Tài liệu Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem 1mg

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THANH MINH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THANH MINH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện: Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và TĐSH – Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, em đã đƣợc các thầy, các cô luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em học tập trau dồi kiến thức. Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã có cơ hội vận dụng kiến thức cũng nhƣ đƣợc mở rộng vốn hiểu biết của mình để áp dụng cho công việc tƣơng lai. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, ngƣời đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo dục, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận. Em xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu đã cung cấp chất chuẩn, chế phẩm để em có thể thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân tích và tƣơng đƣơng sinh học – Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên Lê Thanh Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ASLEM ................................................................... 3 1.1.1. Hoạt chất Glycyl funtumin .............................................................. 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin ........................... 4 1.1.3. Các phƣơng pháp định lƣợng Glycyl funtumin .............................. 6 1.2. VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI............................................ 9 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ................... 10 1.3.1. Nguyên tắc và phân loại ................................................................ 10 1.3.2. Các thông số đặc trƣng.................................................................. 10 1.3.3. Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC .................................... 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 15 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ ................................................. 15 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 15 2.1.2. Dung môi, hóa chất ....................................................................... 15 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, máy móc........................................................... 15 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................ 16 2.2.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem bằng HPLC .............................................................................................. 16 2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem ...................................................................................................... 16 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 17 2.3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem bằng HPLC ............................................................................................. 17 2.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn kĩ thuật và phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem..................................................................... 18 2.3.3. Tính toán và xử lý số liệu.............................................................. 20 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ........................ 22 3.1. CHUẨN BỊ MẪU ................................................................................ 22 3.1.1. Mẫu chuẩn ..................................................................................... 22 3.1.2. Mẫu thử ......................................................................................... 22 3.2. LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .... 23 3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu......................................................... 23 3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký............................................................. 23 3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 25 3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống .............................................................. 25 3.3.2. Độ chọn lọc ................................................................................... 25 3.3.3. Độ tuyến tính ................................................................................. 