Tài liệu Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hạt và cao bìm bìm biếc

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, những tiến bộ vượt bậc trong khoa học tự nhiên và những hiểu biết ngày càng sâu sắc của nền y học hiện đại làm cho sự phân tách giữa nền y học phương Đông và y học phương Tây ngày càng trở nên rõ rệt. Tuy nhiên, những hạn chế rõ ràng của các loại thuốc có nguồn gốc từ tổng hợp hóa dược như có nhiều tác dụng phụ hoặc phản ứng có hại, dễ gây tương tác... đang ngày càng làm cho con người hướng sự quan tâm của mình vào các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Việt Nam là một trong những nước trên thế giới có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng nhất. Đồng thời, Việt Nam cũng là một nước có kinh nghiệm sử dụng thuốc cổ truyền lâu đời. Với những đặc điểm như vậy, việc phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu là phù hợp với điều kiện thực tiễn của nước ta cũng như xu hướng phát triển của nền y học hiện đại. Bìm bìm biếc là một cây thuốc được dùng phổ biến theo kinh nghiệm dân gian ở nước ta. Hạt của cõy Bỡm bìm biếc có giá trị sử dụng cao. Theo kinh nghiêm dân gian, nó thường được sử dụng trong các bài thuốc thông đại và tiểu tiện, thông mật, đôi khi dùng để trị giun [10], [23]. Bộ phận này của cây hiện nay được dùng nhiều dưới dạng cao mềm, cao đặc hoặc cao khô trong nhiều sản phẩm như: sản phẩm Boganic đ (công ty Traphaco), sản phẩm Bổ gan thông mật đ (công ty Sohaco), sản phẩm Nagatecđ (công ty Nam Dược)... với công dụng chủ yếu điều trị viêm gan, vàng da, mụn nhọt, lở ngứa... Với những giá trị sử dụng như vậy, việc nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn của hạt và cao Bìm bìm biếc là một việc làm hết sức cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hạt và cao Bìm bìm biếc” với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn của hạt và cao khô Bìm bìm biếc nhằm góp phần nâng cao chất lượng của hạt và cao khô Bìm bìm biếc. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI IPOMOEA 1.1.1. Vị trí phân loại chi Ipomoea Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987 [3], [6], chi Ipomoea có vị trí như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp hoa môi (Lamiidae) Liên bộ Cà (Solananae) Bộ Khoai lang (Convolvulales) Họ Khoai lang (Convolvulaceae) Chi Ipomoea 1.1.2. Đặc điểm chung của chi Ipomoea Theo Thực vật chí Đông Dương [16], chi Ipomoea mang những đặc điểm sau: - Dạng cõy: Cây thảo hoặc dõy leo, có dây cuốn, bò sát đất, hiếm khi đứng thẳng đứng. - Lá: mọc so le, nguyên, chia thùy hoặc bị xẻ, gốc hình tim. - Hoa: + Cụm hoa xim, có chồi nỏch, cú một hoặc nhiều hoa, có lá bắc, sớm rụng hoặc vĩnh viễn. + Hoa có màu tía, trắng hoặc vàng, thường rất đẹp. + Lá đài ở bên ngoài thường lớn hơn, hiếm khi nhỏ, hoặc tất cả gần bằng nhau. + Tràng hoa hình chuông, hình phễu, hoặc hình ống hẹp hoặc không hẹp. + Phiến hoa có 5 nếp, chia thùy ngắn. + Nhị hoa thường đính ở phớa đỏy ống, gần như luôn thụt vào. Bao phấn thẳng hoặc cong, hoặc cuộn lại thành hình xoắn ốc sau khi mở. Chỉ nhị luụn nhỳ, đớnh với đầu nhụy ở bên trên. + Đĩa mật có hình ống, ngắn, nằm ở đáy bầu. Nhụy có bầu chia thành 2 ô, mỗi ụ cú 2 noãn, hiếm khi 3-4 ụ, vũi nhụy mảnh như sợi chỉ. + Quả nang, hình cầu hoặc ovan. + Hạt hình tròn nhẵn hoặc có nhiều lông. 3 1.1.3. Phân bố của chi Ipomoea Họ Bìm bìm hay họ Khoai lang hoặc họ Rau muống (Convolvulaceae), là một nhóm của 55-60 chi và khoảng 1.625-1.650 loài, chủ yếu là cõy thõn thảo dạng dây leo, nhưng cũng có một số loài ở dạng cây gỗ hay cây bụi, phân bố rộng khắp thế giới. Ở Việt Nam, họ Bìm bìm có 20 chi với khoảng 100 loài: Aniseia, Argyreia, Bonamia, Cordisepalum, Dichondra, Erycibe, Evolvulus, Hewitia, Ipomoea, Jacquemontia, Lepistemon, Merremia, Mina, Neuropeltis, Operculina, Phabitis, Porana, Stictocardia, Tridynamia, Xenostegia. Chi Ipomoea là một chi lớn của họ này, gồm khoảng 500 loài, phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm các loài dõy bũ, dây leo, và cõy thõn bụi . Ở Việt Nam, chi Ipomoea có khoảng 35 loài. Một số loài là cây trồng như rau muống, khoai lang,... còn lại đều là cây mọc tự nhiên, phân bố rộng khắp các vùng miền trong cả nước [22]. 