Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng bacoside a3 trong dược liệu rau đắng biển

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VƯƠNG HÙNG MẠNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BACOSIDE A3 TRONG DƯỢC LIỆU RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VƯƠNG HÙNG MẠNH Mã sinh viên: 1301272 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BACOSID A3 TRONG DƯỢC LIỆU RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp 2. TS. Trần Nguyên Hà Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 2. Khoa CNCX – Viện Dược Liệu HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung quanh. Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS. Nguyễn Tuấn Hiệp, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Trần Nguyên Hà, người đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện Dược Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp đỡ em. Chân thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại viện. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động viên khích lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm nay. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Vương Hùng Mạnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................................... DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................................. ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2 1.1. Tổng quan về loài Bacopa monnieri ........................................................................... 2 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri ................................... 2 1.1.2. Bộ phận sử dụng ........................................................................................................ 2 1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................................. 2 1.1.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................................... 5 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC ............................................................................ 7 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động ................................................................................................ 7 1.2.2. Cấu tạo HPLC ........................................................................................................... 8 1.3. Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3 ........... 10 1.3.1. Phương pháp chiết xuất .......................................................................................... 10 1.3.2. Phương pháp phân tích định lượng ....................................................................... 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 15 2.1. Đối tượng và hóa chất, thiết bị ................................................................................. 15 2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................. 15 2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất .............................................................................................. 15 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................................... 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 16 2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích .......................................................................... 16 2.2.2. Thẩm định phương pháp......................................................................................... 16 2.2.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................ 16 2.2.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................ 16 2.2.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................................ 17 2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................. 17 2.2.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 18 2.2.2.6. Độ đúng ................................................................................................................. 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 20 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ......................................................................... 20 3.1.1. Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển ........................................... 20 3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký ............................................................................. 23 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ......................................................................... 27 3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................... 27 3.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................... 28 3.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................................... 29 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................... 30 3.2.5. Độ lặp lại .................................................................................................................. 31 3.2.6. Độ đúng .................................................................................................................... 31 3.3. Ứng dụng phương pháp trong định lượng Bacosid A3 trong một số mẫu rau đắng biển ........................................................................................................................... 32 3.4. Bàn luận ...................................................................................................................... 33 3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu rau đắng biển ở Việt Nam ...... 