Tài liệu Xử lý vi khuẩn lao trong nước sử dụng hạt nano gắn enzyme

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quang Đạo XỬ LÝ VI KHUẨN LAO TRONG NƢỚC SỬ DỤNG HẠT NANO GẮN ENZYME Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ts. Phạm Bảo Yên Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Bảo Yên, cán bộ phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học – Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzyme - Protein Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình dạy bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và chỉnh sửa luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Bệnh viện Phổi Hà Nội; đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi làm cảm ơn chân thành đến cán bộ và nghiên cứu sinh tại phòng thí nghiệm Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học, những người luôn luôn bên cạnh giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ và gia đình vì đã luôn ở bên con động viên, ủng hộ, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành tốt khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, 25 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Quang Đạo 1 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Mục lục MỞ ĐẦU........................................................................................................................................................... 7 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN. ........................................................................................................................... 8 1.1. Nƣớc thải và các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải ...................................................................... 8 1.1.1. Khái niệm và phân loại nƣớc thải ................................................................................... 8 1.1.2. Thực trạng xử lý nƣớc thải ở các bệnh viện và trung tâm thu nhận bệnh nhân hiện nay 9 1.1.3. Các phƣơng pháp xử lý vi sinh vật trong nƣớc thải....................................................... 10 1.1.3.1. Phƣơng pháp vật lý ................................................................................................... 11 1.1.3.2. Phƣơng pháp hóa học ................................................................................................ 12 1.1.3.3. Phƣơng pháp sinh học ............................................................................................... 13 1.2. Bệnh lao ............................................................................................................................... 15 1.2.1. Bệnh lý học ................................................................................................................... 15 1.2.2. Dịch tễ học .................................................................................................................... 16 1.3. Vi khuẩn lao ......................................................................................................................... 18 1.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao ............................................................................................ 18 1.3.2. Hệ gen vi khuẩn lao ...................................................................................................... 20 1.4. Hạt nano và ứng dụng .......................................................................................................... 21 1.4.1. Các tính chất của hạt nano............................................................................................ 21 1.4.2. Hạt nano từ tính ........................................................................................................... 23 1.4.3. Phức hệ và phƣơng pháp tạo phức hệ với hạt nano. ...................................................... 24 1.4.4. Ứng dụng của hạt nano ................................................................................................. 26 1.5. Enzyme và ứng dụng trong xử lý nƣớc thải .......................................................................... 28 1.5.1. Ứng dụng của enzyme trong xử lý nƣớc thải ................................................................. 