1.1.4. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Ipomoea 1.1.4.1. Ipomoea aquatica Forsk - Tên thường gọi: Rau muống, bìm bìm nước. - Đặc điểm thực vật: Cây mọc bò, ở nước hay trên cạn. Thân rỗng, dày, có những đốt, mặt ngoài nhẵn. Lỏ hỡnh 3 cạnh, đầu nhọn, cũng có khi hẹp và dài, không có lông. Phiến lá dài 7-9 cm, rộng 3,5-7 cm; cuống lá nhẵn, dài 3-6 cm. Hoa to, màu trắng hoặc hồng tím, ống hoa tím nhạt, mọc từng 1-2 hoa trên một cuống dài 1-2 cm; đài hình chén, 5 răng nhọn không đều; tràng hợp hình phễu, 5 cánh hoa hàn liền. Nhị không bằng nhau, đính ở gốc tràng; bầu nhẵn. Quả nang, hình cầu, đường kính 7-9 cm. Hạt 4, có lông màu hung, đường kính 4 mm. - Thành phần hóa học: + 92% nước; 3,2% protit; 2,5% glucid; 1% cenluloza; 1,3% tro. + Hàm lượng muối khoáng rất cao: 100 mg% Ca, 37 mg% P; 1,4 mg% Fe. + Hàm lượng vitamin: 23 mg% vitamin C; 0,1 mg% vitamin B1; 0,09 mg% vitamin B2; 0,7 mg% vitamin PP; 2,9% caroten. + Ngoài ra còn chứa nhiều chất nhầy. - Công dụng: Ngoài công dụng dùng làm rau ăn tươi, nấu hoặc xào; trong nhân dân, rau muống được coi như là một thứ rau làm mất tác dụng của những thuốc đã 4 uống, nhất là dùng để giải các chất độc: rau muống rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước uống. Theo Garcia F., tại Philippin, người ta phát hiện trong ngọn một loại rau muống có một chất giống như insulin, do đó được dùng để chữa đái tháo đường. Theo kinh nghiệm dân gian, ngọn rau muống giã nát với lá cây Vũi vòi (Heliotropium indicum) đắp lên những vết loét do bệnh zona nhằm giảm loột. Thõn lỏ rau muống giã nát với mướp đắng và lá xoan dùng đắp lên ngực hoặc trán những người bị sốt, khó thở [7],[9],[10],[13]. Ngoài ra, cũng đó cú cỏc nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của cây này [17]. 1.1.4.2. Ipomoea batatas (L.) Poir - Tên thường gọi: Khoai lang. - Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống lâu năm, thân mọc bò, dài 2-3m, rễ mầm thành củ màu đỏ, trắng hoặc vàng. Lá có nhiều hình, thường hình tim xẻ 3 thùy, không có lông, có cuống dài, mộp nguyờn, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, bấm lá thấy nhựa trắng chảy ra. Hoa màu tím nhạt hoặc trắng, mọc thành xim ít hoa ở đầu cành; đài 5 răng, hình chén; tràng hợp, hình phễu; nhị 5 phồng ở gốc và không thò ra ngoài tràng; bầu nhẵn. Rất ít khi thấy quả và hạt. - Thành phần hóa học: + Củ : 24,6% tinh bột; 4,17% glucoza. Khi còn tươi chứa 1,3% protein; 0,1% chất béo; các diattaza; tro có Mn, Ca, Cu: các vitamin A, B, C; 4,24% tanin; 1,375% pentozan. Khi phơi khô chứa inozit, acid clorogenic, phytosterol, carotin, adenin, betain, cholin. + Dây : adenin, betain, cholin. + Lá: chất nhựa tẩy (1,95-1,97 %). - Công dụng: Ngoài công dụng thực phẩm, làm nguyên liệu chế tinh bột khoai, có thể dùng khoai lang làm thuốc nhuận tràng sẽ cho phân mềm, không lỏng, không đau bụng [7],[9],[10],[13]. Ngoài ra, cũng đó có nghiên cứu chứng minh khả năng làm tăng tính nhạy cảm của Insulin, tăng khả năng kiểm soát đường huyết của lá và củ khoai lang ở bệnh nhân đái tháo đường type II [15],[19]. 5 1.1.4.3. Ipomoea turpethum R.Br. - Tên thường gọi: chỡa vôi. - Đặc điểm thực vật: Dây leo bằng thân quấn, sống dai. Cành hình trụ. Lá hình trứng hoặc thuôn dài, đôi khi 3 cạnh; phía dưới có hình tim, dài 5-12 cm, rộng 2,5-7,5 cm; cuống lá dài 1-7 cm. Hoa to màu trắng hoặc vàng nhạt mọc ở nách lá, cuống hoa dài 1-7 cm. Quả nang, đường kính 15-16 cm, 4 cạnh, mở theo đường nứt ngang. Hạt 34, hình thấu kính, màu đen nhạt, đường kính 6-7 mm. - Thành phần hóa học: Hoạt chất chủ yếu là gluco-nhựa 7-8%. Gluco-nhựa của chỡa vụi phân tích sâu hơn sẽ được hai phần: một phần không tan trong ether là turpethin, chiếm khoảng 90%; phần còn lại tan trong ether là turpethin α và β. - Công dụng: Theo kinh nghiệm dân của nhân dân Việt Nam, củ chỡa vụi thường được dùng chữa thấp khớp, đau nhức các khớp xương. Thân cây chỡa vụi hơ hoặc xào núng dựng đắp lên phụ nữ sau khi sinh để chữa đau bụng. Theo kinh nghiệm của các nước phương Tây, thân rễ chỡa vụi dùng làm thuốc tẩy mạnh với liều 4-8g dưới dạng thuốc sắc hoặc với liều 1-4g bột [10]. 