Tài liệu Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ pico (chrysanthemum sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY CÚC LÁ NHỎ PICO (Chrysanthemum sp.) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Hà Thị Loan Sinh viên thực hiện : Huỳnh Thị Anh Đài MSSV : 1411100170 Lớp : 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi số liệu, nội dung, quy trình trong đồ án toàn bộ là của tôi đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hà Thị Loan. Toàn bộ đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thực nghiệm cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 12/2017-7/2018. Tất cả những nội dung, quy trình, số liệu trong đồ án chƣa đƣợc công bố trên tạp chí, hội thảo hay những diễn đàn khoa học. Đồ án đƣợc thực hiện có sự tham khảo, trích dẫn một số tài liệu và đảm bảo đúng tác quyền theo chuẩn quốc tế APA. Trong trƣờng hợp nếu có thắc mắc về nội dung, số liệu trong đồ án tôi sẵn sàng xuất trình mọi dữ liệu có liên quan đƣợc lƣu trữ tại nơi tôi thực hiện đề tài. TP. Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Anh Đài LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng Đại học Công Nghệ TP. HCM, đặc biệt là Quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH. Em biết rằng đề tài đƣợc thực hiện đã phản ánh phần nào kiến thức mà thầy cô đã biên soạn và chỉ dạy cho em trong suốt 4 năm qua, những bài học, những kinh nghiệm mà thầy cô giảng dạy đã giúp em rất nhiều. Trong suốt thời gian em làm đề tài, những giá trị này đƣợc lặp lại một lần nữa, chính vì thế em đã cảm nhận rõ hơn về một hệ thống kiến thức nền tảng. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và cán bộ viên chức trong Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tiếp nhận, tạo điều kiện để em có nơi thực hiện đề tài. Và đặc biệt em muốn gửi lời tri ân sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan, nơi cô em hiểu thế nào là sự tận tâm hƣớng dẫn, nhƣ thế nào là nghiên cứu khoa học. Ngoài ra em khám phá ra đƣợc những lý thuyết thông qua cách cô giúp em từng bƣớc giải quyết khó khăn. Em nhận ra cô đã đồng hành cùng em nhƣ thế nào khi phân công anh kĩ sƣ Trịnh Bá Uy thƣờng trực phòng thí nghiệm để hỗ trợ em. Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, mặc dù ba mẹ và các em đã không trực tiếp giúp con trong việc làm đề tài, nhƣng bằng cách này hay cách khác gia đình đã luôn động viên, lắng nghe con chia sẽ mỗi khi con gặp khó khăn, khích lệ con cố gắng, giúp đỡ con cả về tài chính và tinh thần, con xin mãi ghi khắc. Luận văn là thành quả khoa học đầu tiên của em, nên chắc chắc có những thiếu sót về nội dung. Rất mong đƣợc quý thầy cô và những nhà khoa học nhận xét, đóng góp ý kiến để em đƣợc học hỏi, rèn luyện và trƣởng thành hơn. Xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô và toàn thể ân nhân. Trân trọng. MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT....................................................................................iii DANH MỤC BẢNG............................................................................................................ iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ ....................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH................................................................................................... vi LỜI MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 4 1.1. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................ 4 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................................. 4 1.1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................. 4 1.1.3. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam .................................................................. 5 1.1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................. 5 1.1.4.1. Tính toàn năng của tế bào ................................................................................... 5 1.1.4.2. Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào ....................................................... 6 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô ................................................................................. 7 1.1.5.1. Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy: ................................................................... 7 1.1.5.2. Khử trùng mẫu cấy .............................................................................................. 7 1.1.5.3. Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô ....................................................... 7 1.1.5.4. Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh ............................................................. 7 1.1.5.5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm .............................................................................. 8 1.1.5.6. Ra rễ ex vitro........................................................................................................ 