Tài liệu Xây dựng quy trình phân tích đa hình gen cyp2c93 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y an d Ph arm NGUYỄN THỊ NGA ,V NU KHOA Y DƯỢC of M ed ici ne XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM NGÀNH Y ĐA KHOA Co py rig ht @ Sc ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Ph arm ac y ,V NU KHOA Y DƯỢC an d NGUYỄN THỊ NGA ed ici ne XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN of M CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Hồng Nhung Co py rig ht @ Sc ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN ,V NU Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Bác sĩ đa khoa của tôi không chỉ là kết ac y quả cho sự cố gắng của bản thân mà còn do nhận được sự giúp đỡ, động viên của cô thầy, bạn bè và người thân. Qua trang viết này tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – nghiên cứu vừa qua. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn tới ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – người đã tận tình chỉ bảo, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình Ph arm thực hiện đề tài khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Lệ Hằng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Các cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức khoa học, các kỹ năng phòng thí nghiệm mà còn truyền cho tôi niềm cảm hứng, lòng đam mê với nghiên cứu. ed ici ne an d Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Y Dược và Bộ môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài mã số QG.17.29 do PGS.TS. Phạm Trung Kiên chủ trì và nghiên cứu của của tôi là một phần trong đó. M Tôi xin cảm ơn tập thể nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Tôi cũng xin gửi lời tri ân tới các người of bệnh đã tham gia vào nhóm nghiên cứu của đề tài. Sc ho ol Xin gửi lời cảm ơn tốt đẹp tới nhóm sinh viên nghiên cứu thuộc bộ môn Y Dược học cơ sở đã luôn hỗ trợ kịp thời và giúp đỡ tôi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hành nghiên cứu. @ Bên cạnh đó, xin cảm ơn Quỹ học bổng PDG Trust đã luôn tin tưởng và đồng hành cùng tôi trong thời gian làm khóa luận nghiên cứu bậc đại học. Co py rig ht Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ sự yêu thương đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn là điểm tựa để tôi yên tâm hoàn thành tốt nhất khóa luận này. Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Nga ,V NU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể) Bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) CYP Cytochrome P450 DNA Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotit triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetra-acetic) INR International normalized ratio (Thời gian prothrombin đo với tỷ Ph arm an d lệ chuẩn hóa quốc tế) ac y BMI Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCR-CTPP Polymerase Chain Reaction with confronting two-pair primers ( Phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi kép) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotit polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) VKORC1 Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 (Phức hợp reductase vitamin K epoxide, tiểu đơn vị 1) Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici ne OD ,V NU DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị 5 Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số 20 Bảng 3.2 22 Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3 Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3 Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ 27 Ph arm ac y Bảng 1.1 23 an d định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm ed ici ne Bảng 4.2 27 nghiên cứu người Tây Ban Nha So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau Co py rig ht @ Sc ho ol of M Bảng 4.3 28 ,V NU DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Các giai đoạn của quá trình đông máu Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu. 20 Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21 Ph arm ac y 3 6 12 15 Hình 3.3 an d ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21 Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người. Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP. 24 Co py rig ht @ Sc ho ol Hình 4.2 22 M Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5 % Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự of Hình 3.4 ed ici ne ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA nhân dòng alen CYP2C9*3 23 25 ,V NU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 3 ac y 1.1.Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim ............................. 