1.1.4.4.Ipomoea digitata Lin. - Tên thường gọi: Tầm sét, Bìm bìm xẻ ngón. - Đặc điểm thực vật: Cây leo bằng thân quấn, mảnh, không có lông. Cành hình trụ. Lá chia thành 5-7 thùy sõu, đường kính lá 8-20 cm, hình chân vịt, nhẵn, có cuống dài 4-8 cm. Cụm hoa ở nách lá, hỡnh chựy lưỡng phân, trông hơi gù. Hoa màu hồng, hình ống rộng, lá đài bị xé rách, bầu 2 ô, đựng 2 noãn. Quả nang hình cầu, mở bằng 4 mảnh vỏ, chứa 4 hạt có lông màu hung đỏ. - Thành phần hóa học: nhiều chất nhầy. - Công dụng: Trong nhân dân người ta dùng rễ củ Tầm sét làm thuốc bổ, tăng dục: Rễ củ Tầm sét cạo sạch vỏ, thái mỏng, giã nát, trộn với mật ong mà ăn. Theo kinh nghiệm dân gian, củ Tầm sét nấu với đường ăn thường xuyên có tác dụng điều kinh, tránh béo bệu. Tại Ấn Độ và Philippin, người ta dùng củ Tầm sét làm thuốc nhuận tẩy nhẹ. Còn dùng làm thuốc chữa suy yếu, rong kinh. Ngoài ra, củ Tầm sét còn được dùng làm thuốc lợi sữa, thông mật [9],[10]. 6 1.1.4.5. Ipomoea purpurea (L.) Roth - Tên thường gọi: Bìm bìm tía. - Đặc điểm thực vật: Cây mọc hàng năm có thân leo quấn; dài 1,5-3 cm; có lông. Lá nguyên dạng tim, dài 5-12 cm, ít khi chia thùy, có mũi nhọn, có lông mềm; cuống lá dài 4-9 cm. Hoa hợp 2-3 cái thành xim nhỏ ở nách lá; tràng 3-6 cm, màu trắng, tía hay tía hồng; nhị 5; bầu 3 ô. Quả nang chứa 5-6 hạt màu đen (hắc sửu) hay màu vàng trắng nhạt (bạch sửu) dài 4-8 mm, rộng 3-5 mm. - Thành phần hóa học: Trong hạt có pharbitin, acid pharbitic, acid tiglic, acid nilic. Trong thõn cú 4-8% chất nhựa mềm. Nó chứa Ipuranol tương đương với sitosterol glucosid, acid ipuralic. - Công dụng: Vị đắng tính hàn, có độc, có tác dụng trừ thấp nhiệt, thông đại tràng, thông tiểu, sát trùng. Thường dùng trị thủy thũng, đại tiểu tiện khụng thụng; suyễn, khó thở, bụng đầy tức; giun đũa, sán xơ mít [7],[9],[12]. 1.2. CÂY BÌM BÌM BIẾC 1.2.1. Tên khoa học Ipomoea nil (L.) Roth, họ Khoai lang (Convolvulaceae) 1.2.2. Đặc điểm thực vật Dây leo quấn. Thân mảnh, có điểm những lông hình sao. Lá mọc so le, hình tim, có phiến nguyên hay xẻ 3 thùy, nhẵn và xanh ở mặt trên, xanh nhạt và có lông ở mặt dưới, dài 14 cm, rộng 12 cm; cuống dài 5-9 cm, gầy, nhẵn. Hoa màu hồng tím hoặc lam nhạt, lớn, mọc thành xim 1 đến 3 hoa ở kẽ lá. Đài có 5 răng đều, hẹp nhọn. Tràng hình phễu, ống màu trắng, 4 cánh mỏng hàn liền. Nhị 5 không đều đính ở gốc tràng, không thò ra ngoài. Chỉ nhị phồng, có lông ở gốc. Bao phấn hình mũi tên. Bầu giữa, 3 ô, mỗi ô đựng 2 noón. Vũi nhụy mảnh như sợi chỉ, đớnh noón trung tâm. Quả nang, hình cầu, nhẵn, đường kính 8 mm, có 3 ngăn. Hạt 2-4, hình 3 cạnh, lưng khum, hai bên dẹt, nhẵn, màu đen hoặc trắng tùy loài, dài 5-8 mm, rộng 3-5 mm [9],[10]. 7 Hình 1.1. Cây Bìm bìm biếc (Ipomoea nil) 1.2.3. Phân bố, thu hái Cây Bìm bìm biếc mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta; ngoài ra còn mọc ở Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Philippin, Trung quốc... Vào cỏc thỏng 7-10, quả chín, hái về đập lấy hạt phơi khô [10]. 1.2.4. Bộ phận dùng Bộ phận dùng làm thuốc của cây Bìm bìm biếc là hạt. Trong Đông y, hạt Bìm bìm được gọi là “Khiờn ngưu tử”. “Khiờn” là dắt, “ngưu” là trâu, “tử” là hạt; tương truyền thời xưa có người dùng hạt Bìm bìm mà khỏi bệnh, đã dắt trâu đến tạ ơn người mách thuốc, nên vị thuốc từ hạt Bỡm bỡm mới có tên là “Khiờn ngưu tử” [10],[20]. 1.2.5. Thành phần hóa học Hạt Bìm bìm biếc chứa khoảng 2% chất glucozit gọi là phacbitin, khoảng 11% chất béo, 2% sắc tố cũng là glucozit. Phacbitin được cấu tạo bởi các chất sau: acid phacbitic, acid tiglic, methyl ethylacetic, acid nilic. Acid phacbitic cấu tạo bởi acid ipurolic, glucoza và ramnoza [9]. 1.2.6. Tác dụng – Công dụng 1.2.6.1. Tác dụng Phacbitin có tác dụng tẩy mạnh, tăng sức co bóp của ruột. Ngoài ra, cũn cú tỏc dụng diệt giun (in vivo). 