8 1.1.6. Các kỹ thuật nhân giống in vitro ........................................................................ 8 1.1.6.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chồi bất định ........................................................ 8 1.1.6.2. Nuôi cấy tế bào đơn ............................................................................................. 9 1.1.6.3. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội ................................................................................... 9 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô .......................................................... 10 1.1.8. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng ............................................................. 11 1.1.9. Tổng quan về ánh sáng .................................................................................... 13 1.2. Tổng quan về cây cúc....................................................................................... 17 1.2.1. Phân loại khoa học ........................................................................................... 17 1.2.2. Nguồn gốc, lịch sử và phân bố ......................................................................... 17 1.2.3. Đặc điểm thực vật học ...................................................................................... 19 1.2.4. Tình hình nhân giống cúc trên thế giới và Việt Nam ..................................... 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 23 i 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đồ án ........................................................... 23 2.1.1. Địa điểm ............................................................................................................ 23 2.1.2. Thời gian ........................................................................................................... 23 2.2. Vật liệu .............................................................................................................. 23 2.2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23 2.2.2. Trang thiết bị ..................................................................................................... 23 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................... 24 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................ 24 2.3. Phƣơng pháp .................................................................................................... 25 2.3.1. Pha môi trường ................................................................................................. 25 2.3.2. Hấp khử trùng................................................................................................... 25 2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 25 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico................................................................................................ 26 2.4.2. Pico Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc 27 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả năng nhân chồi mẫu cúc ....................................................................................................................... 28 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi mẫu cúc ........................................................................................................... 29 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc 30 2.5. Thống kê và xử lý số liệu ................................................................................. 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 32 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico......................................................................................................................... 32 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. .................................... 34 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. ......................... 37 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 40 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. ......................................... 43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 47 4.1. Kết luận ............................................................................................................. 47 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 48 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid BA Benzyl adenyl Cs. Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid GA3 Gibberellic acid IAA Indolylacetic acid IBA Indole -3-Butyric acid LED Light Emitting Diode MS Murashige and Skoog NAA Naphthul acetic acid RNA Ribonucleic acid TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Vitamin B1 Thiamin Vitamin B2 Riboflavin Vitamin B6 Pyridoxin iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico. ............................................................................................................ 