27 3.3.4. Độ chính xác ................................................................................. 29 3.3.5. Độ đúng ......................................................................................... 32 3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg ........................................................... 34 3.4.1. Tính chất........................................................................................ 34 3.4.2. Định tính........................................................................................ 34 3.4.3. Độ đồng đều khối lƣợng................................................................ 35 3.4.4. Độ rã. ............................................................................................. 36 3.4.5. Độ đồng đều hàm lƣợng ................................................................ 36 3.4.6. Định lƣợng .................................................................................... 37 BÀN LUẬN .................................................................................................... 39 KẾT LUẬN .................................................................................................... 42 ĐỀ XUẤT ....................................................................................................... 43 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT C Nồng độ DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam IV GF Glycyl funtumin GF.HCl Glycyl funtumin hydroclorid HLTB Hàm lƣợng trung bình HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) KLTB Khối lƣợng trung bình MeOH Methanol MS Khối phổ (Mass spectrometry) PA Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis) r Hệ số tƣơng quan RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối S Diện tích pic SKĐ Sắc ký đồ STT Số thứ tự tR Thời gian lƣu tt/tt Thể tích/thể tích UV Tử ngoại (Ultraviolet) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống sắc ký. 25 3.2 Pha dãy chuẩn chạy độ tuyến tính. 27 3.3 Kết qủa khảo sát độ tuyến tính của GF.HCl. 28 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp. 30 3.5 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp. 31 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp. 33 3.7 Kết quả đánh giá độ đồng đều khối lƣợng. 35 3.8 Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lƣợng. 37 3.9 Kết quả định lƣợng GF.HCl trong viên Aslem. 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 3.1 Phổ hấp thụ UV của GF.HCl. 24 3.2 Kết quả khảo sát đánh giá độ chọn lọc. 26 3.3 Sắc ký đồ khảo sát độ tuyến tính. 28 3.4 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích và nồng độ GF.HCl. 29 Sắc ký đồ định tính. 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tổ chức Y tế Thế giới đã dự báo về mô hình bệnh tật trong thế kỷ 21, các bệnh không lây nhiễm trong đó có ung thƣ sẽ trở thành nhóm bệnh chủ yếu đe dọa đến sức khỏe con ngƣời, chiếm 54% nguyên nhân gây tử vong. Ở Việt Nam, theo nhận định của Bộ Y tế, các bệnh ung thƣ, tim mạch, tâm thần đang có nguy cơ tăng lên giống với các nƣớc công nghiệp phát triển. Theo số liệu thống kê qua ghi nhận ung thƣ tại Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, ƣớc tính mỗi năm ở nƣớc ta có khoảng 150.000 bệnh nhân ung thƣ mới mắc và 75.000 ngƣời chết vì ung thƣ, con số này có xu hƣớng ngày càng gia tăng [26]. Chính vì thế xu hƣớng nghiên cứu và sản xuất các thuốc điều trị và điều trị bổ trợ dành cho bệnh nhân ung thƣ đang ngày càng phát triển. Aslem (glycyl funtumin hydroclorid) là một thuốc kích thích miễn dịch [11] đƣợc nghiên cứu bởi Phó giáo sƣ Đào Kim Chi, Giáo sƣ Đặng Hanh Phức và cộng sự trong hơn 30 năm. Năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm Aslem ra đời tại Trung tâm Khoa học công nghệ Dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (Số đăng ký: VD-0105-06) và đƣợc chuyển giao cho công ty cổ phần Dƣợc phẩm Vĩnh Phúc sản xuất – là sản phẩm thuốc tiêm miễn dịch đầu tiên đƣợc sản xuất tại Việt Nam. Aslem có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch dùng để điều trị bổ trợ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thƣ phổi và ung thƣ vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng trƣớc và sau phẫu thuật [12]. Các nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của Aslem đã đƣợc thực hiện và cho kết quả hết sức khả quan [1], [20], [22], [25]. Để đáp ứng yêu cầu điều trị ngày một tăng cao, Phó giáo sƣ Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu tại trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nghiên cứu bào 2 chế thử nghiệm chế phẩm Aslem dƣới dạng viên ngậm dƣới lƣỡi (glycyl funtumin hydroclorid 1mg). Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở để định lƣợng nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem vẫn áp dụng phƣơng pháp đo quang bằng cách tạo cặp ion với heliantin [15]. Năm 2009, các tác giả [2] đã xây dựng thành công phƣơng pháp định lƣợng GF.HCl bằng HPLC. HPLC là một phƣơng pháp vừa có khả năng tách, định tính, định lƣợng đồng thời trong cùng một lần phân tích với độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác cao và đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến hiện nay. Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra chất lƣợng và hoàn thiện hồ sơ đăng ký thuốc cho viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg” với 2 mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng Glycyl funtumin hydroclorid trong viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem (glycyl funtumin hydroclorid 1mg). 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ASLEM 1.1.1. Hoạt chất Glycyl funtumin 1.1.1.1. Công thức cấu tạo O NH2 C C N H2 O H . HCl Hình 1.1- Công thức cấu tạo của Glycyl Funtumin Hydroclorid [11], [12] Công thức phân tử: C23H38O2N2.HCl Trọng lƣợng phân tử: 410,5 Da Tên khoa học: N- (aminoethanoyl)- 3- preganan- 20- on hydroclorid [12]. 1.1.1.2. Tính chất hóa lý Glycyl Funtumin bản chất là một aminoacyl steroid, đƣợc tổng hợp dƣới dạng muối với HCl hoặc HBr. - Tính chất vật lý: + Bột kết tinh màu trắng, vị hơi đắng và chát nhẹ. + Bị phân hủy ở nhiệt độ 220-230°C. + Dễ tan trong nƣớc nóng và methanol, tan trong cloroform, khó tan trong nƣớc nguội. + Năng suất quay cực: dung dịch 0,5% trong MeOH ở 25°C có [α]D = 8898°. - Tính chất hóa học: 4 + GF có tính chất hóa học của một amin, tham gia phản ứng tạo muối với các acid nhƣ HCl, HBr (dạng dƣợc dụng là GF. HCl); tham gia các phản ứng alkyl hóa và dễ bị oxy hóa. + GF có bản chất là một phân tử amid nên dễ bị thủy phân khi đun nóng. + Có tính chất hóa học của một ceton, tham gia phản ứng cộng hợp vào nhóm carbonyl, phản ứng oxy hóa khử nhóm carbonyl… [12]. 1.1.1.3. Tác dụng dược lý Các nghiên cứu ban đầu cho thấy: thuốc có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể [11] và qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào. Ngoài ra, nó còn có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình in vitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xanh kháng kháng sinh [12]. 1.1.1.4. Chỉ định Aslem đƣợc chỉ định kết hợp với phẫu thuật, hóa trị liệu và xạ trị để điều trị bổ trợ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thƣ phổi và ung thƣ vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng trƣớc và sau phẫu thuật [12]. 1.1.1.5. Tác dụng không mong muốn Ở liều điều trị, chƣa có báo cáo nào về tác dụng phụ nguy hiểm. Một số biểu hiện nhƣ: mẩn ngứa, mề đay, nôn, buồn nôn, táo bón có xảy ra nhƣng rất hiếm gặp [12]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin 1.1.2.1. Trên thế giới Từ năm 1958, Funtumin lần đầu tiên đã đƣợc Janot, Khương Hữu Quý và Goutarel chiết xuất, phân lập từ lá cây Funtumia lactifolia-staff Apocynaceae, một loài cây có ở miền Đông châu Phi. 5 Năm 1965, tại Viện nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên ở Gif-SurYvette (Cộng hòa Pháp), Giáo sư Nguyễn Đăng Tâm đã dùng Funtumin để bán tổng hợp một dãy các aminoacyl steroid, trong đó có Glycyl funtumin đã đƣợc chứng minh là chất có tác dụng kích thích miễn dịch mạnh, vì thế nó đã đƣợc lựa chọn để bào chế tiếp thành một chế phẩm thuốc ở dạng muối hydrobromid và có tên là LH1. Sau đó, do thiếu nguồn nguyên liệu nên quá trình bán tổng hợp Glycyl funtumin bị hạn chế và dừng lại [3], [12], [19], [22]. 1.1.2.2. Ở Việt Nam Năm 1973, chế phẩm LH1 đã đƣợc Giáo sư Tôn Thất Tùng sử dụng trong điều trị bổ trợ cho bệnh nhân ung thƣ gan tiên phát tại bệnh viện Việt Đức, mở ra triển vọng to lớn trong việc sử dụng dƣợc phẩm này để điều trị những bệnh có liên quan đến sự suy giảm hệ thống miễn dịch. Nhận thấy tiềm năng quý báu và với mong muốn tạo ra một loại dƣợc phẩm chất lƣợng tốt đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của ngƣời dân trong nƣớc, các nhà khoa học Việt Nam đã nỗ lực không mệt mỏi và hiện tại đã thu đƣợc những kết quả rất đáng khích lệ: Năm 1977, Giáo sư Đặng Hanh Phức và cộng sự đã bán tổng hợp đƣợc GF.HCl, đặt tên là Aslem và đƣợc sản xuất dƣới dạng thuốc tiêm ở quy mô phòng thí nghiệm để tiến hành những thử nghiệm lâm sàng bƣớc đầu trong điều trị ung thƣ gan, ung thƣ phổi, nhiễm khuẩn ngoại khoa kết hợp với kháng sinh và trong nhiễm khuẩn virus khác ở các bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Viện Lao và Bệnh Phổi, bệnh viện Hữu Nghị Việt Xô. Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa trƣờng Đại học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Phó giáo sư Đào Kim Chi và cộng sự đã tổng hợp thành công GF.HCl từ pregnenolon qua trung gian phtalimid tại Labo 6 Tổng hợp thuốc của trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội do tổ chức NUFFIC tài trợ [12], [22]. Sau gần 50 năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid 0,3mg) đã ra đời. Chế phẩm hiện do công ty cổ phần Dƣợc phẩm Vĩnh Phúc sản xuất (Số đăng ký: VD-0105-06). Hiện nay, Phó giáo sƣ Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu đang tiếp tục nghiên cứu để cho ra đời chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem (Glycyl funtumin hydroclorid 1mg). Cho đến nay đã có khá nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác dụng của Aslem trong điều trị bổ trợ ung thƣ gan [1], sau phẫu thuật ung thƣ đại tràng [20], ung thƣ dạ dày [22], ung thƣ đƣờng tiêu hóa [25]. Các nghiên cứu về ảnh hƣởng của Aslem trên hệ thống enzyme CY-P450 ở gan động vật thí nghiệm [3], ảnh hƣởng lên chức năng hệ tạo máu, gan thận và huyết áp [18], nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học [21] đều cho kết quả hết sức khả quan. Các nghiên cứu về dƣợc động học của Aslem cũng đã đƣợc tiến hành trên động vật thí nghiệm và ngƣời tình nguyện [13], [16], [19], [23]. 1.1.3. Các phƣơng pháp định lƣợng Glycyl funtumin 1.1.3.1. Các phương pháp định lượng trong huyết tương 1.1.3.1.1. Phương pháp LC-MS Phạm Nhƣ Quỳnh [23] sử dụng LC- MS để khảo sát dƣợc động học của GF trong huyết tƣơng chó. Phƣơng pháp đã định lƣợng đƣợc GF ở khoảng nồng độ 0,01 – 0,2 μg/ml. - Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lƣợng GF gồm: Chiết GF từ huyết tƣơng bằng cloroform; Pha tĩnh: cột Hypersil BDS Cyano (5μm, 150 × 4,6 mm); Pha động: hỗn hợp MeOH – H2O (6:4) – dung dịch acid formic 0,2% (tt/tt); Tốc độ dòng: 1ml/phút; Thể tích bơm mẫu: 10 μl. 7 - Chế độ chạy: MS Fullscan-ESI+ (150 – 650); Nhiệt độ ống mao quản: 550°C; Điện thế ion hóa: 2kV; Điện thế chóp nón: 80 kV. 1.1.3.1.2. Phương pháp LC-MS/MS Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LC-MS/MS để định lƣợng GF trong huyết tƣơng đã có độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn so với phƣơng pháp LC-MS. Tạ Mạnh Hùng và Lê Thị Thu Huyền định lƣợng GF trong huyết tƣơng chó với khoảng nồng độ 0,5-53,3 ng/ml [16], [17], [19]. Nguyễn Thị Quỳnh Chi định lƣợng GF trong huyết tƣơng ngƣời tình nguyện với khoảng nồng độ 0,1-20 ng/ml [13]. Các điều kiện để sử dụng LC-MS/MS cho định lƣợng GF gồm: Điều kiện khối phổ: Kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa HESI (+), bộ phận phân tích khối Triple Quadrupole; Chuẩn nội (IS): Salbutamol; Số khối của ion mẹ: GF: m/z = 375, IS: m/z = 240; Thế phân mảnh GF: 32V; IS: 18V; Số khối của mảnh ion con: GF: m/z = 121; IS: m/z = 148. Điều kiện sắc ký: - Nhiệt độ cột 50°C; Thể tích tiêm mẫu: 25 μl. Cột sắc ký, pha động và tốc độ dòng có thể dùng 1 trong 2 điều kiện sau: - Cột Luna CN, kích thƣớc 150 × 4,6 mm, 5μm; Pha động: MeOH – dung dịch acid formic 0,5% (60:40) (tt/tt); Tốc độ dòng: chƣơng trình gradient [16], [17], [19]. - Cột Luna C18, kích thƣớc 75 × 4,6 mm; 2,7μm; Pha động: MeOH – dung dịch acid formic 0,5% (80:20) (tt/tt); Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút [13]. 8 1.1.3.2. Các phương pháp định lượng trong nguyên liệu và chế phẩm Định lƣợng GF.HCl trong chế phẩm không đòi hỏi phƣơng pháp có độ nhạy cao cỡ ng/ml nhƣ đối với định lƣợng trong huyết tƣơng. 1.1.3.2.