8 Theo Đông y, Khiên ngưu tử có vị cay, tớnh núng, hơi có độc, vào 3 kinh phế, thận, đại tràng. Có tác dụng tả khí phận thấp nhiệt, trục đờm, tiêu ẩm lợi nhị tiện (đại tiểu tiện), là thuốc chữa tiện bĩ, cước khí, chủ trị hạ khí; lợi tiểu tiện chữa cước thũng (phù), sát trùng. 1.2.6.2.Công dụng – cách dùng Trong thực tế, hạt Bìm bìm biếc thường được dùng làm thuốc thông đại tiểu tiện, thông mật, đôi khi có tác dụng cho ra giun. Liều dùng: Mỗi ngày 2-3g tán bột, dùng nước chiêu thuốc [10]. Một số đơn thuốc có hạt Bìm bìm biếc:  Chữa các chứng thũng trướng: Bài 1: Khiên ngưu 10g, Nước 300ml. Sắc còn 150ml, chia 2 lần uống trong ngày, nếu tiểu tiện nhiều được thì khỏi. Có thể tăng liều uống cao hơn tùy theo bệnh, có thể uống tới 40g. Bài thuốc này có tác dụng chữa phù thũng, nằm ngồi không được. Bài 2: Cũng chỉ dùng một vị thuốc Khiên ngưu, đem tán mịn, mỗi lần uống 4g, dùng nước chiêu thuốc. Có tác dụng chữa phù thũng, đại tiểu tiện khụng thông . Bài 3 (Châu xa hoàn): Khiên ngưu 40g, Đại hoàng 20g, Cam toại 10g, Đại kích 10g, Nguyên hoa 10g, Thanh bì 10g, Trần bì 10g, Mộc hương 5g, Khinh phấn 1g. Tất cả tán mịn, trộn đều, hoàn thành viên, ngày uống 1 lần, mỗi lần 3g. Có tác dụng lợi thủy, hành khí. Dùng trong trường hợp bụng trướng, chân tay phù nề, ngực bụng đầy tức, khó thở, đại tiện bí, tiểu tiện ít. Bài 4: Trướng bụng do xơ gan hoặc viêm thận mạn tính: Khiên ngưu tử 80g, Hồi hương 40g. Tất cả nghiền mịn, trộn đều. Mỗi ngày uống 1 lần, mỗi lần 8g, uống khi đói bụng, chiêu thuốc bằng nước sôi, uống liên tục trong 2 - 3 ngày.  Chữa phù do viêm thận: Khiên ngưu tử 100g, nghiền mịn; Tồng tỏo (Tỏo tàu) 80g, hấp chín, bỏ hột, giã nát; gừng tươi 500g, giã nát vắt lấy nước, bỏ bã; tất cả đem trộn đều thành một thứ bột nhão, cho vào nồi hấp 30 phút, trộn đều, lại hấp thêm 30 phút nữa là được. Lượng thuốc trên chia đều thành 8 phần, ngày uống 3 lần: Sáng - trưa - chiều, mỗi lần uống 1 phần, sau 2 - 5 ngày thì hết; kiêng muối trong 3 tháng . 9  Thuốc trị giun đũa Bài 1: Khiên ngưu tử (sao) 20g, Tân lang (hạt Quả cau) 4g, Sử quân tử (Quả giun) 25g. Tất cả đem nghiền mịn, trộn đều, mỗi lần uống 6g, trẻ nhỏ giảm bớt liều. Bài 2: Sát trùng chỉ thống (làm hết đau) dùng trong trường hợp đau bụng do giun đũa, cũng có thể dùng cho cả trường hợp giun tóc: Khiên ngưu tử 8g, Tân lang (vỏ Quả cau) 8g, Đại hoàng 4g. Tất cả đem nghiền mịn, trộn đều, ngày uống 2 lần, vào sáng sớm và buổi chiều khi đói bụng, mỗi lần uống 3 - 4g, dùng nước sôi chiêu thuốc, trẻ nhỏ tùy theo tuổi cần giảm bớt liều [10],[20]. 10 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là hạt và cao khô của cõy Bìm bìm biếc (Ipomoea nil (L.) Roth), họ Khoai lang (Convolvulaceae). Cây do chúng tôi tự trồng và thu hái vào tháng 9/2009. Xử lý nguyên liệu: Hạt được phơi sấy khô, tán nhỏ. Các nguyên liệu nghiên cứu (hạt và cao khô) bảo quản nơi thoáng mát. 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 2.1.2.1. Thuốc thử, dung môi, hóa chất - Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích. - Dung môi, thuốc thử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. 2.1.2.2. Dụng cụ - Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh, buret, bình chiết, nồi cách thủy. - Cân kỹ thuật, cân phân tích Precisa. - Kính hiển vi. - Máy đo độ ẩm Sartorius. - Máy đo tro toàn phần Nabertherm. - Máy chụp ảnh Canon 8.0 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc - Nghiờn cứu đặc điểm hình thái hạt và đặc điểm bột. - Định tính cỏc nhúm chất có trong hạt. - Xác định độ ẩm, tro toàn phần, lượng tạp chất có trong hạt. - Định lượng chất béo trong hạt. - Xác định các chỉ số iod, acid, xà phòng hóa, ester của chất béo có trong hạt. - Xác định các acid bộo cú trong chất béo của hạt. - Xác định lượng chất chiết được trong hạt bằng nước. 2.2.2. Nghiên cứu về cao khô Bìm bìm biếc - Công thức của cao. - Phương pháp điều chế cao. 11 - Nghiên cứu tính chất của cao. - Định tính cỏc nhúm chất hóa học có trong cao. - Xác định mất khối lượng do làm khô của cao. - Định lượng chất béo có trong cao. - Xác định các acid bộo cú trong chất béo của cao. - Xác định lượng chất chiết được trong cao bằng cồn. - Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc 2.3.