Tài liệu Xây dựng qui trình công nghệ chế tạo vật liệu oxit sắt nanô và phức nhằm khảo sát khả năng ứng dụng trong y sinh học

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHỊÊN CỨU KHCN CẤP SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH 2006-2008 Tên đề tài: XÂY DỰNG QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO VẬT LIỆU OXIT SẮT NANÔ VÀ PHỨC NHẰM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG Y SINH HỌC Chủ nhiệm đề tài: GS. TSKH NGUYỄN CÔNG HÀO Cơ quan chủ trì: Phân viện Hóa học các HCTN tại TP HCM TP HỒ CHÍ MINH 2008 1 BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC& CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH 1. Tên đề tài: Xây dựng qui trình công nghệ chế tạo vật liệu oxit sắt nano và phức nhằm khảo sát khả năng ứng dụng trong y sinh học 2. Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH Nguyễn Công Hào 3. Cơ quan chủ trì đề tài: Phân Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên tại TP Hồ Chí Minh 4. Cơ quan quản lý đề tài: Sở Khoa học và Công nghệ TP Hồ Chí Minh 5. Danh sách các cán bộ tham gia chính trong đề tài: TT 1 Họ và tên Học vị/chức danh KH TS Ngành chuyên môn 2 Nguyễn Cửu Thị Hương Giang Trần Hòang Hải TS, PGS 3 Đòan thị Kim Dung ThS Vật liệu nanô Phân viện Vật lý 4 Phạm Đình Hùng TS,PGS Hóa học hữu`cơ PTN nanô ĐH QG TP HCM 5 Lê Quốc Minh TS,PGS Vật liệu công Giám đốc nghệ nanô và ứng dụng TS, Bác sỹ Trưởng Khoa TS Dược sỹ Liên Hiệp KHSX ThS ĐH KHTN PV HH CHCTN 6 Phạm Ngọc Hoa 7 Nguyễn Phương Dung 8 Nguyễn Phương Nam Sinh học phân tử Vật lý vật liệu y sinh Đơn vị công tác Tin Sinh học Phân viện Hóa HCTN Phân viện Vật lý IMAG Bệnh viện Chơ Rẫy TP HCM ĐH Y dược TP HCM 2 MUC LUC Trang PHẦN TỔNG QUAN 1 PHẦN 1: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP OXIT SẮT KÍCH THƯƠC NANÔ ỨNG DỤNG LÀM TĂNG ĐỘ NÉT HÌNH ẢNH TRONG CỘNG HƯƠNG TỪ 5 I.1. Mở đầu 6 I.2. Tổng hợp các hạt nanô oxit sắt Fe3O4 I.2.1. Các thiết bị thực nghiệm 6 I.2.2. Hóa chất 6 I.2.3. Qui trình tổng hợp hạt 6 I.3. Kết quả thực nghiệm 8 I.3.1. Phổ nhiễu xạ tia X 8 I.3.2. Đường cong từ hóa 9 I.3.3. Ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) 11 I.4. Tổng hợp chất lỏng từ 14 I.4.1. Thiết bị thực nghiệm 14 I.4.2. Hóa chất 14 I.4.3. Quy trình tổng hợp 15 I.4.4. Kết quả đo tính chất từ và phân tích cấu trúc 17 I.4.5. Phân tích cấu trúc hạt 17 I.4.6. Khảo sát tính chất từ 18 I.4.7. Dạng hình học và kích thước 19 I.5. Ứng dụng và kiểm nghiệm 20 I.5.1. Thử nghiệm độc tính cấp 21 I.5.2. Kiểm nghiệm chất sinh nhiệt 23 26 I.5.3. Chụp ảnh cộng hưởng từ I.6. Kết luận phần I 28 Phần II: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP GLUCONAT MỘT SỐ MUỐI KIM LOẠI ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG CHỐNG BỆNH THIẾU MÁU DO THIẾU SẮT 29 II.1. Nội dung nghiên cứu 29 II.2. Phương pháp nghiên cứu 29 II.3. Nghiên cứu tổng hợp canxi gluconat 30 II.3.1. Tổng hợp canxi gluconat bằng phương pháp khuấy từ 30 II.3.2. Tổng hợp canxi gluconat bằng phương pháp vi sóng 34 37 II.3.3. Tổng hợp canxi gluconat bằng kỹ thuật siêu âm II.3.4. Một số hằng số vật lý và phân tích phổ của canxi gluconat 39 