Tài liệu Xây dựng và đánh giá quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --------------- VÕ THỊ MINH THƢƠNG XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO C C R UT.L D Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 60.54.01.01 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng, Năm 2020 Công trình đƣợc hoàn thành tại TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Mạc Thị Hà Thanh Phản biện 1: TS. Nguyễn Thị Đông Phương Phản biện 2: TS. Đỗ Chí Thịnh C C R UT.L D Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, họp tại Đại học Bách khoa vào ngày 26 tháng 12 năm 2020 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Học liệu và Truyền thông trường Đại học Bách khoa Đại học Đà Nẵng - Thư viện Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài Trên thị trường hiện nay, thực phẩm có sử dụng phụ gia làm chất bảo quản chiếm tỷ lệ lớn, việc sử dụng chất bảo quản có thể ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lượng quy định. Tác hại do sử dụng chất bảo quản sai quy định có thể ảnh hưởng đối với sức khỏe con người. Những tác động này thường không xảy ra cấp tính, rầm rộ và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Có rất nhiều loại hợp chất bảo quản được sử dụng như axit benzoic; natri benzoat và các loại benzoat thay thế (kali benzoatvà canxi benzoat); kali sorbat; natri metabisulfite; natri sulfite.... C C R UT.L Trong số đó nhóm benzoat và sorbat là những chất bảo quản được phép sử dụng rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm với một giới hạn D nhất định. Tuy nhiên, việc lạm dụng quá mức cho phép hai nhóm chất bảo quản này sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), liều lượng natri benzoat tối đa mà cơ thể có thể xử lý được là 5 mg/kg thể trọng mỗi ngày.Liều lượng gây độc ở người là 6 mg/kg thể trọng. Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu (EFSA) khuyến cáo lượng tiêu thụ kali sorbat an toàn với con người là dưới 25 mg/kg trọng lượng mỗi ngày [1]. Hiện nay, việc kiểm tra các chất bảo quản trong thực phẩm là một trong những nội dung của công tác kiểm tra, giám sát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam nói chung cũng như Quảng Ngãi nói riêng. Cho đến nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm, bao gồm các 2 phương pháp xác định riêng từng chất bảo quản và các phương pháp xác định đồng thời các chất bảo quản: phương pháp chuẩn độ [2], phương pháp sắc ký lớp mỏng [3], phương pháp quang phổ [4], và sắc ký lỏng hiệu năng cao [5, 6]. Do vậy, việc các phòng thí nghiệm cần nghiên cứu xây dụng quy trình phân tích góp phần vào việc giám sát chất lượng thực phẩm là rất cần thiết. Việc kiểm tra các chất bảo quản nhóm benzoat và sorbat trong thực phẩm thường được tiến hành bằng các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, các phương pháp xác định đồng thời hai nhóm chất bảo quản này chỉ là phương pháp nội bộ của một số phòng thí nghiệm. Cho đến nay, hệ thống TCVN chỉ xây dựng và ban hành phương pháp xác định đồng thời hai chất bảo quản này trong từng nền mẫu C C R UT.L riêng lẻ. Bản thân những phương pháp này mới chỉ đáp ứng một phần nhỏ yêu cầu về mặt kỹ thuật, nếu muốn triển khai áp dụng tại D đơn vị cần phải được đánh giá thực nghiệm về sự phù hợp của phương pháp khi áp dụng trong toàn nền mẫu thực phẩm cũng như điều kiện thực tế của đơn vị. Vì vậy, lựa chọn một quy trình phân tích phù hợp với điều kiện tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Quảng Ngãi để xác định đồng thời các chất bảo quản nhóm benzoat và sorbat trong thực phẩm lưu thông trên thị trường là yêu cầu xuất phát từ thực tiễn. Qua các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, để định lượng đồng thời benzoat và sorbat trong thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có nhiều ưu điểm vượt trội. Phương pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao, thao tác đơn giản. Trong đề tài này chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để nghiên cứu. 3 Hơn nữa công tác quản lý, giám sát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn tỉnh năm 2018 như sau: - Công tác giám sát mối nguy và hậu kiểm: Số mẫu lấy kiểm tra là 186, trong đó 18 mẫu chả thịt, 08 mẫu chả cá, 02 mẫu bánh tráng mỏng, 04 mẫu hủ tiếu sợi…. Kết quả 11 mẫu chả thịt có sử dụng chất bảo quản nhưng không công bố chất lượng sản phẩm, 01 mẫu chả tự công bố chất bảo quản Natri bezoat nhưng vượt quy định, 04 mẫu hủ tiếu sợi sử sụng chất bảo quản nhưng chưa công bố sản phẩm [7]. - Năm 2018, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Quảng Ngãi,áp dụng quy trình định lượng riêng chất bảo quản natri benzoat trong 50 mẫu thực phẩm trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi C C R UT.L (gồm sản phẩm chả các loại, cá bống đã chế biến, thịt bò khô, sợi hủ tiếu), kết quả có 46/50 mẫu phát hiện có sử dụng chất bảo quản natri D benzoat (chiếm 92% ), trong đó 10/50 mẫu (chiếm 20%) có hàm lượng vượt giới hạn cho phép. Vấn đề đặt ra cần có những công cụ kỹ thuật thuận lợi góp phần vào việc đánh giá tình trạng sử dụng benzoat và sorbat làm chất bảo quản trong thực phẩm nhằm cung cấp số liệu cơ bản cho các cơ quan chức năng để thực hiện tốt công tác giám sát chất lượng thực phẩm trên địa bàn tỉnh nhà. Vì lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng và đánh giá quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm có độ chính xác cao 4 - Đánh giá quy trình phân tích đã được xây dựng (theo tiêu chuẩn AOAC về thầm định phương pháp phân tích); từ đó, ứng dụng vào việc xác định hàm lượng benzoat và sorbat trong một số sản phẩm thực phẩm. 3. Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu Các thông số đặc trưng của phương pháp HPLC: Hệ số đối xứng, hệ số phân giải, cột phân tích, bước sóng, tốc độ dòng, thành phần và tỷ lệ pha động. - Các dung dịch chuẩn natri benzoat và kali sorbat được bảo quản theo thời gian. C C R UT.L - Mẫu thực phẩm phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm: D + 5 nền mẫu tự tạo dùng để xây dựng và thẩm định quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm (được đặt mua theo yêu cầu và được kiểm chứng tại phòng thí nghiệm không có chất benzoat và sorbat) được bổ sung chính xác 1 lượng chất chuẩn natri benzoat và kali sorbat: Thực phẩm nhóm lỏng (N1): Nước yến Thực phẩm nhóm giàu đường (N2): Bánh Thực phẩm nhóm giàu chất xơ (N3): Quả sấy khô Thực phẩm nhóm giàu protein, (N4): Chả thịt heo Thực phẩm nhóm giàu béo, (N5): Phô mai 5 + Các sản phẩm thực phẩm được mua tại các cơ sở buôn bán trên địa bàn thành phố Quảng Ngãi (thông tin chi tiết về các mẫu thực phẩm xem tại phụ lục 6).  Phạm vi nghiên cứu - Xây dựng quy trình phân tích được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi. - Phân tích một số thực phẩm được lấy tại thành phố Quảng Ngãi từ tháng 1/2020 đến tháng 5/2020. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu C C R UT.L - Xác định benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC. D - Đánh giá năng lực của quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm theo tiêu chuẩn ARL 05 và tiêu chuẩn AOAC. - Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm xử lý số liệu modde 5.0, minitab 17 (hãng Minitab Inc) và các bảng tính bằng excel 2010 (của Microsoft). 5. ngh  ho học và thực ti n c đề tài nghiên cứu nghĩa khoa học - Đóng góp vào kho tài liệu thông tin khoa học về công cụ phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm. - Xây dựng hướng dẫn nội bộ về quy trình phân tích các chất bảo quản nhóm benzoat và sorbat trong thực phẩm áp dụng tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi. 6  nghĩa thực tiễn của đề tài - Đối với cơ quan quản lý nhà nước, sản phẩm của đề tài là cơ sở tham khảo để phục vụ công tác quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn tỉnh. - Đưa ra được hạn dùng của các dung dịch chuẩn; từ đó mang lại lợi ích kinh tế cho các đơn vị sử dụng