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái của hạt và bột hạt  Nghiên cứu đặc điểm hình thái của hạt bằng phương pháp mô tả phân tích.  Xác định đặc điểm bột hạt: soi bột dưới kính hiển vi Cách tiến hành: Lấy một lượng nhỏ bột (qua rây cú kích thước mắt rây khoảng 250 àm), cho vào một giọt dung dịch soi (nước, glycerin,...) đã có sẵn trên lam kớnh. Dựng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm dung dịch, đậy lam kính, di nhẹ lam kính rồi quan sát dưới kính [2]. 2.3.1.2. Định tính cỏc nhúm chất bằng các phản ứng hóa học trong ống nghiệm  Định tính nhóm alcaloid Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 5ml, thêm 10ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đặc, sau đó lắc với CHCl3 2-3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp dung môi hữu cơ rồi cho bốc hơi cách thủy đến khô thu được cắn. Hòa tan cắn bằng 2-3ml H 2SO4 1N, chia vào 3 ống nghiệm, tiến hành 3 phản ứng, phản ứng dương tính nếu xuất hiện các hiện tượng sau: - Phản ứng với TT Mayer: Thêm 1-2 giọt TT Mayer, xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt. - Phản ứng với TT Bouchardat: Thêm 1-2 giọt TT Bouchardat, xuất hiện tủa nâu. - Phản ứng với TT Dragendorff: Thêm 1-2 giọt TT Dragendorff, xuất hiện tủa đỏ cam [1]. 12  Định tính nhóm saponin Cân khoảng 5g dược liệu vào bỡnh nún dung tích 50ml, thêm 20ml EtOH 90 0, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc nóng thu dịch lọc. Cho vài giọt dịch lọc vào ống nghiệm có sẵn 5ml nước cất, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút rồi để yên. Sau 15 phút, quan sát, phản ứng dương tính nếu thấy cột bọt bền và cao [1].  Định tính nhóm flavonoid Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml EtOH 90 , đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc nóng thu dịch lọc, tiến hành các phản ứng sau: - Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy lọc, để khô, hơ lên miệng lọ amoniac đặc, phản ứng dương tính nếu màu của vết chất có sự thay đổi. - Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính nếu dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng hoặc xuất hiện tủa màu vàng. - Phản ứng với dung dịch FeCl3: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl 3 5%, phản ứng dương tính nếu dung dịch trong ống nghiệm có màu xanh lục, xanh đen, nâu hoặc nâu đen. - Phản ứng cyanidin: Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thờm ớt bột magie kim loại và vài giọt dung dịch HCl đặc, phản ứng dương tính nếu dung dịch đổi màu [1]. 0  Định tính nhóm tanin Cân khoảng 2g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 10ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc thu dịch lọc, tiến hành các phản ứng sau: - Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. - Phản ứng với chì acetat 10%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%, phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông. - Phản ứng với gelatin 1%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%, phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng [1]. 13  Định tớnh nhúm chất béo Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bỡnh nón dung tích 50ml. Thêm 10ml CHCl 3 vào, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc lấy dịch. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên trên giấy lọc, sấy nhẹ để bay hết dung môi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vết mờ trên giấy lọc [1].  Định tính nhóm caroten Lấy một ít dịch lọc ở trên cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Thêm 1-2 giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh [1].  