3 1.1.1 Quá trình đông máu ..................................................................... 3 Ph arm 1.1.2. Bệnh lý van tim............................................................................ 4 1.2.Thuốc chống đông kháng vitamin K .................................................... 4 1.3.Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol ............................. 7 1.3.1 Dược động học Acenocoumarol ................................................... 7 an d 1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol ............................................ 8 ed ici ne 1.4.Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 ......................................................... 9 1.4.1. Enzym CYP2C9 ........................................................................... 9 1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 ...................................... 10 1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu ......................................... 10 M CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 14 of 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 14 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh ............................................... 14 ol 2.1.2. Các tiêu chuẩn loại trừ .............................................................. 14 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................. 14 Sc ho 2.2. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ............................................ 14 2.2.1. Hóa chất.................................................................................... 14 2.2.2. Thiết bị ...................................................................................... 14 Co py rig ht @ 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 15 2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm ....................................... 15 2.3.2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit ...... 16 2.3.3. Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 .............................. 17 2.3.4. Kiểm tra chất lượng DNA .......................................................... 17 2.3.5. Giải trình tự DNA...................................................................... 18 2.3.6. Phân tích kết quả và xử lý số liệu .............................................. 18 2.4. Đạo đức nghiên cứu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 20 ,V NU 3.1. Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA ..................... 20 3.2. Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 .............................................. 20 3.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase ........... 21 ac y 3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA......................................... 21 3.3. Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 ............................................ 23 Ph arm CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................... 24 4.1. So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau ....................... 24 4.2. Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay ..... 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ed ici ne TÀI LIỆU THAM KHẢO py rig ht @ Sc ho ol of M PHỤ LỤC Co an d 4.3. Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol ...................................... 26 ĐẶT VẤN ĐỀ ,V NU Bệnh lý van tim là một trong các bệnh phổ biến trên thế giới cũng như tại Việt Nam, là nguyên nhân hàng đầu gây suy tim và đe dọa tính mạng của người bệnh. Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do di chứng của tổn thương van tim trong bệnh thấp tim [10]. Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống của ac y người bệnh mắc bệnh van tim đã được cải thiện đáng kể, mang lại cho họ cuộc sống gần như bình thường. Tuy nhiên, trong quá trình hoạt động các van tim nhân tạo Ph arm thường sinh ra các cục máu đông dễ gây tắc mạch, huyết khối. Do vậy, ngay sau khi thay van tim người bệnh phải sử dụng thuốc chống đông. Tại Việt Nam, thuốc chống đông kháng vitamin K đã được đưa vào sử dụng hơn 25 năm nay với biệt dược chính là Sintrom (Acenoucomarol) có hiệu quả trong phòng và điều trị huyết ed ici ne an d khối đã được chứng minh. Tuy nhiên trong quá trình sử dụng thuốc chống đông kháng vitamin K tỷ lệ gặp biến chứng khá cao, khoảng điều trị hẹp, tác dụng của thuốc chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiều yếu tố (chế độ ăn, các thuốc khác như aspirin, kháng sinh cephalosporin…) nên việc xác định liều lượng điều trị