28 1.5.2. Lysozyme ...................................................................................................................... 29 1.5.3. Lipase ........................................................................................................................... 29 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. .................................................... 32 2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................................... 32 2.1.1. Vắc xin BCG và mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin............................................................ 32 2.1.2. Hạt từ nano amino (NP-NH2) và chất xúc tác tạo phức hệ EDC .................................... 33 2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn chèn 6110 ........................................................................ 33 2.1.4. Enzyme lipase, lysozyme và kháng thể kháng lao ............................................................ 35 2 Luận văn Thạc sỹ Khoa học 2.1.5. 2.2. Nguyễn Quang Đạo Các dung dịch đệm và hóa chất khác ............................................................................... 36 Phƣơng pháp ........................................................................................................................ 36 2.2.1. Tạo phức hệ hạt nano từ amino-kháng thể/enzyme ........................................................ 36 2.2.2. Thử độ bền vững của phức hệ ........................................................................................ 37 2.2.3. Làm giàu và ly giải vi khuẩn lao ....................................................................................... 37 2.2.4. Phân tích kết quả điện di bằng phần mềm Image J .......................................................... 38 2.2.5. Xây dựng mô hình nước thải chứa vắc xin BCG thử nghiệm phức hệ ............................... 38 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................. 39 3.1. Tối ƣu điều kiện phản ứng gắn ............................................................................................. 39 3.1.1. Tối ƣu nồng độ hạt từ nano amino ................................................................................ 39 3.1.2. Tối ƣu nồng độ EDC và thời gian phản ứng .................................................................. 41 3.1.3. Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể. ............................................................ 42 3.2. Hiệu quả của các phức hệ trong việc bắt giữ và ly giải tế bào vi khuẩn trong vắc xin BCG .. 44 3.2.1. Sử dụng phức hệ đơn .................................................................................................... 44 3.2.2. Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng một bƣớc ................................................................ 46 3.2.3. Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bƣớc .................................................................. 48 3.3. Thử nghiệm các phức hệ trong mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG ................................... 51 3.3.1. Thử nghiệm phức hệ hạt từ kháng thể trong mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG ....... 51 3.3.2. Sử dụng phức hệ đơn và phức hệ kép bắt giữ và ly giải tế bào vi khuẩn trong mẫu nƣớc thải bổ sung vắc xin BCG. ........................................................................................................... 52 Kết luận .......................................................................................................................................................... 