Định tính nhựa Cân khoảng 10g dược liệu, chiết hồi lưu bằng cồn 90 0 trong khoảng 2-3 giờ. Bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Rửa cắn vài lần bằng nước sôi, mỗi lần 10ml. Cắn sau khi rửa được sấy khô, tán nhỏ để làm các phản ứng sau: - Hiện tượng huỳnh quang: Lấy 0,5g cắn, thêm 5ml dung dịch amoniac loãng. Lắc kỹ 15 phút, phản ứng dương tính nếu dịch trên không có màu vàng nhưng soi dưới ánh sáng tử ngoại lại xuất hiện huỳnh quang màu. - Hiện tượng đốt cháy: Lấy một ít cắn đốt cháy, phản ứng dương tính nếu có mùi đặc trưng của nhựa [1]. 2.3.1.3. Xác định độ ẩm, tro toàn phần và lượng tạp chất có trong hạt  Xác định độ ẩm bằng phương pháp nhiệt độ: sử dụng máy đo độ ẩm Sartorius Cách xác định: Khởi động máy đo độ ẩm Sartorius. Lấy một lượng dược liệu nhất định, nghiền nhỏ, dàn mỏng trên đĩa cân của máy, đặt nhiệt độ là 100 0C. Đậy nắp lại, đọc kết quả sau khi máy báo kết thúc [5].  Xác định tro toàn phần Tro toàn phần là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu. Cỏch xác định: Cân chính xác khoảng 2-3g dược liệu, cho vào một chén sứ đã nung và cõn bỡ. Nung chén ở nhiệt độ không quá 450 0C đến khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Nếu tro vẫn chưa loại được hết carbon, cho vào khối chất đã than 14 hóa một ít nước nóng, khuấy đều bằng đũa thủy tinh rồi lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung, nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Cho dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 0C đến khối lượng không đổi [5]. Tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần được tính theo công thức: X (%) = . 100 Trong đó: a: Khối lượng tro (g). P: Khối lượng dược liệu (g). X: Độ tro toàn phần của dược liệu (%).  Xác định phần trăm tạp chất lẫn trong dược liệu Tạp chất lẫn trong dược liệu bao gồm tất cả các chất ngoài quy định của dược liệu đó như: Đất, đá, rơm rạ, cây cỏ khỏc, cỏc bộ phận khác của cõy khụng quy định làm dược liệu, xác côn trùng... Cách xác định: Cân một lượng mẫu vừa đủ đã được chỉ dẫn trong chuyên luận, dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp; khi cần có thể dựng rây để phân tách tạp chất và dược liệu.Cõn phần tạp chất đó [5]. Lượng tạp chất lẫn trong dược liệu được tính theo công thức sau: X (%) = . 100 Trong đó: a: Khối lượng tạp chất (g). P: Khối lượng dược liệu (g). X: Phần trăm tạp chất có trong dược liệu (%). 2.3.1.4. Định lượng chất béo trong dược liệu theo chuyên luận DĐVN IV Nguyên tắc: Chiết xuất chất béo trong dược liệu bằng dung môi hữu cơ. Dung môi thường dùng là chloroform, ether ethylic hoặc ether dầu hỏa. Cất thu hồi dung môi và sấy cắn đến khối lượng không đổi. 15 Cách xác định: Nghiền nhỏ dược liệu, xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm. Cân chính xác khoảng 20g bột dược liệu, cho vào cối sứ nghiền cùng với 2–3g Natri sulphat khan. Đựng dược liệu đã nghiền trong túi giấy lọc, dùng bông lau sạch cối rồi cho bông vào túi, gập miệng túi. Đặt túi vào bình Soxhlet, chiết chất béo có trong bột hạt bằng CHCl3 đến kiệt (cách thử: nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng, nếu không để lại vết bóng mờ trên giấy là đạt yêu cầu). Chuyển dịch chiết trong bình cầu sang một cốc sạch khụ đó cõn trước bì, cho bay hơi đến kiệt dung môi trên nồi cách thủy rồi đem cân xác định khối lượng của cắn. Cắn được bảo quản trong tủ lạnh [1],[5]. Hàm lượng chất béo trong dược liệu được tính theo công thức: X(%) = Trong đó: a: Khối lượng cắn (g). P: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g). h: Độ ẩm dược liệu (%). 2.3.1.5. Xác định các chỉ số acid, xà phòng hóa, ester của chất béo  Xác định chỉ số acid Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do chứa trong 1g chất thử. Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt thỡ cõn chớnh xác một lượng mẫu thử cho vào một bình thủy tinh nút mài dung tích 250ml. Thêm 50ml hỗn hợp có thể tích bằng nhau của EtOH 96% và ether ethylic. Dung môi phải vừa mới được trung tính bằng dung dịch KOH 0,1N trong EtOH 96% với chỉ thị là 0,5ml phenolphtalein trong EtOH 96%. Lắc để hòa tan mẫu thử, nếu khó tan có thế đun hồi lưu trên cách thủy đến khi tan hoàn toàn. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N trong EtOH cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 15 giây. Ghi số ml dung dịch KOH 0,1N trong EtOH đã dùng [5]. Chỉ số acid được tính theo công thức: Chỉ số acid = 16 Trong đó: P: lượng mẫu đem thử (g). a: số ml dung dịch KOH 0,1N trong EtOH đó dựng chuẩn độ.  Xác định chỉ số xà phòng hóa Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do và để xà phòng hóa cỏc ester chứa trong 1g chất thử. Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt thỡ cõn chính xác 2g mẫu thử, chuyển vào một bỡnh nún nỳt mài có dung tích 200 – 250 ml. Thêm chính xác 25,0 ml dung dịch KOH 0,5N trong EtOH và vài viên bi thủy tinh. Đun hồi lưu trên cách thủy sôi trong 30 phút, hay trong một khoảng thời gian quy định trong chuyên luận, thỉnh thoảng lắc theo chuyển động trũn. Thờm 1ml dung dịch phenolphtalein và chuẩn độ ngay KOH dư bằng dung dịch HCl 0,5N. Ghi số ml dung dịch HCl 0,5N đã dùng cho mẫu thử. Tiến hành thử với mẫu trắng trong cùng điều kiện như trên. Ghi số ml dung dịch HCl 0,5N đã dùng cho mẫu trắng [5]. Chỉ số xà phòng hóa được tính theo công thức: Chỉ số xà phòng hóa = Trong đó: a: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu thử (ml). b: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu trắng (ml). P: Lượng mẫu thử (g).  Xác định chỉ số ester Chỉ số ester là số mg KOH cần thiết để xà phòng hóa cỏc ester chứa trong 1g mẫu thử. Chỉ số ester được tính theo công thức: Chỉ số ester = Chỉ số xà phòng hóa – chỉ số acid 2.3.1.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Sắc ký khí khối phổ là một thiết bị ghép nối giữa sắc ký khí – một thiết bị tách với khối phổ ký – cũng là một thiết bị hoàn hảo trong việc nhận biết các chất.  Sắc ký khí 17 Là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có bản chất khí thấm qua pha tĩnh. Mẫu được làm bay hơi và được mang bởi pha động khớ (khớ mang) đi qua cột. Mẫu phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các thành phần của mẫu phân tách ra khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tương đối và ái lực khác nhau của chúng đối với pha tĩnh.  Detector chọn lọc khối phổ (MSD: Mass Selective Detector) Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên nguyên tắc bẻ gãy phân tử chất phân tích thành các mảnh ion có tỷ số giữa khối lượng và điện tích m/z xác định và đặc trưng cho chất phân tích. Quá trình ion hóa: Có nhiều kỹ thuật ion hóa, nhưng kỹ thuật ion hóa bằng va chạm điện tử EI (electric impact) là phổ biến hơn cả. Quá trình ion hóa được thực hiện bởi sự va chạm phân tử chất phân tích với dũng điện tử có năng lượng cao (70eV). Quá trình này hầu như chỉ tạo ra các ion dương (M + e - → M+ + 2e-), sau đó M+ sẽ bị bẻ gãy thành các mảnh ion có khối lượng nhỏ hơn. Phân tích dữ liệu: Sau khi ion hóa, các ion được thu bởi một lăng kính mang điện dẫn vào trong bộ phân tích khối. Ở đây, các ion khác nhau được phõn tỏch do sự khác nhau về tỷ số khối lượng hạt trên điện tích (m/z) trong từ trường hoặc điện trường. Thiết bị phân tích khối điển hình trong GC – MSD là bộ tứ cực. Sau khi các ion tạo thành đã được tách detector, thường là bộ nhân điện tử loại dynod liên tục, được sử dụng để “đếm” các ion, hình thành phổ khối. Ion từ bộ phân tích khối va chạm vào bề mặt bán dẫn của detector giải phóng các điện tử, cứ như thế sẽ nhân lên thành dũng thỏc điện tử, dẫn tới hệ số khuếch đại có thể tới 1 triệu lần. Dữ liệu có thể thu được ở hai cách, quét toàn bộ các ion (TIC) hoặc chỉ lựa chọn một số ion cơ bản hay đặc trưng để quét (SIM).  Áp dụng Sắc ký khí (GC) là một phương pháp rất hiệu quả trong việc tách rất nhiều cấu tử nhưng lại khó khăn trong việc định tính các chất có trong hỗn hợp phức tạp đó. Ngược lại, khối phổ (MS) không có khả năng tách chất nhưng lại cho phép ta định tính, dự đoán và làm sáng tỏ cấu trúc của các chất lạ từ những thông tin thu được của phổ 18 đó. Như vậy, hệ liên hợp GC/MS là một kỹ thuật ghép nối nhằm mục đích đạt được những chức năng ưu việt của cả sắc ký khí và khối phổ [14],[18],[21]. 