phù hợp gặp nhiều khó khăn. Nếu liều dùng thuốc sử dụng thấp thì không đạt hiệu quả điều trị nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu thậm chí gây tử vong. M Hiện nay các thầy thuốc lâm sàng điều chỉnh liều thuốc chống đông kháng vitamin K chủ yếu dựa vào xét nghiệm INR (Thời gian Prothrombin đo với tỉ lệ chuẩn hóa quốc tế- International Normalized Ratio) của người bệnh. INR yêu cầu of phải theo dõi hàng ngày để điều chỉnh liều, điều đó gây khó khăn việc này đòi hỏi Sc ho ol phải theo dõi INR hàng ngày để điều chỉnh liều, gây nên những khó khăn về thời gian và kinh tế cho người bệnh tiến hành xét nghiệm. Qua quá trình theo dõi điều trị, có sự khác nhau về kết quả điều trị người bệnh trong cùng một nhóm tuân thủ điều trị như nhau. Vậy điều gì ảnh hưởng tới kết quả INR ở những người bệnh cùng @ độ tuổi, cùng giới tính, cùng phác đồ là câu hỏi vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ. rig ht Kiểu gen thu được từ dự án giải trình tự bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào kiểu gen đang trở thành một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng. Hơn 30 Co py gen đã được tìm thấy tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chống đông máu họ Coumarin dạng uống, trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng đa hình di truyền CYP2C9*3 (c.1075 A > C) là một trong các yếu tố di truyền quan trọng ảnh hưởng đến sự đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K. Một số nghiên cứu cho thấy người bệnh mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC, và dị hợp AC cần 1 ,V NU giảm liều chống đông so với người bệnh đồng hợp kiểu dại AA [25, 42]. Do đó, việc xác định được kiểu gen này đóng một vai trò quan trọng trong tiên lượng đáp ứng thuốc điều trị ở từng người bệnh. Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di ac y truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh. Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Ph arm Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau: Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3 - an d trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim. Nội dung nghiên cứu ed ici ne Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam. - - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3. M - Giải trình tự và xác định kiểu gen của các đa hình CYP2C9*3. Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 100 người bệnh sau thay van tim ở Việt Nam. Co py rig ht @ Sc ho ol of - 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ,V NU 1.1. Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim 1.1.1 Quá trình đông máu ac y Bình thường máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái lỏng, không đông nhờ có sự cân bằng giữa hệ thống đông cầm máu và ức chế đông máu. Khi xảy ra tổn thương mạch máu, hệ thống đông cầm máu được khởi động nhằm tạo cục máu Ph arm đông khu trú tại chỗ tổn thương, làm ngừng chảy máu. Sau khi hoàn thành chức năng cầm máu, cục máu đông sẽ được tiêu đi, trả lại sự lưu thông bình thường cho lòng mạch. Toàn bộ quá trình cần có sự tham gia của các thành phần: thành mạch, tiểu cầu, các yếu tố đông máu, các chất ức chế đông máu, hệ thống tiêu sợi huyết. an d Quá trình đông cầm máu gồm các giai đoạn: cầm máu nguyên phát (tạo nút ed ici ne cầm máu tạm thời), đông máu huyết tương (tạo nút cầm máu vĩnh viễn), tiêu cục máu đông [6]. Cầm máu nguyên phát diễn ra ngay tức khắc, có hai yếu tố quan trọng là tiểu cầu (kết hợp thành nút chặn tiểu cầu) và thành mạch (hiện tượng co mạch). Tiểu cầu kết dính vào nơi thành mạch bị tổn thương trực tiếp hay thông qua of M yếu tố Von-Willebrand. Cầm máu thứ phát (đông máu huyết tương) diễn ra chậm, vài phút tới vài giờ. Sau khi ra khỏi lòng mạch 2-4 phút, máu bắt đầu đông lại. Máu đông lại là do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin. Các fibrin trùng ngưng với nhau tạo thành mạng lưới giam giữ các tế bào máu và huyết tương tạo thành cục máu đông. Sơ đồ thể hiện ở Hình 1.1. Yếu tố ngoại sinh ho ol Yếu tố nội sinh Thrombokinase Prothrombin Thrombin Co py rig ht @ Sc Các yếu tố đông máu được hoạt hóa kết hợp với Ca2+ Fibrinogen Fibrin Hình 1.1 Các giai đoạn của quá trình đông máu 3 1.1.2. Bệnh lý van tim ,V NU Bệnh lý van tim là tình trạng van tim bị bệnh lý hoặc bị tổn thương và có thể ảnh hưởng đến dòng máu chảy qua tim. Có hai loại bệnh van tim chính. Hẹp van: nghĩa là việc mở van bị giới hạn và van không mở ra hoàn toàn. Vì vậy, làm ac y hạn chế lưu lượng máu chảy qua van. Hở van: nghĩa là van không đóng đúng cách và có dòng máu phụt ngược qua van bị hở. Đôi khi còn được gọi là thiểu