27 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc......... 28 Bảng 2.3. Khảo sát nồng độ nƣớc dừa thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc ........ 29 Bảng 2.4. Khảo sát loại đèn LED thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc ................ 30 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hƣởng NAA đến sự ra rễ mẫu cúc .......................................... 31 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc ................................................................................................................................ 32 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico ................................... 35 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. ....................... 38 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. ............................................................................................................................................. 41 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. ....................................... 44 iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico ...............................................................................................................33 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. ...........................35 Biểu đồ 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. .................38 Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. ...........................................................................................................................41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. ................................45 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật ............................................................14 Hình 1.2. Chrysanthemum sp. ...................................................................................17 Hình 1.3. Một số hình ảnh cúc Pico ..........................................................................21 Hình 2.1. Chrysanthemum sp…………………………………………………….23 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng 5% Javel đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. ..............................................................................................................33 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico .................................36 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. ......................39 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. ...................................................................................................................................42 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. .....................................45 vi Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đời sống con ngƣời ngày nay đƣợc cải thiện kéo theo không gian sống ngày càng chất lƣợng, ngƣời ta hƣớng tới cuộc sống đầy đủ tiện nghi và phong cách. Đặc biệt là những thành phố lớn, nơi đời sống của ngƣời dân cao nhƣng lại thiếu đi vẻ đẹp hoang sơ của thiên nhiên. Chính vì thế, hoa đƣợc sử dụng nhƣ món quà tinh thần bù đắp lại thiếu sót đó. Việc trƣng bày hoa nơi công sở để bàn làm việc thêm sắc màu hay dùng hoa để thay lời nói trong những ngày lễ tết đã thu hút đam mê của nhiều ngƣời. Trong đó, hoa cúc đã chiếm một vị trí khá lớn, theo (Đặng, 2006) cho biết, với màu sắc phong phú, kích cỡ và hình dáng đa dạng, dễ điều khiển cho ra hoa tạo nguồn giống quanh năm khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa đƣợc tiêu thụ đứng thứ hai trên thế giới chỉ sau hoa hồng. Ngày nay cúc đƣợc sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, ngoài trang trí, cúc còn đƣợc dùng để làm cảnh, thờ cúng, dƣợc liệu, trà,…Ở nhiều nơi, ngƣời ta còn tin rằng cúc là biểu tƣợng của sự sống, là niềm tin, là sự bắt đầu. Cúc đƣợc đƣa vào đời sống ngƣời dân nhƣ một món quà tinh thần không thể thiếu trong những ngày đặc biệt. Nhắc đến cúc ta không thể kể đến cúc lá nhỏ hay còn gọi là cúc Pico, tên khoa học Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae, nguồn gốc Châu Á, Châu Âu. Cúc Pico là cây thân thảo, có quả bế, mọc trong bóng râm, chiều cao trung bình 2050cm. Hiện nay, cúc Pico đƣợc Dalat hasfarm nhập hạt giống về trồng, và Dalat hasfarm độc quyền với loại hoa này, ngoài ra còn có một số cơ sở nhỏ lẻ trồng bằng một vài biện pháp thủ công nhƣ giâm cành. Việc làm này cho mức độ nhân giống không cao, cây con dễ nhiễm bệnh từ cây mẹ, ngoài ra nếu không có kỹ thuật tốt sẽ làm ảnh hƣởng đến cây mẹ, dễ gây thoái hóa giống. Vì thế cần chọn một biện pháp để nhân nhanh cây mà lại giúp bảo tồn giống, không làm ảnh hƣởng đến cây mẹ là một thách thức lớn hiện nay. Hơn thế nữa, mức độ tiêu thụ cúc hiện nay khá mạnh, 1 Đồ Án Tốt Nghiệp nếu cứ duy trì những biện pháp thủ công này sẽ không đủ hàng để tiêu thụ vào các dịp lễ, tết. Đứng trƣớc thực trạng đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ Pico (Chrysanthemum sp.)” vì cúc Pico hiện nay chƣa đƣợc ai nghiên cứu nhân giống in vitro, trong khi nhân giống in vitro cho hệ số nhân giống cao giúp chủ động đƣợc nguồn giống, cây con hoàn toàn sạch bệnh, không gây ảnh hƣởng đến cây mẹ, cây sinh trƣởng phát triển đồng đều, giúp ngƣời trồng hoa đạt đƣợc hiệu quả kinh tế cao. 