2.3.1.7. Xác định các chất chiết được trong dược liệu bằng nước theo phương pháp chiết lạnh Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt trong chuyên luận riờng, cõn chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào trong bỡnh nún 250 - 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phỳt, cõn nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô [5]. Lượng chất chiết được bằng nước trong dược liệu được tính theo công thức: X(%) = Trong đó: P: Khối lượng dược liệu đem cân (g). a: Khối lượng cắn (g). h: Độ ẩm dược liệu (%). 2.3.2. Nghiên cứu về cao khô Bìm bìm biếc 2.3.2.1. Phương pháp điều chế cao khô Quá trình điều chế gồm hai giai đoạn: - Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp. - Giai đoạn 2: Sau khi thu được dịch chiết dược liệu, tiến hành lọc, cô đặc dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau để độ ẩm còn lại không quá 5 %. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thu được thường được tiến hành trong các thiết bị dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 0C. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy và sấy ở nhiệt độ không quá 800C. Tuyệt đối không được cô trực tiếp trên lửa [5]. 2.3.2.2. Xác định tính chất của cao bằng phương pháp mô tả cảm quan. 19 2.3.2.3. Định tính cỏc nhúm chất có trong cao bằng các phản ứng hóa học  Định tính chất béo Cân khoảng 5g cao đã nghiền nhỏ cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 10 ml CHCl3 vào, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc lấy dịch. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên trên giấy lọc, sấy nhẹ để bay hết dung môi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vết mờ trên giấy lọc [1].  Định tính nhóm caroten Lấy một ít dịch lọc ở trên cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Thêm 1-2 giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh [1].  Định tính nhựa Cân khoảng 10g cao đã nghiền nhỏ, chiết hồi lưu bằng cồn 90 0 trong khoảng 2-3 giờ. Bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Rửa cắn vài lần bằng nước sôi, mỗi lần 10ml. Cắn sau khi rửa được sấy khô, tán nhỏ để làm các phản ứng sau: - Hiện tượng huỳnh quang: Lấy 0,5g cắn, thêm 5ml dung dịch amoniac loãng. Lắc kỹ 15 phút, phản ứng dương tính nếu dịch trên không có màu vàng nhưng soi dưới ánh sáng tử ngoại lại xuất hiện huỳnh quang màu. - Hiện tượng đốt cháy: Lấy một ít cắn đốt cháy, phản ứng dương tính nếu có mùi đặc trưng của nhựa [1]. 2.3.2.4. Xác định mất khối lượng do làm khô Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận. Việc xác định mất khối lượng do làm khô không được làm thay đổi tính chất lý hóa cơ bản của mẫu thử. Cách xác định: Dùng một chộn cõn có nắp mài làm bì đựng mẫu thử. Sấy bì trong thời gian 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân xác định khối lượng bì. Làm nhỏ cao, cho vào bỡ cõn chính xác khoảng 5 g cao. Đem cao vào sấy trong tủ sấy ở áp suất thường đến khối lượng không đổi. Sau đó làm nguội cao đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay [5]. 20 Mất khối lượng do làm khô của cao được tính theo công thức: X (%) = Trong đó: m1: Khối lượng cao trước khi sấy (g) m2: Khối lượng cao sau khi sấy (g) X: Mất khối lượng do làm khô của cao (%). 2.3.2.5. Định lượng chất béo có trong cao theo chuyên luận DĐVN IV Phương pháp tiến hành tương tự như định lượng chất bộo cú trong hạt. 2.3.2.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp tiến hành tương tự như xác định acid bộo cú trong chất béo của hạt. 2.3.2.7. Xác định lượng chất chiết được trong cao bằng cồn theo phương pháp chiết lạnh Cỏch xác định: Cân chính xác khoảng 4,000g cao đã làm nhỏ cho vào trong bỡnh nún 250 - 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml cồn, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105 0C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phỳt, cõn nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô [5]. Lượng chất chiết được bằng cồn trong cao được tính theo công thức: X(%) = Trong đó: P: Khối lượng dược liệu đem cân (g). a: Khối lượng cắn (g). h: Độ ẩm dược liệu (%). 2.3.2.8. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn a. Mục đích