năng van, hoặc rò van. Bất kỳ van tim nào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi những vấn đề này. Ph arm Tuy nhiên, van hai lá và van động mạch chủ thường gặp hơn [4]. Hầu hết các vấn đề về van tim có thể được điều trị bằng thuốc, can thiệp hay phẫu thuật sửa chữa, thay thế. Tùy vào nguyên nhân gây hở van, mức độ nặng của bệnh mà bác sĩ đưa ra khuyến cáo phù hợp cho người bệnh. Các thuốc điều trị hẹp, an d hở van tim đã chứng minh có thể kiểm soát hoặc làm giảm các triệu chứng, giảm ed ici ne gánh nặng cho tim và làm chậm tiến triển của bệnh. Các thuốc thường dùng gồm thuốc lợi tiểu: giúp giảm gánh nặng cho tim; thuốc ức chế men chuyển hạ huyết áp và giảm gánh nặng cho tim; chẹn beta giao cảm: giảm nhịp tim, kiểm soát nhịp tim và hạ huyết áp; các thuốc trợ tim giúp ổn định nhịp tim và giúp tăng sức bóp cơ tim; thuốc chống đông: ngăn ngừa nguy cơ hình thành cục máu đông, đặc biệt sau phẫu thuật van tim hoặc thay van bằng vật liệu tổng hợp. of M Phẫu thuật tim hở hay can thiệp tim qua da, sẽ được bác sỹ quyết định dựa trên mức độ tổn thương van. Can thiệp qua da được áp dụng với các trường hợp van Sc ho ol bị lỗi hoặc khuyết tật van tim bẩm sinh. Sửa chữa van tim đơn giản hơn thay van tim vì tổn thương ít hơn, chi phí điều trị thấp hơn và hạn chế được nguy cơ bị nhiễm trùng sau phẫu thuật. Thay thế van tim: khi không còn khả năng sửa chữa, tiến hành thay van tim bằng van tim cơ học hoặc van tim sinh học. rig ht @ Van sinh học được làm từ mô tim động vật, mô tim của người hiến tặng hoặc sử dụng mô của chính người bệnh. Van sinh học không cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời. Van cơ học được làm bằng vật liệu tổng hợp, thiết kế để hoạt động được nhiều năm tuy nhiên van cơ học đã được nghiên cứu và chứng minh tăng nguy cơ tạo cục máu đông do đó cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời. py 1.2. Thuốc chống đông kháng vitamin K Co Sau thay phẫu thuật thay van tim biến chứng hay gặp nhất là do sử dụng các thuốc chống đông máu. Có thể nói thay van tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”, do van tim nhân tạo khi hoạt động sẽ hình thành nên 4 ,V NU các cục máu đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối. Do vậy, tất cả người bệnh sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình thành các cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch và/hoặc huyết khối. Thuốc kháng vitamin K đường uống đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm ac y 1940), có một số nhóm thuốc kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol... Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị tại Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.1. Hoạt chất Biệt dược Dạng bào chế Viên nén 4mg, vạch chia ¼ ed ici ne Sintrom Acenocoumarol Mini- Viên nén 1mg M sintrom Viên nén 2mg có vạch chia of Coumadine ol Warfarin Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày Viên nén 5mg có vạch chia Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày Viên nén 20mg, vạch chia ¼ Người lớn: Liều khởi đầu 20mg/ngày ho Coumadine Liều dùng an d DẪN XUẤT COUMARIN Ph arm Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày @ Sc DẪN XUẤT INDANEDION Previscan Trẻ em: 0,37 đến 1,4mg/kg/ngày rig ht Fluindion Co py Thuốc chống đông kháng vitamin K có khoảng an toàn rất hẹp, nếu dùng liều thấp thì không đạt hiệu quả kháng đông, nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng người bệnh. Do vậy, khi dùng thuốc chống đông kháng vitamin K cần phải nêu rõ các thông tin sau (1) thuốc cụ thể được dùng (warfarin, 5 ,V NU acenocoumarol, phenprocoumon), (2) khoảng INR đích đối với từng van, (3) INR trung bình đạt được, (4) phương pháp kiểm soát kháng đông (bác sĩ hoặc điều dưỡng kiểm soát, hoặc người bệnh tự điều chỉnh ở nhà), và (5) thời gian điều trị. Nếu người bệnh bị huyết khối van, thuyên tắc hoặc biến cố chảy máu thì phải nêu rõ INR vào thời điểm xảy ra biến cố. ac y Có nhiều loại thuốc chống đông, nhưng tại Việt Nam hiện nay được dùng nhiều nhất là thuốc kháng vitamin K do giá thành hợp lý và nằm trong danh mục được bảo Ph arm hiểm y tế chi trả. Cơ chế chống đông được miêu tả như Hình 1.2 Vitamin K oxide Reductase an d Thuốc kháng vitamin K Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) Vitamin K bị oxy hóa ed ici ne Vitamin K bị khử Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) hoạt hóa of M Carboxylase ol Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan Sc ho Chống đông kháng vitamin K tác động bằng làm giảm chức năng carboxyl hóa của vitamin K nhằm biến đổi các tiền chất thành các yếu tố đông máu gồm: yếu