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. - Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định đƣợc loại đèn chiếu sáng thích hợp đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc. 3. Nội dung của đề tài - Nội dung 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 2: Khảo sát nồng độ BA đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 3: Khảo sát nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 4: Khảo sát các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 5: Khảo sát nồng độ NAA đến sự ra rễ của cúc Chrysanthemum sp. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu - Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, hay đƣợc sử dụng để làm tài liệu nghiên cứu cho các cây cúc cùng họ. Ngoài ra, những kết quả trong đề tài có thể sử dụng trong các công trình nghiên cứu khoa học hay các quy trình nhân giống các cây cùng họ. 2 Đồ Án Tốt Nghiệp - Ý nghĩa thực tiễn Việc nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ (Pico) thành công sẽ giúp chủ động nguồn giống, làm đa dạng hơn nguồn hoa cảnh của TP.HCM, nâng cao giá trị kinh tế cho ngƣời trồng. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu. Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phần mềm SAS 8.2 và chƣơng trình Microsoft Excel 2010. 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Thí nghiệm 1: Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. - Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 4: Xác định đƣợc loại đèn thích hợp đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc Pico. 7. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chƣơng sau: Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị 3 Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, có nhiều khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật, dƣới đây là một số khái niệm cơ bản: Nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng tất cả những kỹ thuật để nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trƣờng đã xác định thành phần (Trần, 1997). Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trƣờng đƣợc xác định rõ thành phần và đặt dƣới điều kiện kiểm soát (Nguyễn T. B., 2004). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, vi nhân giống hay nhân giống in vitro là phạm trù cho tất cả các loại nguyên liệu từ thực vật, đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Trịnh A. L., 2016). 1.1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay có nhiều tác giả khái quát về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, gồm có các giai đoạn chính sau đây: - Những ngƣời tiên phong trong lĩnh vực nuôi cấy mô Cha đẻ của lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào Haberlandt 1 lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng trong điều kiện vô trùng không nhận biết rằng các tế bào quang hợp, phân sinh mô không biểu hiện một cách dễ dàng và cần các chất sinh trƣởng để hoạt hóa. Vì vậy, ông chọn các loại tế bào nhƣ tế bào mô giậu, tế bào lõi, lông của nhị hoa để nuôi cấy trên môi trƣờng hữu cơ chứa glucose trong điều kiện vô trùng, và tất cả các thí nghiệm này không thành công nhƣng tồn tại trong vài tuần. Từ đó cho biết, tế bào phân sinh mô là dị dƣỡng và cần chất điều hòa sinh trƣởng để làm mất sự chuyên hóa. - Những ngƣời đóng góp cho lĩnh vực nuôi cấy mô 1 Haberlandt (1854-1945): là nhà thực vật học ngƣời Đức, cha đẻ của lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. 4 Đồ Án Tốt Nghiệp Từ năm 1934-1941 là những năm nghiên cứu để biết đƣợc thực vật duy trì cần đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chứa các chất dinh dƣỡng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng. Nhƣ Kotte và Robbins (1922) đã đặt mẫu cấy vào môi trƣờng chứa muối Pnop, glucose, và một số hỗn hợp nitrogen nhƣ asparagine, alanine và chất trích từ thịt. Năm 1934, Went và Thimann xác định IAA là chất điều hòa sinh trƣởng. Năm 1935, Snow chứng minh khi thêm IAA và vitamin B trong môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự hoạt động của tƣợng tầng. Năm 1937, Bonner khám phá trong yeast extract là vitamin B1. Năm 1941, Van Overbech sử dụng nƣớc dừa để cấy phôi Datura. Từ năm 1950-1957: là những năm đánh dấu sự thành công trong nuôi cấy mô nhƣ vào năm 1947, Lauren cấy cây một lá mầm thành công từ phôi nhũ Bắp. Năm 1953, Muir và cs. tạo ra phƣơng pháp cấy tế bào treo trong môi trƣờng lỏng. Năm 1957, Muir phát triển kỹ thuật dùng giấy để cấy tế bào đơn. Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật (môi trƣờng MS). Năm 1964-1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô nhƣ nuôi cấy tế bào trần , chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào vô tính, chuyển gen, tạo cây lai từ tế bào chất bằng dung hợp tế bào trần. Và trong giai đoạn hiện nay, các nghiên cứu đƣợc ứng dụng vào đời sống để sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu di truyền thực vật bậc cao. 1.1.3. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam Vào khoảng những năm 1977, Phân Viện Khoa học TP.HCM bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, Đà Lạt là nơi tập trung nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tƣ nhân phục vụ công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ (Nguyễn T. B., 2004). 1.1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo (Sáng, 2017), kỹ thuật nhân giống in vitro dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa 1.1.4.1. Tính toàn năng của tế bào 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Vào năm 1902, Haberlandt đã đƣa ra quan niệm là mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Còn ngày nay, theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào chuyên hóa đều chứa một lƣợng thông tin di truyền của một cơ thể trƣởng thành. Từ đó có thể thấy, từ xƣa đến nay tính toàn năng của tế bào đều có điểm chung là một tế bào bất kì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện nhất định. Đó cũng là cơ sở khoa học của kỹ thuật nhân giống vô tính. Ngƣời ta có thể biến một tế bào (hay một mẫu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi nuôi cấy dƣới môi trƣờng thích hợp để tế bào thực hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa. 1.1.4.2.Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành tế bào của mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Tính phản phân hóa của tế bào là các tế bào khi đã đƣợc phân hóa thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhƣng trong điều kiện nhất định chúng có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa giữa tế bào phôi sinh và tế bào chuyên hóa đƣợc biểu diễn theo sơ đồ sau Phân hóa tế bào Tế bào chuyên hóa Tế bào phôi sinh Phản phân hóa Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gen đƣợc hoạt hóa và một số gen khác bị ức chế. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc phân tử AND. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhƣng khi đƣợc tách rời các gen đƣợc hoạt hóa dễ dàng hơn dƣới điều kiện nhất định nên chúng có khả năng mở các gen để hình thành cá thể mới. Đây là nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 6 Đồ Án Tốt Nghiệp 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô Theo (Trịnh A. L., 2016), có các giai đoạn sau: 1.1.5.1. Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy: Cây mẹ đƣợc lựa chọn phải sạch bệnh, sinh trƣởng và phát triển tốt, không dị dạng. Khi lấy mô cấy cần chú ý đến tuổi sinh lý của cơ quan lấy mẫu; chất lƣợng, vị trí, kích thƣớc của cơ quan lấy mẫu. 1.1.5.2. Khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy sau khi lựa chọn đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, sau đó khử trùng bằng các chất khử trùng hóa học nhƣ calcium hypochloride, chlorua, thủy ngân,… Khử trùng bên ngoài tủ cấy. Sau đó đƣa mẫu cấy vô tủ cấy vô trùng và khử trùng bên trong tủ cấy. 1.1.5.3. Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô - Tạo thể nhân giống Mẫu sau khi đƣợc khử trùng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để tạo thể nhân giống. Có 2 thể nhân giống là thể chồi và thể cắt đốt. Đối với loài không có khả năng nhân giống, ngƣời ta thƣờng nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. - Tăng sinh mô: gồm có các phƣơng pháp sau đây Tạo phôi sôma Tăng cƣờng sự phát triển chồi bên Sự phát triển chồi bất định - Nhân giống in vitro Vật liệu nuôi cấy là thể chồi, môi trƣờng nuôi cấy giống môi trƣờng tạo thể chồi, nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng cần giảm thấp để quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cây trẻ hóa, quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. 1.1.5.4. Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh 7 Đồ Án Tốt Nghiệp - Ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ Sau khi nhân giống đủ số lƣợng chồi, ta tách chồi ra nuôi cấy sang môi trƣờng ra rễ có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng, khoáng đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin,… và nuôi dƣỡng ở điều kiện thích hợp để tái sinh cây hoàn chỉnh. - Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn cây có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra vƣờn. Cây cần khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trƣờng bình thƣờng. Ở giai đoạn này, các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích ra rễ. Điều kiện nuôi cấy gần giống với bên ngoài môi trƣờng. 