56 3 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Bảng ký hiệu các chữ viết tắt AP Alkaline Phosphatase BCG Bacillus Calmette Guerin EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IS6110 Insert Sequence 6110 MTB Mycobacterium tuberculosis NHS N-hydroxysuccinimide NP-NH2 Nano amino Particles PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction SEM Scan Electron Microscope SMCC Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan – 1 – carboxylate TAE Tris base-Acetic Acid-EDTA TB Tuberculosis TE Tris-HCl-EDTA WHO World Health Organization 4 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Danh mục bảng: Bảng 1.1 Một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm có mặt trong nước thải. 10 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 32 Danh mục hình: Hình 1.1 Sử dụng màng lọc để bắt giữ vi khuẩn trong nước thải. 11 Hình 1.2 Chu trình phát triển của Bdellovibrio bacteriovorus 14 Hình 1.3 Con đường lây nhiễm chính bệnh lao 17 Hình 1.4 Hình ảnh SEM của vi khuẩn lao (MTB) 19 Hình 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 20 Hình 1.6 Hạt nano từ bọc silica 24 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử SMCC 25 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử của EDC 25 Hình 1.9 Phản ứng tạo liên kết amide xúc tác bởi EDC 26 Hình 2.1 Vắc-xin BCG 30 Hình 2.2 Đoạn chèn IS6110 đặc trưng cho vi khuẩn lao và cặp mồi sử dụng cho PCR 32 Hình 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 33 Hình 2.4 Phần mềm phân tích ảnh ImageJ 36 Hình 3.1 Tối ưu thể tích hạt nano từ tính trong phản ứng gắn 38 Hình 3.2 a Thời gian gắn kháng thể lên hạt nano từ tạo phức hệ bắt giữ 39 b Phân tích độ sáng băng ADN trong hình 3.2a bằng phần mềm ImageJ Hình 3.3 a Thử nghiệm độ bền phức hệ hạt từ - kháng thể Hình 3.4 b Phân tích độ sáng băng ADN trong hình 3.3a bằng phần mềm ImageJ Phức hệ đơn. Hình 3.5 a Sử dụng phức hệ đơn bắt giữ và ly giải vi khuẩn trong vắc xin BCG. 39 41 41 43 44 5 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo b Phân tích độ sáng băng ADN trong hình 3.5a bằng phần mềm ImageJ 44 Hình 3.6 Phức hệ kép tạo thành qua 1 bước phản ứng 45 Hình 3.7 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng một bước bắt giữ và ly giải vi khuẩn trong mẫu vắc xin BCG Hình 3.8 b Phân tích độ sáng băng ADN trong hình 3.7a bằng phần mềm ImageJ Phức hệ kép hình thành qua hai bước phản ứng Hình 3.9 46 a Sử dụng phức hệ kép từ phản ứng hai bước so sánh với phức hệ kép từ phản ứng một bước 46 47 48 b Phân tích độ sáng băng ADN trong hình 3.9a bằng phần mềm ImageJ Hình 3.10 Kiểm tra khả năng bắt giữ vi khuẩn của phức hệ hạt từ kháng thể Hình 3.11 48 a quả sử dụng phức hệ đơn, phức hệ kép bắt giữ và ly giải tế bào vi khuẩn trong mẫu nước thải bổ sung vắc xin BCG 50 51 b Phân tích độ sáng băng tương ứng trên hình 3.11a bằng phần mềm imageJ Các mẫu 1-6 tương ứng với mẫu từ 1-6 trên hình 3.11a Hình 3.12 Kiểm tra khả năng bắt giữ và ly giải tế bào của phức hệ đơn 51 53 6 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo MỞ ĐẦU Hiện nay, các cơ sở như bệnh viện, các trung tâm thu nhận người mắc bệnh truyền nhiễm là nơi tập trung lượng lớn vi sinh vật gây bệnh. Nước thải từ các cơ sở này chứa nhiều các tác nhân vi khuẩn, virus có khả năng lây nhiễm, nếu không có phương pháp xử lý thích hợp sẽ trở thành nguy cơ lây lan các bệnh truyền nhiễm. Các vi sinh vật có trong nước thải bao gồm nhiều loài khác nhau, đề tài này tập trung vào đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn gây bệnh lao Mycobacterium tuberculosis (MTB). Lao là bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ bệnh nhân tử vong cao thứ hai hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới WHO, đến năm 2015 khoảng một phần ba dân số toàn cầu đã nhiễm vi khuẩn lao dạng tiềm tàng, mỗi năm có khoảng 10 triệu ca nhiễm lao mới (10,4 triệu ca năm 2015), gây tử vong cho hơn 2 triệu người mỗi năm và hầu hết ở các nước đang phát triển [2][3]. Ở Việt Nam, sự gia tăng nhanh chóng của các chủng lao đa kháng thuốc đã làm cho việc chữa trị lao trở nên phức tạp hơn, theo số liệu điều tra từ chương trình chống lao quốc gia Việt Nam, khoảng 40% số bệnh nhân ở Việt Nam đã cho kết quả kháng thuốc với Rifampin, một loại thuốc kháng sinh hàng 1 quan trọng [4]. Vi khuẩn lao là một chủng nguy hiểm không chỉ bởi khả năng gây bệnh mà còn bởi khả năng sống sót cao trong môi trường tự nhiên. Vi khuẩn lao có thể tồn tại trong đất (ẩm hoặc khô) trong 4 tuần, và nếu được bảo vệ khỏi tiếp xúc với ánh sáng, có thể duy trì sự sống tới 74 ngày và lâu hơn nữa trong chất thải động vật.