quy trình phân tích đã được xây dựng. 6. Bố cục c a luận văn Luận văn gồm những chương mục sau: Đặt vấn đề C C R UT.L Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu D Chương 3: Kết quả và thảo luận Kết luận Kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục 7 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1. MỘT SỐ QUY ĐỊNH LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM Năm 2010, Bộ Y tế ban hành quy chuẩn quốc gia (QCVN 412:2010/BYT) về phụ gia thực phẩm – chất bảo quản, quy định các yêu cầu kỹ thuật và quản lý về chất lượng, vệ sinh an toàn đối với các chất bảo quản được sử dụng với mục đích làm phụ gia thực phẩm [8]. Thông tư 05/2018/TT-BYT ngày 05 tháng 04 năm 2018 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục thực phẩm, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm và dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa C C R UT.L đựng thực phẩm được xác định mã số hàng hóa theo danh mục hàng hóa xuất khẩu, nhập khẩu Việt Nam [10]. D Thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 30/8/2019 của Bộ trưởng Bộ Y tế quy định về quản lý và sử dụng phụ gia thực phẩm ban hành [11]. 1.2. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM CHẤT BẢO QUẢN BENZOAT VÀ SORBAT 1.2.1. Nhóm Benzoat 1.2.2. Nhóm Sorbat 1.3. MỘT SỐ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN NHÓM BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM 1.3.1. Một số quy trình xác định benzoat và sorbat ở nước ngoài bằng kỹ thuật HPLC 8 1.3.2. Một số quy trình xác định benzoat và sorbat bằng kỹ thuật HPLC thường được áp dụng tại Việt Nam 1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC 1.4.1. Hệ thống bơm 1.4.2. Bộ phận tiêm mẫu 1.4.3. Cột phân tích (HPLC colum) chứa pha tĩnh 1.4.4. Pha động 1.4.5. Detector 1.4.6. Các thông số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao C C R UT.L 1.5. TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH D 1.5.1. Tính tương thích của hệ thống 1.5.2. Tính đặc hiệu (Specifility)/Tính chọn lọc 1.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 1.5.4. Độ đúng (Trueness) hay còn gọi là độ thu hồi 1.5.5. Độ chính xác (Precision) 1.5.6. Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD) 1.5.7. Giới hạn định lượng (Limit of Quatitation – LOQ) 1.5.8. Độ không đảm bảo 9 CHƢƠNG 2- ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, DUNG MÔI, HÓA CHẤT 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng quy trình phân tích định lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm: + Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình đã công bố + Lựa chọn, xây dựng điều kiện sắc ký + Xây dựng Quy trình xử lý mẫu C C R UT.L - Đánh giá năng lực quy trình phân tích: D + Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích o Tính tương thích hệ thống o Độ đặc hiệu o Tính tuyến tính o Độ chụm (độ lặp lại và độ tái lập) o Độ chính xác (độ thu hồi) o Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng o Ước lượng độ không đảm bảo đo + Đánh giá hạn dùng theo thời gian của dung dịch chuẩn natri benzoat và kali sorbat được chuẩn bị theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng. 10 + Ứng dụng quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm. 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Xây dựng quy trình phân tích định lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm 2.4.1.1. Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình xác định benzoat và sorbat trong thực phẩm đã công bố 2.4.1.2. Phương pháp xử lý mẫu 2.4.1.