33 3.4.2. Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển ........................................... 34 3.4.3. Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp .......................................... 34 3.4.4. Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu thực..................................................... 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 39 PHỤ LỤC 1 ........................................................................................................................... PHỤ LỤC 2 ........................................................................................................................... PHỤ LỤC 3 ........................................................................................................................... DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt AOAC Nội dung đầy đủ Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official analytical chemists) ACN Acetonitrile BA3 Bacosid A3 EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) MeOH Methanol PDA Detector mảng diod RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Realtive Standard Deviation) SKĐ Sắc ký đồ TFA Acid Trifluoroacetic TLC Sắc ký lớp mỏng UV Tử ngoại (Ultraviolet) kl/kl Khối lượng/ khối lượng kl/tt Khối lượng/ thể tích tt/tt Thể tích/ thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Nội dung Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là Trang 4 jujubogenin trong rau đắng biển 1.2 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là 4 pseudojujubogenin trong rau đắng biển 1.3 Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển 5 1.4 Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo 10 3.1 Kết quả định lượng Bacosid A3 khi chiết bột rau đắng biển với 20 MeOH và EtOH 3.2 Chương trình Gradient của pha động 24 3.3 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống 27 3.4 Thời gian lưu mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn 28 3.5 Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Bacosid A3 29 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 31 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 32 3.8 Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu dược liệu rau đắng biển 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Nội dung Hình Trang 1.1 Rau đắng biển – Bacopa monnieri 2 1.2 Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 3.1 Kết quả khảo sát nồng độ cồn 21 3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết 21 3.3 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử dịch chiết bã dược 22 liệu sau 3 giờ chiết Soxhlet với hệ pha động ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68) 3.4 Quy trình chiết Bacosid A3 trong rau đắng biển 23 3.5 Sắc ký đồ (a) Bacopasid I; (b) Bacosid A3 chuẩn và (c) mẫu thử với 24 hệ pha động ACN và đệm phosphat (pH = 2,3) theo chương trình dung môi 1 3.6 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động 25 ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (35:65) 3.7 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động 26 ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68) 3.8 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn; (b) mẫu thử và (c) mẫu thử thêm 28 chuẩn với hệ pha động ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68) 3.9 Sắc ký đồ của dãy dung dịch chuẩn Bacosid A3 nồng độ 25-500 29 (µg/ml) 3.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ Bacosid A3 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng. Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức ăn, rau đắng biển được sử dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô. Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000 mg, … Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi là nhờ vào hoạt chất Bacosid với 5 loại chính có trong rau đắng biển gồm: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid II, Bacopasid X và Bacopasaponin C. Trong đó, Bacosid A3 là một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối lớn (chiếm 0,14-0,85% (kl/kl) ở loài B.monnieri tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ, đồng thời chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A. Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng Bacosid trong rau đắng biển còn chưa được tiêu chuẩn hóa. Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam IV chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này. Do đó, việc xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các Bacosid trong rau đắng biển là rất cần thiết. Theo Dược điển Mỹ (USP 38) và Dược điển Ấn Độ (IP 2010), chất chuẩn Bacosid A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại Bacosid chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong rau đắng biển. Trong khuôn khổ khóa luận này, do bị giới hạn về thời gian, kinh tế nên chúng tôi chỉ có thể định lượng hàm lượng một thành phần Bacosid A3, bước đầu làm cơ sở để định lượng 4 Bacosid còn lại. Vì vậy, đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Bacosid A3 trong dược liệu rau đắng biển (Bacopa monnieri)” được thực hiện với mục tiêu:  Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển bằng phương pháp HPLC.  Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu rau đắng biển thu hái ở Việt Nam. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về loài Bacopa monnieri 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học [33]: Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta); Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida); Bộ: Hoa Môi (Lamiales); Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae); Chi: Bacopa; Loài: monnieri (L.); Cây thảo, sống dai có thân nhẵn, mọc bò Hình 1.1: Rau đắng biển - Bacopa monnieri [33] mọc đứng, không lông. Lá mọc đối, không cuống, thuôn hình muỗm, dài 8 – 12 mm, rộng mang rễ dài 10 - 40 cm, vị rất đắng. Cành mềm 3 – 5 mm, gân chính giữa hơi khó thấy. Hoa lưỡng tính, mọc riêng lẻ ở nách lá, có cuống dài 1 cm. Năm lá đài không đều, cao 5 – 6 mm, 5 cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống. Bốn nhị, bầu không lông. Quả nang, hình trứng, nằm trong đài, có mũi, nhắn, có vòi tồn tại. Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4 – 6 [3], [4], [6]. Rau đắng biển là loài cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, ven bờ ruộng, bãi cỏ, bờ mương, cây ra hoa quả hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt (Hình 1.1). Phân bố: Cây được trồng nhiều ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam [3]. 1.1.2. Bộ phận sử dụng Thu hái phần trên mặt đất, dùng tươi hay phơi khô [3]. 1.1.3. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri gồm các triterpen tự do, saponin, alkaloid, flavonoid và các phenylethanoid glycosid. 2 a. Saponin triterpenoid Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B. monnieri chính là các saponin có cấu trúc nhân dammaran với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin (Bảng 1.1 và 1.2). Nghiên cứu về thành phần hóa học đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của 2 saponin là Bacosid A và Bacosid B [9], [12]. Sau đó, các thành phần hóa học chính có tác dụng cải thiện trí nhớ của B.monnieri đã được phân lập và xác định công thức. Các thành phần đó là Bacosid A và Bacosid B được phân lập đồng thời cùng nhau, chỉ khác nhau ở độ quay cực [11]. Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng Bacosid A và Bacosid B không hoàn toàn là đơn chất mà là hỗn hợp của các saponin [21]. Trong đó, Bacosid A cũng là thành phần hóa học trong rau đắng biển được nghiên cứu nhiểu nhất. Hàm lượng Bacosid A trong các bộ phận của rau đắng biển là khác nhau với hàm lượng cao nhất ở thân (9,54 mg/g) và thấp nhất ở hoa (1,91 mg/g) [27]. Tuy nhiên, các thông tin cụ thể về hoạt tính sinh học của từng Bacosid vẫn chưa được làm rõ [22]. Bacosid A là hỗn hợp của 4 triglycosidic saponin: Bacosid A3, Bacopasid X (jujubogenin), Bacopasid II và Bacosaponin C (pseudojujubogenin) với khoảng hàm lượng lần lượt là 0,14-0,85%; 0,050,72%; 0,12-0,69% và 0,05-0,44% (kl/kl) khi thu hái tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ [8], [13]. Trong đó, Bacosid A3 có công thức phân tử là: C47H76O18, khối lượng mol: 929,11 g/mol, là một chất bột trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy từ 244-250oC, có tính phân cực mạnh và hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như: MeOH, EtOH [39]. Bacosid B là một hỗn hợp các aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như: bacopasid N1, bacopasid IV (jujubogenin), bacopasid N2, bacopasid V (pseudojujubogenin) [16]. Quy trình chiết xuất Bacosid trong rau đắng biển của một số tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng 1.4. Ngoài ra, D-manitol và một saponin là hersaponin cũng đã được Sastri và cộng sự phân lập năm 1959 [37]. 3 Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển [46] Jujubogenin STT Tên chất 1 Bacosid A3 R β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-{α-L-arabinofuranosyl(1→2)}-O-(β-D- glucopyranosyl) 2 Bacopasid N1 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl 3 Bacopasid IV β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl 4 Bacopasid X α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl- (Bacopasaponin C (1→3)}- α-L-arabinofuranosyl isomer) Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là pseudojujubogenin trong rau đắng biển [46] Pseudojujubogenin STT Tên chất 5 Bacopasaponin C R β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{ α-L-arabinofuranosyl(1→2)}- α-L-arabinofuranosyl 6 Bacopasid N2 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl 7 Bacopasid II α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{ β-D-glucopyranosyl(1→3)}- β-D-glucopyranosyl 8 Bacopasid V β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl 4 b. Flavonoid Ngoài các saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, Flavonoid được tìm thấy trong rau đắng biển là Luteonin và Apigenin (Bảng 1.3). Một số nhà khoa học đã tiến hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau của rau đắng biển được thu hái tại các vùng khác nhau tại Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu được kết quả hàm lượng Luteolin trong lá B.monnieri thu hái tại vùng Bhayander, Maharashtra là 0,1691 ± 0,0024 mg/ 500 g; trong khi hàm lượng Luteolin định lượng trong thân B.monnieri thu hái tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500 g [45]. Ngoài ra, hàm lượng Luteolin và Apigenin được định lượng trong dịch chiết MeOH của B.monnieri lần lượt là 0,22% và 0,45% [31]. Luteolin Apigenin Bảng 1.3: Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển c. Các thành phần khác: Ngoài ra, rau đắng biển còn chứa các alkaloid như Hydrocotylin, Brahmin, Herpestin và các glycosid như Asiaticosid, Thanakunicid [32], [37]. 1.1.4. Tác dụng dược lý a. Theo y học cổ truyền: Rau đắng biển có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng. Toàn cây rau đắng biển được dùng chữa suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, thao cuồng, mất tiếng, khản tiếng, viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí đái, viêm gan, thấp khớp, rắn cắn và bệnh ngoài da như da sưng dày lên như da voi, lở, nhọt độc, ghẻ. Ngày 6-12 g dạng thuốc sắc, dùng ngoài không kể liều lượng. Ngoài ra, rau đắng biển có thể được dùng như rau sống hoặc nấu chín ăn [3]. 