[5] Hiện nay, để xử lý vi sinh vật trong nước thải các phương pháp thường được sử dụng có thể chia vào ba nhóm chính: các phương pháp vật lý, hóa học và sinh học, tuy nhiên, các phương pháp vật lý, hóa học khá tốn kém để lắp đặt hệ thống xử lý và duy trì trong thời gian dài, hơn nữa một số phương pháp có nguy cơ tái nhiễm vi khuẩn cao. Từ những lí do nêu trên, để tiêu diệt vi khuẩn lao trong nước thải và góp phần ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm (đặc biệt là những chủng lao kháng thuốc), tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phát triển một phương pháp xử lý vi khuẩn lao trong nước” sử dụng công nghệ nano kết hợp với công nghệ protein enzyme. 7 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo CHƢƠNG I. TỔNG QUAN. 1.1. Nƣớc thải và các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải 1.1.1. Khái niệm và phân loại nƣớc thải Nước là nguồn tài nguyên đặc biệt, không chất nào có thể thay thế được do vậy cần được sử dụng tiết kiệm, hợp lý. Tổng trữ lượng nước trên trái đất vào khoảng 1.386 triệu km3 [6], nhưng nước ngọt và nước sạch dùng cho con người thì có hạn vì sự tái tạo lại dường như phân bố không đều và không kịp cho nhu cầu sử dụng. Nước ngọt chỉ chiếm khoảng 2,7% tổng lượng nước trên trái đất; trong đó nằm dạng băng 77,22%, nước ngầm 22,42%, hồ đầm 0,35%, sống suối 0,01% lượng nước ngọt. Nguồn nước ngầm thường có xu hướng giảm do khai thác nhiều mà không được bổ sung kịp thời [7]. Do vậy việc tái sử dụng nước thải sao cho an toàn là một vấn đề cấp thiết đang được quan tâm. Theo Tilley và các cộng sự nước thải được định nghĩa là nước mà chất lượng đã bị ảnh hưởng xấu bởi các tác động của con người. Nước thải là bao gồm chất thải dạng lỏng từ các hoạt động sinh hoạt, công nghiệp, thương mại, nông nghiệp và cả nước mưa khi đổ vào hệ thống cống [8]. Người ta còn định nghĩa nước thải là chất lỏng được thải ra sau quá trình sử dụng của con người và đã bị thay đổi tính chất ban đầu của chúng. Thông thường nước thải được phân loại theo nguồn gốc phát sinh, đó cũng là cơ sở trong việclựa chọn các biện pháp giải quyết hoặc công nghệ xử lý [9]. Hệ thống nước thải phổ biến nhất được chia làm năm loại. Đầu tiên là nước thải sinh hoạt: bắt nguồn từ các khu dân cư, khu vực hoạt động thươngmại, khu vực công sở, trường học và các cơ sở tương tự khác. Tiếp đó là nước thải công nghiệp (hay còn gọi là nước thải sản xuất): từ các nhà máy đang hoạt động hoặc trong đó nước thải công nghiệp là chủ yếu. Thứ ba là nước thấm qua: là lượng nước thấm vào hệ thống ống bằng nhiều cách khác nhau, qua các khớp nối, các đường ống rò rỉ hoặc thành hố ga. Thứ tư là nước thải tự nhiên: nước mưa được xem như nước thải tự nhiên ở những thành phố hiện đại, được thu gom theo hệ thống riêng. Cuối cùng là nước thải đô thị: là một thuật ngữ chung chỉ chất lỏng trong hệ thống cống thoát của một thành phố, thị 8 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo xã; đó là hỗn hợp của các loại trên. Nước thải bệnh viện được xếp loại vào nước thải sinh hoạt nhưng có sự khác biệt là có chứa các tác nhân gây bệnh ở nồng độ cao. 1.1.2. Thực trạng xử lý nƣớc thải ở các bệnh viện và trung tâm thu nhận bệnh nhân hiện nay Nước thải sinh hoạt hàng ngày và nước thải y tế từ các bệnh viện, cơ sở tiếp nhận người mắc bệnh truyền nhiễm, thường chứa nhiều các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với sức khỏe con người. Các tác nhân này bao gồm các vi sinh vật gây bệnh khác nhau được thống kê trong Bảng 1 [10-13]. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau lại yêu cầu các phương pháp xử lý khác nhau. Mặc dù ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các chất hóa học, do khả năng lây lan các tác nhân sinh học có thể gây ra bệnh truyền nhiễm và tiềm tàng khả năng phát triển thành dịch. Nhiều tác nhân sinh học không tồn tại được lâu trong môi trường và có thể bị tiêu diệt khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Tuy nhiên, có một số vi khuẩn, virus vẫn có thể tồn tại trong điều kiện bất lợi và phát tán khi thải trực tiếp ra ngoài môi trường. Thậm chí chúng có thể phát tán từ trong quá trình đi qua các hệ thống thu gom nước thải khi xảy ra hiện tượng tràn cống. Do vậy việc xử lý nước thải y tế trước khi nhập vào hệ thống xử lý nước thải chung hoặc đưa ra môi trường là bắt buộc. Tuy nhiên theo một điều tra mới đây của Bộ Y tế chỉ 54% số bệnh viện ở nước ta có