tố prothrombin (yếu tố II), proconvertin (yếu tố VII), yếu tố anti hemophilia B (yếu rig ht @ tố IX), và yếu tố Stuart-Prower (yếu tố X), sau cùng thành yếu tố đông máu bất hoạt. Trong quá trình chuyển đổi, vitamin K bị oxy hóa thành expoxid vitamin K. Như vậy các kháng vitamin K có tác dụng chống đông máu gián tiếp bằng cách ngăn cản tổng hợp các dạng hoạt động của nhiều yếu tố đông máu kể trên. Co py Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim. Bourguigon T. và cộng sự theo dõi 505 người bệnh thay van tim cơ học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất là tắc mạch và chảy máu có liên quan đến hoạt động của van [14]. Abhijit Trailokya và cộng sự khuyến cáo liều acenocoumarol 4-8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 đến 4 là 6 ,V NU an toàn và hiệu quả [9]. Nghiên cứu của Alec Vahanian và cộng sự đã đưa ra được những chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất mức INR cho người bệnh thay van tim cơ học từ 2,5 đến 4 [10]. Nghiên cứu của Nashimura và cộng sự trên 650 người bệnh thay van tim thấy 0,62 % có tắc mạch ac y và 0,95 % chảy máu, dùng thuốc chống đông kháng vitamin K liều 1-2,5 mg/ngày có thể hạn chế được tắc mạch [16]. Isthyak Ashmed Mir nghiên cứu trên 127 người bệnh sử dụng acenocoumarol sau thay van tim cho thấy nếu người bệnh duy trì Ph arm được mức INR từ 2,5-3,5 sẽ giảm tối đa nguy cơ tắc mạch và chảy máu [27]. Elbardissi và cộng sự nghiên cứu 861 người bệnh thay van động mạch chủ thấy rằng nếu sử dụng sớm thuốc chống đông thì hầu hết không thấy tai biến huyết khối tắc mạch sau thay van [22]. 1.3.1 Dược động học Acenocoumarol an d 1.3. Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol ed ici ne Việc hoàn thành dự án bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào bằng chứng đang nổi lên như một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng trong thời gian gần of M đây. Thuốc chống đông kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol và phenprocoumon là thuốc thường được kê đơn nhất cho việc quản lý các vấn đề liên quan đến đông máu ở người bệnh rung nhĩ, thay van tim, vùng sâu, huyết khối tĩnh mạch, phổi thuyên tắc và với những người bệnh đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình ho ol [17, 40, 25, 18]. Nếu như tại Mỹ, hơn 2 triệu người bệnh được cho warfarin đơn liều để ngăn ngừa huyết khối tắc mạch [31], thì ở Việt Nam, acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin. Sc Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí ht @ para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R (+) và S (-), trong đó R (+) acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với S (-) acenocoumarol. Cơ chế chống đông acenocoumarol cũng giống như nhóm thuốc chống đông kháng Vitamin K khác đã trình bày ở Hình 1.2 rig Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa và đạt nồng Co py độ tối đa (Cmax) 0,3 (± 0,05) mcg/mL trong 2-3 giờ. Acenocoumarol trong huyết tương đa phần ở dạng liên kết với protein, chỉ 1,52 % tồn tại ở trạng thái tự do. Sau khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thải của Acenocoumarol lần lượt là 3,9 (± 0,7) mcg mL/giờ và 10,9 (± 1,5) giờ. Thời 7 ,V NU gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian prothrombin là từ 2430 giờ [27]. Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải ra ngoài một cách nhanh chóng. Năm 1982 Tổ chức Y tế Thế giới đưa ra khái niệm INR (International ac y Normalized Ratio). Định nghĩa INR như sau: INR = (PT người bệnh / trung bình PT bình thường)ISI, trong đó ISI (International Sensitivity Index) là độ nhạy của lô thromboplastin được dùng so với thromboplastin chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới Ph arm có ISI = 1 (ISI của mỗi lô thromboplastin do nhà sản xuất cung cấp). Hiện nay INR được xem là xét nghiệm chuẩn để đánh giá mức độ chống đông bằng thuốc kháng vitamin K. Vì không thể có được một giá trị INR cố định trong suốt quá trình điều trị dài hạn, các hướng dẫn điều trị đưa ra một khoảng INR cần đạt đối với từng bệnh an d lý (ví dụ đối với người có van 2 lá cơ học khoảng INR cần đạt là 2,5-3,5). Liều ed ici ne thuốc kháng vitamin K được điều chỉnh để đạt INR trong khoảng này. Duy trì INR trong một khoảng là một công việc khó khăn. INR có thể dao động (dù liều thuốc kháng vitamin K không thay đổi) do những thay đổi của lượng vitamin K trong khẩu phần ăn (các loại thức ăn chứa nhiều vitamin K gồm bắp cải, bông cải, cải M xoăn, rau diếp, gan bò, gan lợn), do thay đổi của chức năng gan, do tương tác thuốc hoặc do người bệnh không tuân thủ điều trị. Trên thực tế, để duy trì INR ổn