5 Dịch chiết Brahmin từ cây rau đắng biển và một số dược liệu khác được sử dụng trong nền y học cổ truyền Ayurvedic (Ấn Độ) hàng thế kỷ nay như một thuốc bổ não để tăng cường trí nhớ, khả năng học tập và sự tập trung, giảm lo âu, trầm cảm và động kinh, suy giảm nhận thức [34]. b. Theo y học hiện đại: Theo các nghiên cứu trên thế giới, rau đắng biển có một số tác dụng dược lý chính như sau:  Tác dụng chống vi khuẩn: Tác dụng chống vi khuẩn của dịch chiết B.monnieri trong các dung môi khác nhau đã được đánh giá bởi Sampathkumar và cộng sự năm 2008. Kết quả cho thấy dịch chiết trong Diethyl ether có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus aureus, trong khi dịch chiết bằng Ethyl acetat chống được vi khuẩn Gram (-) (Proteus vulgaris) [36]. Ngoài ra, dịch chiết cồn có tác dụng diệt các loại nấm như Aspergillus niger, Candida albicans [20].  Tác dụng chống ung thư: Dịch chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào nuôi cấy sarcoma-180 bằng cách tác động lên quá trình sao chép DNA [15].  Tác dụng trên hệ tim mạch: Alkaloid Bahmin được chiết từ rau đắng biển với liều 0,5 mg/ kg có tác dụng hạ huyết áp ở mèo, với liều nhỏ hơn gây tăng huyết áp nhẹ do co mạch và kích thích cơ tim. Tổng các thành phần chiết xuất từ B.monnieri có tác dụng trợ tim, co mạch, ức chế hệ thần kinh – cơ [23].  Tác dụng trên hệ thần kinh: + Tác dụng chống lo âu, trầm cảm: Các thành phần bacosid A và B, bacosid I, bacosid II, và bacopasaponin C đã được chứng minh là có hoạt tính chống trầm cảm trên mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình treo đuôi chuột trong nghiên cứu của Zhon và cộng sự năm 2007 [46]. Ngoài ra, Hersaponin - một loại glycosid được phân lập từ B.monnieri, đã được chứng minh là có tác dụng an thần, chống lo âu [23]. + Tác dụng chống động kinh: Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi Dhanasekaran và cộng sự năm 2007 cho kết quả về hiệu quả của dịch chiết B.monnieri trong việc làm giảm các triệu chứng của động kinh [14]. Một thí nghiệm khác nghiên cứu 6 về động kinh thùy thái dương (một hội chứng động kinh thường gặp) cho thấy hiệu quả điều trị của B.monnieri và Bacosid A trên chuột bị động kinh [24]. + Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: B.monnieri có tác dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não [44]. Nghiên cứu việc sử dụng sản phẩm từ B.monnieri trong điều trị rối loạn khả năng tập trung ở trẻ em (ADHD – Attention-deficit hyperactivity disorder) được tiến hành kiểm soát ở đại học Y dược BRD tại Gorakhpur, kết quả thu được cho thấy sự gia tăng đáng kể trong việc nhắc lại câu văn, tư duy logic và học tập theo cặp trong cả 19 trẻ được sử dụng Bacopa [38].  Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết cồn của lá B.monnieri tăng nồng độ hormone tuyến giáp T4 (tới 41%) ở chuột đực thông qua tác dụng cường giáp theo kết quả nghiên cứu của Kar và cộng sự năm 2002 [19].  Tác dụng trên hệ hô hấp: Dịch chiết của B.monnieri đã được chứng minh có tác dụng giãn phế quản trên chuột bị gây mê [10].  Tác dụng trên hệ tiêu hóa: Dịch chiết của cây B.monnieri sạch có tác dụng bảo vệ và chữa lành vết loét đường tiêu hóa trên nhiều mẫu động vật khác nhau. Cơ chế tác dụng được cho là gia tăng các yếu tố bảo vệ niêm mạc (bài tiết chất nhày, tăng tuổi thọ của tế bào niêm mạc, chống oxy hóa,…), giảm các yếu tố tấn công (sự bài tiết acid, pepsin) [35]. Dịch chiết B.monnieri có khả năng chống loét đại tràng bằng cách ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori, tăng nồng độ prostaglandin E và Prostaglandin I2 ở đại tràng [17]. Ngoài ra, khi uống dịch chiết cồn của B.monnieri sẽ tạo ra tác dụng bảo vệ gan bằng cách chống lại sự suy giảm các emzyme chống oxy hóa ở gan (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase) theo nghiên cứu của Sumathy và cộng sự năm 2001 [40]. 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó, mẫu lỏng hoặc rắn được hòa tan thành dung dịch thích hợp rồi đưa đi qua cột sắc ký bởi pha động (chất lỏng). Tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào các tương tác: chất tan – pha tĩnh, chất tan – pha động và pha động – pha tĩnh, do đó các thành phần khác nhau trong dung dịch 7 chất phân tích sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau dẫn đến sự phân tách. Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lí số liệu [1], [5], [18]. 1.2.2. Cấu tạo HPLC Nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [1], [2], [5], [18]:  Hệ thống cấp pha động;  Bơm sắc ký lỏng;  Bộ phận tiêm mẫu;  Cột;  Detector;  Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu. 1.2.2.1. Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [25] Hệ thống cấp pha động Pha động trước khi đưa vào bình chứa pha động cần được lọc qua màng lọc 0,45µm và loại bỏ khí hòa tan trong pha động (ví dụ: N2, O2) bằng cách: rung siêu âm, sục khí trơ Heli có khả năng hòa tan thấp trong pha động. 1.2.2.2. Bơm sắc ký lỏng Hệ thống bơm sắc ký phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar (407 atm), tốc độ dòng từ 0,1 – 9,999 ml/phút. Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp 2 chế độ vận hành của pha động bao gồm:  Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.  Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi). 