hệ thống xử lý nước thải. Trong số này lại có một số hệ thống đã sử dụng trong thời gian dài và hoạt động không còn hiệu quả, hoặc ở nhiều bệnh viện do chi phí duy trì vận hành cao nên hệ thống xử lý nước không hoạt động thường xuyên. Chính điều này đã góp phần phát tán các chất độc hại sử dụng trong y tế và các tác nhân gây bệnh ra ngoài môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào việc xử lý tác nhân gây bệnh lao mà cụ thể là vi khuẩn lao có trong nước thải, nhằm ngăn chặn sự lây lan bệnh. 9 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Bảng 1.1: Một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm có mặt trong nước thải. Tác nhân sinh học Bệnh gây ra Thời gian tồn tại Escherichia coli Viêm dạ dày ruột 42 ngày Xoắn khuẩn Bệnh truyền Có thể tồn tại lâu dài Leptospira nhiễm cấp tính trong điều kiện thích Leptospirosis hợp nhưng không phân Vi khuẩn chia. Salmonella Bệnh thương hàn 56 ngày ở dạng tự do Nhiễm khuẩn và có thể tồn tại lâu dài đường ruột khi hình thành biofilm Shigella Kiết lỵ 56 ngày Vibrio cholerae Bệnh tả 700 ngày Enterovirus (72 Viêm dạ dày 35 ngày tùy theo nhiệt loại, ví dụ, ruột,dị tật độ và độ ẩm virusbại liệt, tim,viêm màng virus coxsackie) não Virus viêm gan Viêm gan A Virus A (Hepatitis A 30 ngày trong chất thải động vật, nước thải virus) 1.1.3. Các phƣơng pháp xử lý vi sinh vật trong nƣớc thải Trên thế giới và ở Việt Nam có nhiều phương pháp được đưa ra nhằm xử lý tác nhân gây bệnh trong nước thải. Các phương pháp này có thể được chia thành 3 nhóm: vật lý, hóa học và sinh học với những ưu nhược điểm riêng.Trong đó, nhóm các phương pháp vật lý và hóa học được sử dụng phổ biến nhất. 10 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 1.1.3.1. Phƣơng pháp vật lý Phương pháp vật lý xử lý vi sinh vật hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng hệ thống chiếu tia cực tím (UV) tác động tới vật liệu di truyền của sinh vật (ADN và ARN). Bức xạ UV khi thâm nhập vào các tế bào của một sinh vật, sẽ phá hủy khả năng tái tạo của tế bào. Hiệu quả của một hệ thống khử trùng UV phụ thuộc vào các đặc tính của nước thải, cường độ bức xạ UV, lượng thời gian vi sinh vật tiếp xúc với bức xạ, và cấu trúc lò phản ứng. Sử dụng hệ thống khử trùng bằng tia cực tím có một số ưu điểm như có hiệu quả bất hoạt hầu hết các virus, bào tử, sau xử lý không sinh ra các hóa chất độc hại và quá trình này không gây ăn mòn hệ thống ống dẫn nước thải, đồng thời diễn ra trong thời gian ngắn (khoảng 20-30 giây với đèn áp thấp). Tuy vậy phương pháp này có một số nhược điểm như phụ thuộc độ đục và tổng chất rắn lơ lửng trong nước thải có thể làm giảm hiệu quả khử trùng. Ngoài ra các sinh vật đôi khi có thể sửa chữa và đảo ngược lại những tác động của tia cực tím thông qua "cơ chế sửa chữa". Hệ thống phải được bảo trì thường xuyên để tránh tắc nghẽn ống dẫn đến chi phí lắp đặt và vận hành hệ thống tốn kém [14]. Hình 1.1: Sử dụng màng lọc để bắt giữ vi khuẩn trong nước thải. (Nguồn: eawag.ch) 11 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Một phương pháp vật lý đang được áp dụng ở một số nước phát triển hiện nay là sử dụng hệ thống các màng lọc vi khuẩn. Tuy vậy việc liên tục thay, bỏ màng lọc cũng yêu cầu chi phí cao, đối với loại màng lọc có thể tái sử dụng lại yêu cầu được xử lý bởi các nhân viên có tay nghề cao để tránh tái nhiễm vi khuẩn vào nước. 1.1.3.2. Phƣơng pháp hóa học Phương pháp xử lý vi sinh vật trong nước thải phổ biến nhất hiện này chính là sử dụng clo oxi hóa tế bào vi khuẩn. Ở bất cứ dạng nào, nguyên chất hay hợp chất, khi clo tác dụng với nước đều sinh ra các phân tử axit hypoclorit (HClO), một hợp chất có khả năng khử trùng rất mạnh. HClO không phân ly là thành phần khử trùng chính trong nước, thành phần này chỉ có giá trị cao ở pH thấp, điều đó cũng nói lên rằng quá trình dùng clo để khử trùng trong nước chỉ có được hiệu quả cao khi tiến hành ở pH thấp. Tốc độ quá trình khử trùng còn phụ thuộc vào cả hàm lượng các chất hữu cơ, các cặn lơ lửng và các chất khử khác. Khi trong nước có hàm lượng cao của các chất này thì tốc độ quá trình khử trùng sẽ giảm đi đáng kể. Phương pháp sử dụng clo khử trùng có một số ưu điểm như dễ sử dụng, có thể áp dụng ở nhiều nơi, độ tin