Tài liệu Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60 72 04 10 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này. Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014 Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS ............................................................... 3 1.1.1. Định nghĩa ................................................................................................ 3 1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược ............................................ 3 1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics............ 4 1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics ....................................... 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM .......................................... 6 1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],............................... 6 1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. ................................................... 6 1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM .................................................................. 7 1.3.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7 1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. .................................................. 8 1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24].............................................................. 8 1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. ................... 9 1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics ........10 1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây ...........................................17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................20 2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ..................................20 2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị ...............................................20 2.1.1.1. Môi trường ......................................................................................20 2.1.1.2. Hoá chất, dung môi .........................................................................22 2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................23 2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. ......................24 2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn .........................................................................24 2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................26 2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm ............................26 2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A ..........................27 2.3.2.1. Nguyên tắc chung ............................................................................27 2.3.2.2. Tiến hành .........................................................................................28 2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự .........................31 2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự .................................................31 2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit .........................................................................................................32 2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) ...................................................33 2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu ................................................33 2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA ..........................................................34 2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ........................................................................................35 2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự ..............................................................36 2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng ..........................................................39 2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum .............................39 2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A ..........................41 2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự41 2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường ........................44 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................45 3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTICS .............................................................................................45 3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A .................................46 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ .................................................51 3.3.1. Kết quả tách DNA ..................................................................................51 3.3.1.1 Tách DNA bằng WizardR Genomic DNA Purification kit của hãng Promega ..........................................................................................51 3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA ..........................................................51 3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối tượng nghiên cứu ...................................................................................52 3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự .....................................................................55 3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas ...55 3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α .......................................................56 3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ hợp ..................................................................................................57 3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp .......................................60 3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP ....................................................................62 3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar .62 3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng ..............................................................63 3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API 20A ........................................................................................................64 3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR........................................................................................................65 3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. ..................................................68 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ..................................................................................71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................74 PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA: Acid acetic AL: Acid lactic ATCC: American Type Culture Collection B. longum: Bifidobacterium longum dATP: Deoxy adenosine Triphosphat dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat dGTP: Deoxy guanine Triphosphat DNA: Deoxyribo nucleic acid dNTP: Deoxy nucleic Triphosphat dTTP: Deoxy thymin Triphosphat E. coli : Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FISH: fluorescence in situ hydridization JCM: Japan Colletion of Microorganisms LAB: Lactic acid bacteria LB Luria Bertani PCR: Polymerase Chain Reaction rRNA: Ribosome Ribonucleic acid VSV: Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu 22 Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 22 Bảng 2.3 Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng 24 Bảng 2.4 Cách đọc kết quả kit Api 20A 30 Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 34 Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách 35 Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 36 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector 38 Bảng 2.9 Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM 40 agar Bảng 2.10 Công thức tính độ đặc hiệu 42 Bảng 2.11 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR 43 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm 45 Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 48 Bảng 3.3 Kết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb 50 Bảng 3.4 Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách 51 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng PCR 53 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar 62 Bảng 3.7 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A 64 Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR trên 66 20 chủng Bảng 3.9 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum 68 Bảng 3.10 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện 69 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 8 Hình 1.2 Hình ảnh genom B. longum 8 Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 14 Hình 1.4 Hình minh họa kỹ thuật PCR 14 Hình 2.1 Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31 Hình 3.1 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A 46 Hình 3.2 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A 46 Hình 3.3 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A 47 Hình 3.4 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A 47 Hình 3.5 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A 47 Hình 3.6 Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm 48 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA 52 bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu 54 của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các 55 đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1% Hình 3.10 Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay 56 Hình 3.11 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và 57 cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100µg/ml Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp 58 mang các đoạn gen có kích thước 831bp Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI 59 Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar 63 Hình 3.15 Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A 65 Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp 67 mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum 70 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotics ngày càng được quan tâm và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotics đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotics đối với sức khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn probiotics xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Năm 2008, doanh thu từ các chế phẩm này là 15,9 tỉ USD trên toàn cầu [10]. Probiotics bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life). Năm 2002 tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới nêu rõ: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. Các probiotics thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm Saccharomyces cerevisiae… Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20% chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy, việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rất quan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng. Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa Bifidobacterium longum (B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ 1 ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics” với các mục tiêu: - Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần. - Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS 1.1.1. Định nghĩa Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỷ 19 nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu về vấn đề này. Từ đó đến nay, lĩnh vực nghiên cứu về probiotics ngày càng được quan tâm và phát triển. Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về probiotics, tuy nhiên định nghĩa của tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới năm 2002 là được sử dụng rộng rãi phổ biến nhất: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. 1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dƣợc Probiotics có các tác dụng sau: - Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng cách tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin. - Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6... - Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym. - Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd... do đó ức chế sự phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại. - Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới dạng chất thải rắn. - Giảm nồng độ cholesterol. - Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH ruột của chúng. - Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [3], [6]. 3 Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng vi sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida albicans...[3], [6]. 1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotics Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu chí rất rõ ràng, đó là: - Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non - Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa - Không gây bệnh, không sinh độc tố - Có khả năng sống và cư trú trong ruột. Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Ngoài ra, còn một số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus, Streptococcus… [3], [6], [29]. 1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lƣợng probiotics Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hướng dẫn xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của probiotics. Theo khuyến cáo của FAO (2002), tiêu chuẩn chất lượng của các probiotics bao gồm các chỉ tiêu [32]: - Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen - Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh, kháng dịch vị, kháng muối mật - Các bằng chứng về sự an toàn - Thử in vivo trên động vật và trên người 4 - Các yêu cầu về nhãn sản phẩm Năm 2009, Bộ y tế Canada cũng ban hành chuyên mục về probiotics, trong đó cũng yêu cầu định danh vi sinh vật đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen [10]. Đến năm 2011, Bộ sức khỏe và gia đình cùng với Bộ Công nghệ sinh học của Ấn Độ đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng probiotics khá đầy đủ bao gồm 9 chỉ tiêu [16]: - Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen. Trong đó chỉ ra kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi sinh vật. - Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh, kháng dịch vị, kháng muối mật - Các bằng chứng về sự an toàn trên động vật - Các thử nghiệm về tác dụng của probiotics trên động vật - Các bằng chứng về sự an toàn trên người - Thử tác dụng trên người - Các yêu cầu về nhãn sản phẩm - Các thử nghiệm xác định liều - Yêu cầu ghi nhãn - Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm. 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM 1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33], Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12 loài có mặt ở đường tiêu hóa của người. Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử. Bifidobacteria cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng fructose–6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt độ thích hợp từ 37-41oC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC, Tuy nhiên, có một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ trên 46oC như B. thermacidophilum. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của Bifidobacteria là 6,57,0. Bifidobacteria không phát triển được ở pH dưới 4,5 và trên 8,5 ngoại trừ B. thermacidophilum có thể phát triển được ở pH 4,0. Các vi khuẩn Bifidobacterium là những vi sinh vật quan trọng trong hệ đường ruột của người và chiếm 3,5 đến 10% hệ sinh vật ở ruột kết. Chúng chiếm ưu thế ở trong phân của trẻ bú mẹ, còn trong phân của trẻ bú bình chúng chiếm khoảng 40% hệ vi sinh vật. Chúng là một trong năm loài chiếm ưu thế trong hệ thống đường tiêu hóa của người, ngoài ra còn được tìm thấy ở âm đạo và khoang miệng. Ngoài ra Bifidobacteria cũng được tìm thấy trong hệ thống đường tiêu hóa của nhiều động vật như bò cái, cừu, lợn, gà, thỏ, chuột và ong mật. 1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. Bifidobacteria là những probitics phổ biến và là một phần quan trọng của hệ vi khuẩn trong đường tiêu hóa. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), có khả năng tổng hợp amino acid (acid glutamic và acid aspartic), sản xuất một số vitamin như riboflavin, thiamin, vitamin B2, vitamin B6 và biotin. 6 Ngoài ra Bifidobacteria còn có khả năng sản xuất bacteriocin (hóa chất kháng khuẩn) và các chất giống kháng sinh do đó chúng rất có lợi đối với hệ thống tiêu hóa và miễn dịch [33]. Tuy nhiên, không giống như các vi khuẩn Lactobacillus, các vi khuẩn Bifidobacterium còn sản sinh ra acid acetic, là acid béo chuỗi ngắn. Acid acetic hạn chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng như trong hệ tiêu hóa [36]. Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm. Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve… 1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM 1.3.1. Đặc điểm hình thái B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi Bifidobacterium. B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc, không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12]. 7 Hình 1.1. Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic (AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA). B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose, trehalose, dextrin, tinh bột, inulin, sorbitol, manitol, glycerol, salicin, gluconate và lactate. 1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] Nhiễm sắc thể của B. longum có chiều dài khoảng 2,26 Mb, tỷ lệ Guanine Cytosine là 65%. Hình 1.2. Hình ảnh genom B. longum 8 Trong đó: A: Kích thước gen biểu diễn trên thang Mb B: Chuỗi mã hóa: gồm 2 sợi bổ sung, các mũi tên chỉ phần chuyển tiếp GC C: Thang G-C D: Cấu tạo nguyên vẹn genom của B. longum.Vùng hình tròn biểu diễn các rARN operon, hình vuông là vùng gen của prophage, tam giác biểu diễn vị trí của 3 vùng gen giống nhau của B. longum, hình chữ nhật là vùng gen plasmid tích hợp. 1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. B. longum là một loại vi khuẩn rất cần thiết với cơ thể con người, thường gặp ở ruột và âm đạo do nó có vai trò quan trọng trong việc giữ cho hệ tiêu hóa và hệ miễn dịch con người khỏe mạnh. B. longum đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh do nó giúp tăng cường hệ miễn dịch của trẻ sơ sinh. B. longum có nhiều ở trong hệ tiêu hóa của trẻ sơ sinh và chiếm ưu thế hơn ở trẻ bú mẹ so với trẻ bú bình. Một điều dễ thấy là trẻ bú mẹ ít bị tiêu chảy và dị ứng hơn so với trẻ bú bình. Ở người lớn, B. longum giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hỗ trợ cân bằng vi khuẩn đường ruột và có thể ngăn ngừa ung thư như ung thư ruột kết. B. longum sản sinh acid lactic, do vậy làm giảm nguy cơ viêm âm đạo. Một nghiên cứu liên quan đến giảm cân, béo phì và táo bón chỉ ra rằng những người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so với những người dùng thuốc nhuận tràng [11]. Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B. longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [15]. Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa... 9 1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics 1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21]. a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B. longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau. b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỉ lệ thuận với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng real-time PCR. Như vậy bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...). Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này 10