chất điều hòa sinh trƣởng Bên cạnh các chất cung cấp dinh dƣỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trƣởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các 9 tổ chức. Có bốn nhóm chất điều khiển sinh trƣởng chung đó là auxin, cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô. Sự sinh trƣởng, phân hóa và phát sinh cơ quan của mô nuôi cấy trở nên thuận lợi chỉ khi bổ sung một hoặc một số chất thuộc bốn nhóm trên vào môi trƣờng nuôi cấy (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Chất điều hoà sinh trƣởng là những chất có hoạt tính sinh học cao nên với một hàm lƣợng rất nhỏ (10-9) có thể kích thích, ức chế hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào trong thực vật. Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất và nồng độ tế bào nhận tác dụng. Auxin (hormone sinh trưởng) Trong nuôi cấy in vitro auxin thúc đẩy sinh trƣởng của mẫu qua hoạt hóa sự phân chia mô và kéo dài tế bào. Năm 1953, Went và Thimann chứng minh rằng auxin (IAA) kích thích sự tạo rễ (trích bởi Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Các auxin có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp từ 0,1-1 mg/l tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Hàm lƣợng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngƣợc lại ở hàm lƣợng auxin cao sẽ tạo mô sẹo (Vũ Văn Vụ, 1999). Hơn nữa, auxin điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó đƣợc phối hợp sử dụng với các cytokinin. Trong nuôi cấy mô thực vật, nhóm Auxin thƣờng đƣợc sử dụng gồm các chất: 2,4D (Dichlorophenoxy acetic acid); IBA (Indol butyric acid); IAA (Indol acetic acid); NAA (Naphthalene acetic acid) (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), auxin thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy. Loại auxin thƣờng đƣợc sử dụng cho mục đích này là 2,4-D, nhƣng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo trong môi trƣờng có 2,4-D này thì tế bào dễ bị đột biến. Môi trƣờng bổ sung 2,4-D sử dụng rất có hiệu quả trong việc tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật, nó không đƣợc dùng trong môi trƣờng tái sinh cơ quan (Vũ Văn Vụ, 1999). Cytokinin (hormone phân bào) Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tếbào, sự thay đổi ƣu thếngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đƣợc sửdụng thƣờng xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trƣởng của chồi nuôi cấy mô. Đồng thời, nó ức chế sự tạo rễ và hình thành mô sẹo. Nồng độ sử dụng 0,12 mg/l. Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). 10 Sự tương tác giữa nhóm Auxin và Cytokinin Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến sự thành lập tạo chồi và rễ. Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi, ngƣợc lại tỷ lệ cao auxin và cytokinin thấp thích hợp cho tạo rễ, còn ở mức độ trung gian thích hợp cho tạo mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). 1.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN MÔ SẸO 1.3.1.Khái niệm mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, không có hình dạng nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo đƣợc hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Katherine, 1997). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, rễ, lá), khi nơi có vết cắt. Mô sẹo có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để phát triển thành cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009). Xét về mặt cấu trúc thì mô sẹo là một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng đƣợc sắp xếp lỏng. Còn xét về mặt chức năng thì mô sẹo là những tế bào chƣa phân hóa (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng nhƣ: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, protoplast, sản xuất các chất hoạt tính sinh học,… Theo Vũ Văn Vụ (1999) việc nuôi cấy mô sẹo đƣợc ứng dụng trong nhiều trƣờng hợp: - Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện. - Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học… - Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng chịu mặn, chịu phèn… - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. 1.3.2 Sự hình thành mô sẹo Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trƣờng nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: Phát sinh, phân chia tế bào, và biệt hóa mô sẹo (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009) 1. Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. 2 Tế bào đi vào giai đoạn phân chia, tăng sinh khối. 3. Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đƣờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 11 1.3.3 Đặc điểm của mô sẹo  Đặc điểm bên ngoài mô Mô sẹo thƣờng có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Theo Vũ Văn Vụ (1999) mô sẹo khi hình thành thƣờng có 2 loại : • Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất lỏng và không bào to. • Loại cứng: Các tế bào cứng, chắc thành khối, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ  Đặc điểm bên trong mô sẹo Nhiều báo cáo cho rằng. mô sẹo đƣợc tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dƣỡng (Katherine, 1997). Mô sẹo có chƣa diệp lục phụ thuộc vào lƣợng đƣờng bổ sung trong môi trƣờng và cƣờng độ ánh sáng. Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội có số lƣợng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy, thành phần môi trƣờng nhất là hormone (Nguyễn Đức Thành, 2000). Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy thực vật chắc chắn sẽ xảy ra khi mô sẹo đƣợc nuôi lâu trong môi trƣờng, nhƣng có thể sự phát sinh hình thái này bị ức chế nếu mô sẹo đƣợc cấy chuyển liên tục. Song, trong trƣờng hợp khác, mô sẹo hình thành từ mẫu cấy trong môi trƣờng tạo mô sẹo, sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng khác có thành phần dƣỡng chất và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi và rễ) sẽ xảy ra. Mô sẹo khi hình thành nếu đƣợc tiếp tục duy trì trong môi trƣờng có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhƣng nếu chuyển sang một môi trƣờng có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). 1.3.4 Một số điều kiện ảnh hƣởng đến mô sẹo  Ảnh hƣởng của loại cơ quan tạo mô sẹo Mô sẹo có thể đƣợc tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật. Có thể sử dụng các mô hay cơ quan của thực vật để tạo mô sẹo nhƣ: rễ, thân, lá, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành, phôi hợp tử trƣởng thành, tƣợng tầng libe gỗ…Mỗi loại mô sẹo tạo từ cơ quan khác nhau có đặc tính khác nhau.  Ảnh hƣởng tuổi của cơ quan trong sự tạo mô sẹo Những mảnh cơ quan trƣởng thành không có khả năng tạo mô sẹo. Ngƣợc lại, cây còn non hay những mảnh thân còn rất non của cây trƣởng thành có thể hình thành mô sẹo trên môi trƣờng có chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, đặc biệt là auxin. 12  Ảnh hƣởng của ánh sáng trong sự hình thành mô sẹo Trong suốt thời gian tạo mô sẹo tùy theo mẫu cấy mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết. Đa số trƣờng hợp, trong tối sự tạo mô sẹo diễn ra tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt với mẫu cấy là lá .  Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật lên mô sẹo Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo, trong môi trƣờng nuôi cấy, auxin thƣờng gây ra sự tạo bƣớu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma, từ huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Mô sẹo thƣờng đƣợc chuyển sang môi trƣờng dinh dƣỡng mới theo từng giai đoạn. Nếu nhƣ cứ nuôi mãi không tách ra và cấy chuyền thì mô sẹo sẽ bị hoại tử và chết. Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trƣởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi (Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Việt Dũng, 2009).  Hiện tƣợng hóa nâu trong môi trƣờng nuôi cấy Hiện tƣợng hóa mẫu hóa nâu hay bị đen là chết mẫu hay làm giảm sự tăng trƣởng. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo. Các mô non thƣờng ít bị hóa nâu hơn mô già (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). 1.3.5 Sự tái sinh từ mô sẹo. Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy thực vật chắc chắn sẽ xảy ra khi mô sẹo đƣợc nuôi lâu trong môi trƣờng, nhƣng có thể sự phát sinh hình thái này bị ức chế nếu mô sẹo đƣợc cấy chuyển liên tục. Song, trong trƣờng hợp khác, mô sẹo hình thành từ mẫu cấy trong môi trƣờng tạo mô sẹo, sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng khác có thành phần dƣỡng chất và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi và rễ) sẽ xảy ra. 1.4 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN TRÊN CÂY MÈ Khả năng chịu mặn của các loài đƣợc đánh giá bằng NaCl và Na2SO4vì đất mặn chủ yếu bị chi phối bởi natri, clorua và ion sunfat (Ayaz và ctv., 2000). Muối ngoài tác dụng độc hại của các ion clorua, ở nồng độ cao của muối, sẽ làm giảm tiềm năng nƣớc trong môi trƣờng và cản trở sự hấp thụ nƣớc làm giảm sự nảy mầm (Hamid và ctv., 2012). Độ mặn gây ra sự xáo trộn của quá trình trao đổi chất dẫn đến tăng các hợp chất phenolic (Huang và Redmann, 1995). Stress do nhiễm mặn có thể ảnh hƣởng nảy mầm hạt thông qua ảnh hƣởng đến áp xuất thẩm thấu và ion độc tính đặc biệt. Độ mặn cao có thể ức chế sự kéo dài chồi và do đó làm giảm sự hấp thu nƣớc của thực (Yupsanis và ctv., 1994). Kabar (1986) tìm thấy rằng độ mặn ở mức 4,5 mmhos.cm-1 không ảnh hƣởng đến nảy mầm, nhƣng độ mặn ở mức 8,9 mmhos.cm-1 có ảnh hƣởng bất lợi về tỷ lệ nảy mầm của bắp cải. Ông cũng báo cáo rằng sự nảy mầm của hạt lúa mì giảm trong sự hiện diện 13