cậy cao và có khả năng tiêu diệt một dải rộng các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm. Tuy vậy phương pháp này còn tồn tại các nhược điểm sau. Dư lượng clo trong nước ngay cả ở nồng độ thấp vẫn gây hại tới các sinh vật thủy sinh khi thải ra ngoài môi trường. Clo là một chất ăn mòn mạnh và gây độc, do vậy trong quá trình bảo quản, vận chuyển và sử dụng đều đòi hỏi nhân viên có tay nghề cao thực hiện. Clo còn có thể phản ứng với một số hợp chất hữu cơ trong nước sinh ra các chất độc hại (ví dụ: Trihalomethanes) [15]. Một phương pháp hóa học khác cũng được sử dụng phổ biến ở châu âu và ở một vài tiểu bang ở Mỹ là sử dụng khí ôzôn. Khí ôzon được tạo ra bằng cách sử dụng nguồn điện cao thế tách ôxy phân tử (O2) thành ôxy nguyên tử (O), sau đó lại cho ôxy nguyên tử tiếp xúc với oxi phân tử tạo thành ôzôn (O3). Khí ôzon phải được tạo ra ngay tại các điểm xử lý nước thải do tính chất không bền và nhanh chóng phân giải về dạng oxy phân tử. Ôzôn là một chất oxy hóa mạnh, có khả năng khử trùng cao. Ôzôn tác động trực tiếp, oxi hóa thành tế bào vi khuẩn, đồng thời gây thiệt hại lên các thành phần của 12 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo axit nucleic (purin và pyrimidin). Cơ chế chủ yếu của quá trình này xảy ra do khi ôzôn phân giải trong nước sẽ sinh ra các nhóm hydrogen peroxy (HO2) và hydroxyl (OH). Hiệu quả của quá trình khử trùng phụ thuộc vào các yếu tố như sự nhạy cảm của vi khuẩn, thời gian tiếp xúc và nồng độ ôzôn. Phương pháp sử dụng ôzôn có một số ưu điểm như sử dụng ôzon khử trùng cho hiệu quả tốt hơn clo, thời gian khử trùng ngắn (10-30 phút) đồng thời không tạo thành dư lượng hóa chất độc hại sau khử trùng. Mặc dù vậy phương pháp sử dụng ôzon vẫn không được sử dụng rộng rãi do việc lắp đặt hệ thống phức tạp. Do đặc tính oxy hóa cao gây ăn mòn đường ống dẫn nên chi phí bảo trì hệ thống khử trùng ôzon thường cao [16]. 1.1.3.3. Phƣơng pháp sinh học Các quá trình sinh học được ứng dụng trong xử lý nước thải hiện nay chủ yếu là để xử lý các chất thải hữu cơ, các hợp chất của nitơ và phốt pho. Sự tồn tại của các chất thải hữu cơ làm giảm độ hòa tan của oxi trong nước gây hại tới đời sống của các sinh vật thủy sinh do vậy cần phải được xử lý trước khi thải ra ngoài môi trường. Phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng vi sinh vật hiếu khí để loại bỏ các tạp chất hữu cơ này trong nước thải. Các vi sinh vật hiếu khí được nuôi và tạo thành màng trên các giá thể có trong các bồn sinh học hay các bể chứa nước thải. Các vi sinh vật này sẽ phân hủy các tạp chất hữu cơ bằng cách tiết ra enzyme phân hủy giúp loại bỏ các tạp chất này ra khỏi nước thải. Một nghiên cứu gần đây nhất được thực hiện tại Việt Nam cho thấy sự hiệu quả của vi khuẩn khi tạo thành màng biofilm có khả năng phân hủy một phổ rộng các chất hữu cơ bao gồm L-arginine, gelatin, D-glucose, Dmannose v.v. Nghiên cứu này mở ra một triển vọng ứng dụng các loại vi sinh vật sẵn có trong tự nhiên trong quá trình xử lý nước thải [1]. Tuy được ứng dụng hết sức hiệu quả nhưng cho đến nay phương pháp sinh học vẫn chưa được sử dụng nhiều để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh có trong nước thải.Một phương pháp sinh học từng được nghiên cứu trước đây là sử dụng vi khuẩn hiếu khí gram âm Bdellovibrio bacteriovorus có khả năng tồn tại trong nước thải [17]. Vi 13 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo khuẩn này bám vào màng tế bào của các vi khuẩn gram âm tiết ra enzyme phân hủy màng tế bào, đi qua màng plasma rồi sửa chữa lại màng tế bào của vật chủ. Sau đó Bdellovibrio bacteriovorus sẽ tiết ra các enzyme thủy phân vào trong tế bào chất của vật chủ nhằm sản xuất các chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng. Khi đã hấp thu đầy dủ dinh dưỡng từ tế bào chất, vi khuẩn bắt đầu tiến hành phân chia rồi cuối cùng phá vỡ tế bào vật chủ và thoát ra ngoài [18] Chu trình này được thể hiện như Hình 1.2. Hình 1.2: Chu trình phát triển của Bdellovibrio bacteriovorus Phương pháp sinh học này có những ưu điểm như không phải xây dựng hệ thống xử lý phức tạp, không sử dụng hóa chất độc hại. Tuy vậy nhược điểm làm giảm tính ứng dụng của phương pháp là Bdellovibrio bacteriovorus chỉ có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram âm.