định trong một khoảng đích cần thực hiện xét nghiệm này một cách định kỳ, ít nhất 1 lần/tháng và mỗi khi có phối hợp thêm một thuốc có tương tác với thuốc kháng of vitamin K ol 1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol Sc ho Nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây, di truyền học là một trong các yếu tố quan trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong muốn [12, 44]. Hơn 30 gen đã được tìm thấy có tham gia vào các hoạt ht @ động và sự trao đổi chất của thuốc chống đông đường uống, trong đó CYP2C9 (một trong những gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và VKORC1 (gen mã hóa cho tiểu phần 1 của enzym khử vitamin K 2,3 epoxide thành dạng hoạt động) là hai gen quan trọng nhất ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc chống rig đông Acenocoumarol [36, 28, 43]. Co py Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều phụ thuộc vào đa hình đơn nucleotit (SNP) trên gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào SNP trên gen CYP2C9 [19, 38]. Một nghiên cứu của hiệp hội genome mở rộng cũng chỉ ra rằng VKORC1, CYP2C9 và CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ 8 ,V NU yếu chịu trách nhiệm cho sự biến thiên liều của chống đông đường uống ở người bệnh da trắng và trong đó các SNPs của gen VKORC1 và gen CYP2C9 có vai trò quan trọng nhất [38]. Xét về phương sai liều, VKORC1 được chứng minh có ảnh hưởng lớn hơn ac y CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [28, 17]. Tuy nhiên, liều lượng thuốc điều trị cho một cá thể được xác định bằng sự tương tác của các yếu tố di truyền và môi trường. Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực để phát Ph arm triển các thuật toán hướng dẫn liều điều trị dựa trên các yếu tố di truyền cũng như lâm sàng [13]. Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc thuộc họ coumarin. Đa số các công bố hiện nay nghiên cứu nhiều về dược di truyền của warfarin, an d trong khi đó những hiểu biết về dược di truyền với thuốc acenocoumarol còn rất hạn ed ici ne chế. Năm 2016, Kalpana S.R và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di truyền gen của VKORC1, CYP2C9 với liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh [28]. Tác giả Van Schie và cộng sự công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể so với thuật M toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [43]. Đây là một nghiên cứu trong chuỗi nghiên cứu về gen mã hóa cho enzym ảnh hưởng đến xác định liều thuốc chống đông. of 1.4. Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 Sc ho ol 1.4.1. Enzym CYP2C9 Cytochrom P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa phần lớn các thuốc được sử dụng trên lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (clopidogrel), chống động kinh (phenytoin)… trong đó CYP2C9 là @ enzym đóng vai trò quan trọng trong oxy hóa các hợp chất nội và ngoại sinh, đồng thời là enzym tham gia chuyển hóa thuốc acenocoumarol. ht Hàng trăm loại thuốc điều trị được chuyển hóa bởi CYP2C9 tại gan, bao gồm cả các loại thuốc có chỉ định điều trị hẹp như acenocoumarol, warfarin và phenytoin Co py rig và các loại thuốc khác như tolbutamide, losartan, glipizide, cũng như một số loại thuốc chống viêm không steroid. Ngoài ra CYP2C9 tham gia chuyển hóa các hợp chất nội sinh quan trọng như 5 -hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động, các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học. 9 ,V NU Gen CYP2C9 là một trong nhiều gen CYP2C nằm trong một khu vực có kích thước khoảng 500 kb ở vị trí số 23 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 10 (10q23.33). CYP2C9 có tính đa hình cao. Hơn 50 nucleotit polymorphisms (SNPs) đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [21]. Một số SNP đã được ac y chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng kiểu dại. Ph arm 1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 Đa hình đơn nucleotit (Single nucleotit polymorphism – SNP) là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loại nucleotit khác nhau (A, T, G hoặc C). Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1 %. Mặc dù về lý thuyết, có thể ed ici ne an d xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotit, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen [45]. Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotit này sang một nucleotit khác. Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì sẽ có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể. Nhiều SNP có thể giúp dự truyền theo gia đình [43]. M đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo dõi các bệnh lý di Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 (c.1075 A > C) hay rs1057910 là đột ho ol of biến đồng hoán A thay thế bằng C. Đột biến này làm khung đọc mARN bị ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính. Alen CYP2C9*3 là dạng alen đột biến CYP2C9 phổ biến nhất. Tại vị trí đa hình này tạo ra 3 trường hợp kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại AA, dị hợp tử AC và đồng hợp tử kiểu đột biến CC. Sc 1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu @ Tách DNA tổng số ht Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong Co py rig điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer; và thu DNA. 10 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ,V NU Nguyên lý của kỹ thuật PCR là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên hai phân tử DNA mới từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu sau mỗi chu kỳ. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, cặp mồi, dung dịch đệm, 4 loại ac y deoxyrinucleotit triphosphate (dA, dT, dG, dC), DNA polymerase. Chu trình nhiệt gồm 3 giai đoạn chính. Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95 °C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép. Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tới Ph arm nhiệt độ gắn mồi, tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào thành phần và số lượng nucleotit của cặp mồi. Giai đoạn kéo dài: Tại 72 oC, DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotit mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxynucleotit triphosphate [21, 43]. Sau n an d chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp được 2n phân tử DNA mới. Đánh giá chất lượng DNA bằng đo hấp thụ quang và điện di ed ici ne Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp đo hấp thụ quang. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Để tính nồng độ DNA cần xác of M định giá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260 nm (OD260). Trong đó, 1 đơn vị OD260 tương ứng dung dịch có nồng độ 50 ng/ml DNA sợi đôi [1]. Trong khi đó, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (OD280) do có cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan. Độ tinh sạch của dịch chiết DNA được xác Sc ho ol định thông qua tỉ số OD260/OD280 hay còn kí hiệu là OD260/280. Nếu tỉ số này trong khoảng 1,8 - 2,2, dung dịch DNA được coi là có độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm. Nếu OD260/280 > 2,2 thì dung dịch DNA đã bị biến tính hoặc phân hủy. Nếu OD260/280 < 1,8 thì dung dịch DNA có lẫn nhiều tạp chất [3]. rig ht @ Chất lượng DNA còn có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di. Nguyên lý của điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của giá thể. Dung dịch đệm là môi trường dẫn điện và tạo điện trường. Dưới tác động của điện trường, các phân tử khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ xoắn và hình dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng) Co py sẽ di chuyển qua giá thể (gel agarose hay gel polyacrylamide) với tốc độ khác nhau. Sau khi điện di kết thúc, các phân tử có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (như ethidium bromide). Độ sáng, số lượng băng, hình dạng băng (thẳng gọn hay không) là các yếu tố giúp đánh giá chất lượng DNA. Cuối cùng, 11 ,V NU kích thước băng điện di của mẫu có thể ước lượng thông qua so sánh vị trí của băng DNA với các băng đã biết kích thước trên thang chuẩn DNA [1]. Xác định kiểu gen của từng SNP bằng phương pháp giải trình tự Giải trình tự của gen là phương pháp giúp phát hiện trình tự sắp xếp của bốn ac y loại nucleotit trên phân tử DNA. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger: bổ sung các dideoxynucleotit (ddNTP) lần lượt tương ứng với mỗi loại nucleotit A – T – G – C, tức là các Ph arm nucleotit đã mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 của phân tử đường pentose. Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp mạch đơn sẽ Sc ho ol of M ed ici ne an d dừng lại tại đó và tạo ra các đoạn DNA khác nhau (mô tả trong Hình 1.3) [1]. @ Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động rig ht Trong phương pháp Sanger, phản ứng được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, trong mỗi ống gồm một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp. Ngoài ra, Co py mỗi loại ddNTP sẽ được thêm vào lần lượt mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại tương ứng. Khi tổng hợp mạch mới, dNTP sẽ tham gia, cùng với đó là ddNTP mỗi loại, nhưng với nồng độ thấp, làm kết thúc quá trình sao chép. Do đó hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ 12