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Phương pháp tạo màu với ninhydrin Nguyên tắc: GF.HCl có khả năng tạo phức màu xanh tím không bền với ninhydrin. Hợp chất màu có tác dụng với cadimi clorua sẽ cho một phức màu hồng bền, phức này hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 510 nm. Phương pháp tạo cặp ion với heliantin Nguyên tắc: GF.HCl là một base hữu cơ có khả năng tạo cặp với acid hữu cơ mang màu (heliantin). Cặp ion này đƣợc chiết bằng dung môi hữu cơ cloroform rồi đem đo quang. Cực đại hấp thụ của cặp ion này ở khoảng 425 – 426 nm. Phƣơng pháp tạo cặp ion có độ lặp lại cao hơn và đòi hỏi dụng cụ, thuốc thử, thao tác đơn giản hơn nên phƣơng pháp này đƣợc chọn để đƣa vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem [15]. Phƣơng pháp chiết đo quang thực hiện qua nhiều giai đoạn, đòi hỏi nhiều thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại (cloroform). 1.1.3.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự đã xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPLC định lƣợng GF.HCl với khoảng nồng độ 0,05-0,25 mg/ml. Phƣơng pháp có độ chính xác cao với khả năng thu hồi > 97% và độ chụm ≤ 0,12%. Điều kiện sắc ký gồm: Cột sắc ký: RP 18 (150 × 4,6 mm; 5 μm); Pha động: Methanol – dung dịch kali dihydrophosphat 20 mM pH 7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua 9 màng lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45 μm; Bƣớc sóng : 204 nm; Lƣu lƣợng dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 20 μl [2]. Phƣơng pháp định lƣợng GF.HCl có độ chính xác cao, đơn giản, thời gian phân tích nhanh (khoảng 7 phút) và khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp cho việc định lƣợng trong chế phẩm. 1.2. VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI Định nghĩa: Viên đặt dƣới lƣỡi (Sublingual tablet) là chế phẩm dạng rắn, đơn liều đƣợc đặt dƣới lƣỡi để cho tác dụng toàn thân. Viên đƣợc bào chế bằng cách nén hỗn hợp của bột hoặc hạt thành viên có hình dạng phù hợp với mục đích sử dụng [28]. Miệng không phải là nơi hấp thu thức ăn nhƣng tại đây có một màng lƣới mao mạch khá phong phú, đặt biệt là 2 bên má và dƣới lƣỡi, rất thuận tiện cho việc hấp thu thuốc. Dƣợc chất sau khi hòa tan trong nƣớc bọt (có pH khoảng 6,5) đƣợc hấp thu qua màng niêm mạc mỏng ở dƣới lƣỡi và đi về tĩnh mạch cảnh nghĩa là đƣợc đƣa thẳng vào vòng tuần hoàn (vào tĩnh mạch cảnh rồi về tim), tác dụng do đó xuất hiện nhanh, lại không qua gan nên tránh đƣợc sự phá hủy của men chuyển hóa thuốc ở gan vì vậy sinh khả dụng của thuốc đƣợc nâng cao so với đƣờng uống. pH của nƣớc bọt là 6,5 là một lợi thế vì ít ảnh hƣởng đến độ bền vững của các thuốc nhạy cảm với môi trƣờng kiềm hoặc acid. Đây là một đƣờng đƣa thuốc thuận tiện, dễ thực hiện, và an toàn [4]. Để dƣợc chất đƣợc hấp thu nhanh, viên đặt dƣới lƣỡi phải rã rất nhanh (trong vòng 1 – 2 phút) và dƣợc chất phải là loại dễ tan. Để tránh gây cảm giác cộm dƣới lƣỡi khi đặt và làm cho viên rã nhanh, viên đặt dƣới lƣỡi thƣờng đƣợc chế với khối lƣợng nhỏ (<150 mg) và mỏng. 10 Do vậy dƣợc chất phải là loại dùng ở liều thấp (1-15 mg), không kích ứng niêm mạc và ở dạng bột rất mịn [8]. 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1. Nguyên tắc và phân loại Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân, chất lỏng đƣợc bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Tùy thuộc vào bản chất các pha, cơ chế tách mà ngƣời ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc ký lỏng phân bố đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay [5], [9], [10], [14]. 1.3.2. Các thông số đặc trƣng 1.3.2.1. Thời gian lưu tR Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất. Thời gian lƣu phụ thuộc vào các yếu tố: - Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thƣớc, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi. - Bản chất, thành phần, tốc độ pha động. - Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế. 11 - Trong một số tƣờng hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hƣởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký [9], [14]. 1.3.2.2. Hệ số phân bố K Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. K= Trong đó: CS: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh. CM: là nồng độ mol của chất tan trong pha động. K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [9], [14]. 1.3.2.3. Hệ số dung lượng k’ Là đại lƣợng cho biết tỉ số khối lƣợng của chất tan phân bố vào pha tĩnh và pha động. k’ = K = Trong đó: K: hệ số phân bố. VS, VM: thể tích pha tĩnh và pha động. tR, tM: thời gian lƣu của chất cần phân tích và chất không lƣu giữ. Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1≤ k’≤8 [5], [9], [14]. 1.3.2.4. Hệ số đối xứng F Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng: F= Trong đó: W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.