[19,20] Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển xa hơn tiến tới tiêu diệt các tác nhân gây bệnh trước tiên là vi khuẩn lao sau khi bắt giữ bằng cách bổ sung các phức hệ ly giải có gắn enzyme. Đáng chú ý là trong năm 2015, nhóm nghiên cứu Chử Lương Luân và các cộng sự đã tạo được phức hệ hạt từ kháng thể kháng lao. Như vậy theo nguyên lý này những phức hệ tương tự có thể được tổng hợp. Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn 14 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo lao vì các lý do bệnh lý học và dịch tễ học của bệnh lao và bởi bản thân vi khuẩn lao là một vi khuẩn nguy hiểm có khả năng lây nhiễm và khả năng sống sót cao ngoài môi trường. 1.2. Bệnh lao Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm chết người phổ biến gây ra bởi các chủng khác nhau của mycobacteria, thường là Mycobacterium tuberculosis. Bệnh lao đã có mặt trong xã hội loài người từ thời cổ đại. Trong suốt lịch sử, bệnh lao đã được biết đến dưới nhiều tên gọi khác nhau như: bệnh ho lao, bệnh Pott, và bệnh dịch trắng. Bệnh lao đạt tỷ lệ dịch bệnh cao nhất ở châu Âu và Bắc Mỹ trong thế kỷ 18 và 19. 1.2.1. Bệnh lý học Bệnh lao phổ biến nhất là lao phổi, tuy nhiên trong 15-20% các trường hợp nhiễm lao, nhiễm trùng lây lan ra bên ngoài cơ quan hô hấp, gây ra bệnh lao trên các phần khác của cơ thể [21]. Những trường hợp mắc bệnh như vậy được gọi chung là "bệnh lao ngoài phổi". Lao ngoài phổi xảy ra phổ biến hơn ở những người suy giảm miễn dịch và trẻ em. Trong những người có HIV, điều này xảy ra trong hơn 50% các trường hợp. Bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS, với 90% bệnh nhân HIV/AIDS sẽ tử vong trong vòng vài tháng bị đồng nhiễm lao nếu không được chữa trị kịp thời [22]. Lao ngoài phổi bao gồm một số trường hợp như lao màng não, lao bạch huyết (trong bệnh tràng nhạc cổ ), lao niệu sinh dục, và lao xương và khớp (bệnh của cột sống của Pott). Khi đã vào tới phổi, vi khuẩn bị đại thực bào tấn công, và các nốt nhỏ được hình thành thông qua phản ứng quá mẫn gọi là nốt sần. Quá trình bệnh thường chỉ dừng lại ở giai đoạn này, nhưng vi khuẩn thường vẫn tồn tại trong các thể thực bào của đại thực bào (macrophage phagosome). Kháng lại quá trình oxy hóa, ức chế sự thực bào của lysosome, và ức chế sự khuếch tán của các enzyme trong lysosome là một số trong những cơ chế có thể giải thích sự tồn tại của vi khuẩn lao bên trong đại thực bào. Trong thời gian này các nốt sần có thể thay đổi thành dạng nhầy được gọi là một tổn thương caseous. Nếu tổn thương được phân loại, chúng được gọi là phức hợp 15 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo Ghon, phức hệ này có thể quan sát được dễ dàng khi chụp x-quang phổi. Thường thì các tổn thương chính được gọi là nốt sần Ghon hoặc điểm tập trung Ghon. Các tổn thương chính thường nằm ở phần trên của thùy dưới hoặc phần dưới của thùy trên [23]. Những người tiếp xúc thường xuyên với bệnh nhân lao trong thời gian dài có khả năng lây nhiễm cao hơn 22% so với những người khác [24]. Một người mắc lao đã phát triển thành bệnh nhưng không được điều trị có thể lây cho 10-15 người (có thể nhiều hơn) mỗi năm. Sự lây nhiễm chỉ xảy ra ở những người bị nhiễm lao hoạt động đã phát triển thành bệnh (không phải lao tiềm ẩn), phụ thuộc vào mức độ nhiễm lao, phơi nhiễm với môi trường, thời gian tiếp xúc, và độc lực của các chủng vi khuẩn. Thông thường phải mất 3-4 tuần trước khi những người mới nhiễm lao có thể lây truyền bệnh cho người khác [25]. Chuỗi lây truyền có thể được ngừng lại bằng cách cách ly các bệnh nhân trong giai đoạn hoạt động của bệnh và áp dụng điều trị hiệu quả. 1.2.2. Dịch tễ học Ngày nay, bệnh lao là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất, ảnh hưởng đến khoảng 2- 3 tỷ người (tức là 1/3 dân số thế giới trong năm 2015), với 10 triệu trường hợp mới được chẩn đoán mỗi năm. Số lượng tuyệt đối của các trường hợp bệnh lao đã được giảm từ năm 2006, và các trường hợp mắc mới đã giảm kể từ năm 2002. Tuy nhiên sự phân bố của bệnh lao không thống nhất trên toàn cầu; khoảng 80% dân số ở nhiều nước châu Á và châu Phi xét nghiệm dương tính trong các xét nghiệm tuberculin trong khi đó