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định bƣớc sóng đo benzo t và sorb t C C R UT.L Bảng 2.1. Ma trận bố trí thí nghiệm 1 D Các yếu tố Pha động Điều kiện thí nghiệm - Thành phần pha động MeOH : Muối acetat - Tỷ lệ pha động 10 : 90 Bước sóng λ 1 = 227 nm; λ 1 = 250 nm Tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm 20 µl Đánh giá kết quả: Dựa vào kết quả sắc ký đồ của phổ UV-VIS, chọn bước sóng cho tín hiện rõ nhất, chiều cao tương đối lớn và có độ tinh khiết của píc phù hợp. 11 Thí nghiệm 2: Lựa chọn cột sắc ký Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm 2 Điều kiện thí nghiệm Các yếu tố Loại cột Khảo sát trên 9 cột, bản chất cột chứa Octadecyl Silane hoặc Octyl Silane, chiều dài cột và các hãng sản xuất cột khác nhau Pha động - Thành phần MeOH : Muối acetat - Tỷ lệ (v/v) 10 : 90 Tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm C C R UT.L D Bước sóng 20 µl Chọn từ kết quả của thí nghiệm 1 Đánh giá kết quả: Đánh giá hệ số đối xứng và hệ số phân giải của píc benzoat và sorbat, thời gian lưu của hai pic chính, lựa chọn cột phân tích phù hợp. Thí nghiệm 3: Xác định thành phần, nồng độ muối amoni acetat trong ph động và tỷ lệ ph động Bảng 2.3. Ma trận bố trí thí nghiệm 3 Các yếu tố Thành phần pha động gồm (MeOH – Dung dịch amoni Điều kiện thí nghiệm 12 acetat xM) - Nồng độ dung dịch amoni 0,005M; 0,01M; 0,02M; 0,03M acetat xM - Tỷ lệ pha động (v/v) (20 : 80); (10 : 90); (7 : 93); (5 : 95) Tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ cột 300C Thể tích tiêm 20 µl Bước sóng Từ kết quả của thí nghiệm 1 Cột sắc ký Từ kết quả của thí nghiệm 2 C C R UT.L Kết quả: Dựa vào kết quả sắc ký đồ để đánh giá hệ số đối xứng, hệ số phân giải, thời gian lưu của hai pic chính benzoat và sorbat, lựa D chọn nồng độ muối của dung dịch và tỷ lệ thích hợp. Thí nghiệm 4: Xác định tốc độ dòng Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện xử lý mẫu thử thực phẩm 2.4.2. Đánh giá năng lực quy trình phân tích đã xây dựng 2.4.2.1. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích đã xây dựng 2.4.2.2. Xác định hạn dùng của dung dịch chuẩn benzoat và sorbat 13 Điều kiện thí nghiệm Các yếu tố Nhóm số liệu 1: Nồng độ benzoat: 9,4µg/ml; Hàm lượng benzoat tính 18,96µg/ml; 28,45µg/ml; 37,93µg/ml; theo chuẩn cũ 94,82µg/ml Hàm lượng Sorbat tính Nồng độ sorbat: 10,29 µg/ml; 20,58 µg/ml; 30,87 µg/ml; 41,16 µg/ml; theo chuẩn cũ 102,9 µg/ml Nhóm số liệu 2: Hàm lượng benzoat tính theo chuẩn mới Nồng độ natri benzoat 50 µg/ml Kali sorbat 97 µg/ml C C R UT.L Hàm lượng Sorbat tính theo chuẩn mới D Thời gian khảo sát Quy trình xử lý mẫu Tháng 4/2020 – 6/2020 Theo kết quả quy trình xử lý mẫu đã được xây dựng Điều kiện sắc ký Theo kết quả điều kiện sắc ký đã được xây dựng Đánh giá kết quả: - Dựa vào diện tích píc của dung dịch chuẩn và dung dịch thử xác định hàm lượng natri benzoat và kali sorbat. - Đánh giá sự khác biệt của hai phương pháp này có ý nghĩa hay không, ở mức ý nghĩa α = 5% thông qua hai dãy số liệu về về hàm lượng natri benzoat và kali sorbat. 14 2.4.2.3. Ứng dụng quy trình phân tích đã được xây dựng để phân tích mẫu thực phẩm mua ngoài thị trường 2.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsolt Excell. - Số liệu thực nghiệm trong nội dung xác định quy trình xử lý mẫu được phân tích bằng phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0. - Số liệu thực nghiệm tại kết quả xác định hạn dùng của các dung dịch chuẩn benzoat và sorbat được xử lý bằng phần mềm thống kê Minitab 17 C C R UT.L - Mức ý nghĩa α = 0,05 D 15 CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM 3.1.1. Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình xác định benzoat và sorbat trong thực phẩm đã được công bố Ba quy trình phân tích có điều kiện phân tích tương đối phù hợp với phòng thí nghiệm của đơn vị để khảo sát. Kết quả cho thấy: - Thời gian xuất hiện các pic chính nhanh, còn dính nhiều pic phụ khi phân tích trên nền mẫu thực phẩm. C C R UT.L - Tín hiệu pic không cân đối, chân píc bị kéo đuôi . - Bên cạnh đó đánh giá kết quả hệ số đối xứng Nhận xét D Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [25] và tiêu chuẩn AOAC [26], phép thử đạt yêu cầu khi kết quả về số đĩa lý thuyết ≥ 2000 và hệ số đối xứng (As) phải trong khoảng 0,8 ≤ As ≤ 1,2. Do vậy, ba quy trình phân tích trên chưa tương thích trong điều kiện của đơn vị khi phân tích đồng