8 1.2.2.3. Bộ phận tiêm mẫu Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 µL – 100 µL. Có 2 cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu tự động. Khi tiêm bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. 1.2.2.4. Cột Một máy HPLC bình thường có hai cột: cột phân tích và cột bảo vệ.  Cột phân tích: - Loại cột phân tích phổ biến nhất hiện nay được làm bằng thép không gỉ; ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo. - Chiều dài cột: 10 – 30 cm. - Đường kính trong cột: 4 – 10 mm. - Hạt nhồi cột: đường kính 3-10 µm; có thể được chế tạo từ silica, nhôm oxit, polymer xốp, nhựa trao đổi ion. Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết với bề mặt.  Lò cột: đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột. Cột bảo vệ: - Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích, nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường; đặt trước cột sắc kí để loại bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích. 1.2.2.5. Detector Là một bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector phù hợp. Một số loại detector hiện đang được sử dụng:  Detector quang phổ: Detector được sử dụng phổ biến nhất, hoạt động dựa trên sự đo lường quang phổ, bao gồm sự hấp thụ UV-VIS và sự phát huỳnh quang. Cấu tạo của Detector loại này gồm: nguồn sáng, bộ lọc ánh sáng, cách tử, buồng đo, mảng Diod. - Detector hấp thụ UV-VIS: áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến. Khi dùng detector này quang phổ thu được là đồ thị của độ hấp thụ biến thiên theo thời gian rửa giải. Giới hạn phát hiện từ 100pg – 1ng chất phân tích. Thiết bị có sử dụng thêm mảng diod trong quá trình đo phổ có thể ghi lại 9 toàn bộ phổ, sắc ký đồ 3 chiều biểu thị độ hấp thụ là một hàm theo bước sóng và thời gian rửa giải. Detector huỳnh quang (RF): sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát - huỳnh quang (tính chọn lọc). Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang, cần tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang.  Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất đường.  Detector điện hóa: Detector hoạt động dựa trên nguyên tắc đo điện thế, độ dẫn, điện phân,… 1.3. Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3 1.3.1. Phương pháp chiết xuất Quy trình chiết xuất Bacosid trong dược liệu rau đắng biển của một số tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng sau: Bảng 1.4: Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo Tài liệu Quy trình chiết xuất tham khảo [24] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được phơi khô, nghiền thánh bột. + Dung môi sử dụng: EtOH 90%, Aceton. + Số lần chiết: 3 lần. [26] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước, phơi khô và nghiền thành bột thô. + Dung môi sử dụng: Hexan, Aceton, MeOH, n-Butanol, nước. [28] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước và sấy khô ở 50oC/ 12 giờ. + Dung môi sử dụng: MeOH. [29] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và phơi khô. + Dung môi sử dụng: EtOH 95%. [30] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và ép loại bỏ nước, phơi khô. + Dung môi sử dụng: EtOH 95%, MeOH. 10 [41] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột, rây qua rây 355. + Dung môi sử dụng: MeOH 70%. [43] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột mịn. + Dung môi sử dụng: MeOH. Nhận xét: Các phương pháp chiết được sử dụng để chiết Bacosid trong rau đắng biển là chiết ngâm, chiết hồi lưu, chiết Soxhlet hay chiết bằng sóng siêu âm. Các dung môi sử dụng chiết Bacosid trong các tài liệu tham khảo chủ yếu là MeOH và EtOH. Ngoài ra, các nghiên cứu [24], [26] trong quá trình chiết có sử dụng thêm n-Butanol, Aceton hoặc Hexan để loại bỏ chất béo và tạp. 1.3.2. Phương pháp phân tích định lượng Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng bacosid trong rau đắng biển. Một số chương trình chạy sắc ký trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như sau:  Theo tác giả Navneet Kumar M. [28]: - Điều kiện sắc ký: + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm + Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Detector: PDA 205 nm - Kết quả: Thời gian lưu của Bacosid A3: 14,805 phút  Theo Phrompittayarat W. và cộng sự [30]: - Điều kiện sắc ký: + Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm + Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18 + Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M + Thể tích tiêm: 20µL + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: PDA 205 nm 11 - Kết quả: + Hai thành phần có hàm lượng lớn nhất trong rau đắng biển là Bacopasid II (0,27 – 0,59%, kl/kl) và Bacopasid I (0,35 – 0,71%, kl/kl). + Hàm lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển là 0,07-0,34% (kl/kl).  Theo Sivaramakrishna C. và cộng sự [39]: - Điều kiện sắc ký: + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30oC + Thể tích tiêm: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm - Kết quả: Bacosid A3 chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A.  Dược điển Anh (BP 2016) đưa ra điều kiện [41]: - Điều kiện sắc ký: + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 : 685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric + Dung môi pha mẫu: MeOH 70% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30oC + Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm - Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacopasid II lần lượt là: 1,4; 0,9; 1,2; 1,3.  Dược điển Ấn Độ (IP 2010) đưa ra điều kiện [42]: - Điều kiện sắc ký: + Cột thép không gỉ C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động (Gradient): ACN : đệm H3PO4 (pH = 2,8) theo chương trình: 12