chỉ có 5-10% dân số Hoa Kỳ cho kết quả tương tự [2]. Lao là bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao thứ hai trên thế giới gây ra 2 triệu ca tử vong trong năm 2010, chủ yếu ở các nước đang phát triển. Theo báo cáo WHO năm 2015 Việt Nam xếp thứ 14 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất trên thế giới, với khảng 104.000 ca mỗi năm và ước tính khoảng 56% dân số nước ta đã bị nhiễm vi khuẩn lao [4]. Vi khuẩn lao có thể nhập vào cơ thể nếu chúng ta ăn thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn. Vi khuẩn cũng lây truyền qua các vết cắt hoặc vết trầy xước trên da hoặc niêm mạc mắt và cổ họng và từ mẹ sang thai nhi thông qua các tĩnh mạch rốn gây bệnh lao bẩm 16 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo sinh. Tuy nhiên, thông thường, lao lây truyền qua đường hô hấp (hình 1.3). Khi những người mắc lao phổi hắt hơi, nói chuyện, hay khạc nhổ, họ phát tán ra các giọt đường kính 0,5-5,0 mm, và trong không khí bình thường chúng có thể được giữ trong khoảng thời gian kéo dài và lây lan cho những người khỏe mạnh trong cùng một phòng hoặc trong cùng tòa nhà. Một cái hắt hơi duy nhất có thể giải phóng tới 40.000 giọt, mỗi giọt đều có thể lây truyền bệnh. Người khỏe mạnh hít vào ít hơn 10 vi khuẩn cũng có khả năng bị nhiễm bệnh [26]. Hình 1.3: Con đường lây nhiễm chính bệnh lao Nguồn http: //www.slideshare.net/Hamdi0Alturkey/pulmonary-tuberculosis-34642377 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao Một yếu tố quan trọng góp phần trong sự lây lan của bệnh lao là khả năng tồn tại của vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn lao có thể chịu được các chất khử trùng yếu và có thể tồn tại trong trạng thái khô trong nhiều tuần. Một nghiên cứu mới đây được thực hiện ở Michigan Hoa Kỳ cho thấy vi khuẩn lao có khả năng sống sót cao trong môi trường. Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lên đến 88 ngày trong đất (74 ngày trong một nghiên cứu trước đó) , 58 ngày trong nước và cỏ khô, và 43 ngày trên ngô [27]. Tuy 17 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo vậy khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong môi trường ngắn hơn đáng kể trong mùa xuân / hè, bởi đây là thời gian có nhiệt độ trung bình hàng ngày cao nhất trong thời gian 12 tháng của năm. Các nghiên cứu chứng minh rằng vi khuẩn lao tồn tại đủ lâu trong môi trường để lây nhiễm và truyền bệnh sang người và động vật. 1.3. Vi khuẩn lao 1.3.1.Đặc điểm của vi khuẩn lao Đã hơn 140 năm kể từ khi chủng Mycobacterium đầu tiên được phân lập bởi Hansen (1874). Đó là vi khuẩn bệnh phong, Mycobacterium leprae, cho đến tận ngày nay vi khuẩn này vẫn còn chống lại tất cả nỗ lực để nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB) được phát hiện tám năm sau đó vào năm 1882 bởi Robert Koch, người sau đó đã nhận được giải thưởng Nobel về sinh lý học hay y học cho khám phá này vào năm 1905; để tưởng nhớ, vi khuẩn lao còn được gọi là "vi khuẩn Koch". [28] Phát hiện Kock đã được khẳng định bởi phương pháp nhuộm hiệu quả hơn của Ehrlich (1887) và Ziehl-Neelsen (1883). Dưới kính hiển vi trường sáng, vi khuẩn lao thường xuất hiện có dạng que thẳng hoặc hơi cong. Dựa theo các điều kiện tăng trưởng và thời gian nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi kích thước và hình dạng từ bầu dục đến dạng gậy dài. Các kích thước của vi khuẩn đã được báo cáo là 1-10 µm chiều dài (thường là 3-5 µm), và 0,20,6 µm chiều rộng. Khả năng biến đổi hình thái của vi khuẩn đã được đề xuất bởi một vài nghiên cứu như Malassez và Vignal (1883), Lubarsch (1899), Fischel (1893), và Vera và Rettger (1939) tuy nhiên vì những giới hạn về kỹ thuật khi đó vẫn diễn ra nhiều tranh cãi về hình dạng vi khuẩn. Ngày nay với những tiến bộ trong kỹ thuật hiển vi bao gồm kính hiển vi điện tử quét (SEM), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), phần lớn các nhà nghiên cứu đã đồng ý rằng vi khuẩn lao biểu hiện nhiều hình dạng trong điều kiện khác nhau [29]. Vi khuẩn trở nên ngắn hơn ở các môi trường nuối cấy cũ lâu ngày, dạng sợi bên trong đại thực bào và có hình trứng trong điều kiện thiếu dinh dưỡng. Tuy nhiên, hình dạng que vẫn là hình thái cổ điển cơ bản của vi khuẩn lao (Hình 1.4). 18