thời benzoat và sorbat trên nền mẫu thực phẩm. 3.1.2. Xây dựng các điều kiện sắc ký cho quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm 3.1.2.1. Xác định bước sóng phát hiện cho các chất phân tích với detector PDA 16 3.1.2.2. Ảnh hưởng cột sắc ký lỏng đến tín hiệu píc benzoat và sorbat Trong quá trình nghiên cứu và thực nghiệm lâu dài, có thể kết luận: Cột Purospher Star RP-8e (5μm; 250 x 4.6mm) thích hợp và khả năng đáp ứng pic, khả năng tách của cột tốt và được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo trong quy trình định lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm. 3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối, tỷ lệ pha động đến hệ số đối xứng và khả năng tách của píc benzoat và sorbat  Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4COOCH3 trong pha C C R UT.L động đến sự cân đối và khả năng tách của píc benzoat và sorbat Kết quả D - Thành phần pha động gồm muối CH3COONH4 0,02M – MeOH. - Điều này phù hợp với tính chất phân cực của benzoat và sorbat. - Muối CH3COONH4 0,02M có pH khoảng 7 nên rất ổn định khi chạy trên máy sắc ký lỏng. Kết luận: Pha động gồm dung dịch muối NH4COOCH3 0,02M MeOH là phù hợp để tiến hành phân tích định tính, định lượng benzoat và sorbat trong thực phẩm.  Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trong pha động đến sự cân đối và khả năng tách píc benzoat và sorbat 17 Kết luận: Thành phần pha động gồm NH4COOCH3 0,02M MeOH (93 : 7), (v/v) là phù hợp nhất để định tính, định lượng đồng thời benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC  Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến sự cân đối và khả năng tách píc benzoat và sorbat Kết quả lựa chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. Ở tốc độ 1,0 ml/phút thì các píc benzoat và sorbat có hệ số đối xứng 1,00 và 0,96 tốt nhất và đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [25] và tiêu chuẩn AOAC [26]. Thời gian lưu của các chất phân tích không quá dài, áp suất bơm cũng phù hợp cho quá trình chạy sắc ký. C C R UT.L Kết luận chung: Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện cho quá trình chạy sắc ký D HPLC để định lượng đồng thời nhóm benzoat và sorbat với đầu dò PDA như sau: - Cột tách: Purospher RP-8e (5μm; 250 x 4,6mm) - Hệ pha động: MeOH : NH4COOCH3 0,02M (7:93), (v/v) - Bước sóng: 230nm đối với benzoat và 250nm đối với sorbat - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 1,0ml/phút - Nhiệt độ cột: Lựa chọn 30oC 3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm dùng trong phân tích benzoat và sorbat 18 3.1.3.1. Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu của benzoat và sorbat trong mẫu tự tạo Kết quả điều kiện về tỷ lệ dung môi chiết xuất, thời gian và nhiệt độ thủy phân nhằm chiết xuất hàm lượng natri benzoat thu cao nhất - Tại giá trị X1 = 24,48 (Dung môi MeOH %) có nghĩa là dung môi chiết mẫu gồm MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v; - Giá trị X2 = 53,74 (Nhiệt độ chiết) được xác định là nhiệt độ thủy phân đạt 540C; - Giá trị X3 = 45,22 (thời gian chiết) được hiểu là thời gian siêu âm: 45 phút. C C R UT.L - Với các điều kiện trên hàm lượng natri benzoat được chiết xuất có tỷ lệ thu hồi 100,3%. Hàm lượng axit sorbic được chiết xuất có tỷ lệ thu hồi 100,0%. D Như vậy: Điều kiện phù hợp nhất để chiết xuất hàm lượng natri benzoat và axit sorbic cao nhất là MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v; Nhiệt độ siêu âm: 540C; Thời gian siêu âm: 45 phút. 3.1.3.2. Đánh giá quy trình xử lý mẫu được thiết lập Tỷ lệ thu hồi hàm lượng chuẩn natri benzoat trong mẫu tự tạo từ 98,9% đến 100,2% và tỷ lệ thu hồi axit sorbic từ 99,5 % đến 100,9%; điều này cho thấy hiệu suất chiết natri benzoat và axit sorbic trong mẫu thực phẩm là rất cao, thu hồi gần như hoàn toàn hàm lượng natri benzoat và axit sorbic chuẩn được thêm vào nễn mẫu thực phẩm. 3.2. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG NHÓM BENZOAT VÀ SORBAT