1.1.5.5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm Cây có đủ bộ phận đƣợc chuyển qua phòng huấn luyện cây con, với điều kiện, nhiệt độ gần giống với môi trƣờng tự nhiên để cây thích nghi. Sau đó, cây trong bình nuôi cấy khi lấy ra đƣợc rửa sạch agar và đặt trong rổ có lót giấy báo, phun thuốc diệt nấm, đặt nơi thoáng mát, độ ẩm cao, độ chiếu sáng thấp,… Đây là giai đoạn quan trọng, vì cây chuyển từ in vitro ra vƣờn ƣơm rất dễ chết do sự khác biệt về điều kiện sống. 1.1.5.6. Ra rễ ex vitro Trong nhiều trƣờng hợp các loài đã nhân chồi thành công trong điều kiện in vitro, dễ ra rễ trong điều kiện tự nhiên thì rút ngắn các giai đoạn của vi nhân giống mà vẫn đảm bảo tỷ lệ cây con sống sót cao khi chuyển ra vƣờn ƣơm, có thể chuyển các chồi in vitro ra điều kiện ex vitro, cấy chồi vào các cơ chất ẩm nhƣ: than bùn, vỏ cây, khoáng chất, đất, cát,… để giúp chồi ra rễ. 1.1.6. Các kỹ thuật nhân giống in vitro Theo (Kiên, 2003) có các kỹ thuật sau: 1.1.6.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chồi bất định Một trong những phƣơng thức sinh trƣởng để đạt đƣợc mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trƣờng khoáng có 8 Đồ Án Tốt Nghiệp bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thích hợp…Từ đỉnh sinh trƣởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vƣơn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con đƣợc chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thƣờng. - Nuôi cấy chồi bất định Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tƣơng tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên vết cắt của mẫu vật. - Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhah khi môi trƣờng có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng không có chất kích thích tạo mô sẹo. 1.1.6.2. Nuôi cấy tế bào đơn Khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn đƣợc lọc và nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt để tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trƣờng lỏng tế bào đơn đƣợc tách ra và trải trên môi trƣờng thạch. Khi môi trƣờng thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trên môi trƣờng thạch có tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 1.1.6.3. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa. Từ cuối những năm 1970 đã nhận đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đƣờng tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông 9 Đồ Án Tốt Nghiệp qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Phƣơng pháp tạo cây đơn bội kép và phƣơng pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao. 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô Theo (Nguyễn A. P., 2011), có các yếu tố sau: - Kiểu di truyền: Cây hai lá mầm tái sinh tốt hơn cây một lá mầm, hạt trần rất khó tái sinh. Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriacea và Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trƣờng tự nhiên thì chúng hầu nhƣ dễ tái sinh trong in vitro. Cũng có trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe farinacea hầu nhƣ không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhƣng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trƣởng có trong môi trƣờng nuôi cấy. - Tuổi của cây: Khi cây già đi, khả năng tái sinh cũng giảm theo, các mô ở cây non có khả năng tái sinh mạnh hơn. Khi mô phân sinh và chồi đỉnh đƣợc tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ đặc tính già hay non. Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già đƣợc trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. - Tuổi của mô và cơ quan: Những mẫu non và mềm dễ nuôi cấy hơn mô cứng, nhƣng cũng có trƣờng hợp ngoại lệ. Mẫu cấy từ cuống lá non tái sinh tốt hơn mẫu cấy từ cuống lá già. Khả năng tái sinh của những loài khác nhau thì khác nhau. - Tình trạng sinh lý: Các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dƣỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn các chồi đã vƣợt qua giai đoạn này. - Vị trí của mẫu cấy trên cây: 10 Đồ Án Tốt Nghiệp Những chồi tách từ vị trí thấp trên cây dễ tái sinh trên môi trƣờng in vitro hơn, chồi gốc tăng trƣởng nhanh hơn chồi nách. Mô sẹo phát sinh từ những phần khác của cây đều có phản ứng in vitro giống nhau. - Kích thƣớc mẫu cấy: Tế bào, cụm tế bào, mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trƣởng hơn thân, lá, củ. Các phần tách khỏi cây tự cung cấp chất dinh dƣỡng và hormone, do đó mẫu càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Củ, thân là những nơi dự trữ nhiều chất dinh dƣỡng dễ tái sinh trên môi trƣờng in vitro hơn những mẫu có ít chất dinh dƣỡng. Ở những mẫu bị cắt, phần trăm tổn thƣơng cũng ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh. - Vết thƣơng: Bề mặt tổn thƣơng giúp hấp thu chất dinh dƣỡng và tạo ra ethylen nhiều hơn. Ngoài ra, có thể hình thành rễ bất định bằng vết thƣơng. 1.1.8. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng Đến nay đã có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều bao gồm những nhóm chất chính sau đây: - Các loại muối khoáng - Nguồn cacbon hữu cơ - Vitamin - Chất điều tiết sinh trƣởng - Nhóm chất tự nhiên - Chất làm đông môi trƣờng a. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô, tế bào thực vật đƣợc phân chia thành hai nhóm theo hàm lƣợng sử dụng: nhóm nguyên tố đa lƣợng và nhóm nguyên tố vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng đa lƣợng 11