II.4. Nghiên cứu tổng hợp sắt gluconat 41 II.4.1. Tổng hợp Sắt (II) gluconat 41 II.4.2. Tổng hợp Sắt (III) gluconat 44 II.5. Nghiên cứu tổng hợp Đồng (II) gluconat 46 II..6. Nghiên cứu tổng hợp Mangan (II) gluconat 48 II.7. Nghiên cứu tác dụng bổ huyết của BM1, BM2, BM3 và BM4 52 II.7.1. Phương pháp, phương tiện 52 54 II.7.2. Kết quả thử nghiệm BM1,BM2 3 II.7.3. Kết luận phần thử nghiệm BM1 và BM2 II.7.5. Kết quả thực nghiệm khảo sát tác dụng BM3 và BM4 II.7.6. Kết luận thử nghiệm BM3 và BM4 II.8. Qui trình pha chế thuốc bổ máu phục vụ cho thử nghiệm sinh học II.9. Kết luận phần II Phần III: PHẦN KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 57 58 61 62 64 64 66 68 4 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các mẫu hạt Fe3O4 được đưa đi khảo sát Bảng 1.2. Các mẫu đã tiến hành thực nghiệm Bảng 1.3. Kết quả theo dõi thân nhiệt trong 03 ngày Bảng 1.4. Kết quả thử nghiệm chất sinh nhiệt Bảng 2.1. Các nhân tố phản ứng trong tổng hợp canxi gluconat Bảng 2.2. Kềt quả tối ưu hóa tổng hợp canxi gluconat bằng phương pháp leo dốc Bảng 2.3. Bảng biến thiên của hiệu suất canxi gluconat theo nhiệt độ Bảng 2.4. Bảng biến thiên của hiệu suất canxi gluconat theo thời gian phản ứng Bảng 2.5. Khảo sát tổng hợp canxi gluconat bằng vi sóng theo thời gian phản ứng Bảng 2.6. Khảo sát phản ứng tổng hợp canxi gluconat bằng thanh Siêu âm theo thời gian phản ứng Bảng 2.7. Khảo sát phản ứng tổng hợp canxi gluconat bằng bồn siêu âm theo thời gian phản ứng Bảng 2.8. Kết quả phân tích 13 C NMR canci gluconat Bảng 2.9. Kết quả phân tích phổ 1H NMR Bảng 2.10. Biến thiên của hiệu suất phản ứng tổng hợp sắt (II) theo nhiệt độ và thời gian phản ứng Bàng 2.11. Biến thiên của hiệu suất phản ứng tổng hợp Sắt (II) gluconat theo nhiệt độ và thời gian phản ứng. Bang 2.12. Biến thiên của hiệu suất phản ứng tổng hợp Sắt (III) gluconat theo nhiệt độ và thời gian phản ứng. Bảng 2.13 Khảo sát phản ứng tổng hợp Mangan(II) gluconat theo nhiệt độ Bảng 2.14. Khảo sát phản ứng tổng hợp Mangan (II) gluconat theo thời gian Bảng 2.15. Số lượng hồng cầu(triệu/mm3) chuột nhắt trước và sau điều trị Bảng 2.16. Trị số Hct(%) của chuột nhắt trước và sau điều trị Bảng 2.17. Trị số Hb(%) của chột nhắt trước và sau khi tiêm APH Bảng 2.18. Trọng lượng lách (g) chuột nhắt trước và sau điều trị 14 ngày Bảng 2.19. Số lượng hồng cầu (triệu/mm3) chuột nhắt trước và sau điều trị Bảng 2.20. Trị số Hct(%) của chuột nhắt trước và sau điều trị Bảng 2.21. Trị số Hb(%) của chột nhắt trước và sau khi tiêm APH Bảng 2.22. Trọng lượng lách (g) chuột nhắt sau điều trị 14 ngày Trang 07 16 25 25 31 31 33 34 35 37 38 39 40 42 45 45 49 50 54 55 56 57 58 59 60 61 5 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 2.1. Biến thiên hiệu suất tổng hợp canxi gluconat theo nhiệt độ phản ứng Đồ thị 2.2. Biến thiên hiệu suất tổng hợp canxi gluconat theo thời gian phản ứng Đồ thị 2.3. Biến thiên hiệu suất tổng hợp mangan(II) gluconat theo nhiệt độ phản ứng Đổ thị 2.4. Biểu diễn hiệu suất tổng hợp mangan (II) gluconat theo thời gian phản ứng Đồ thị 2.5. Số lượng hồng cầu (triệu/mm3) chuột nhắt trước và sau điều trị Đồ thị 2.6. Trị số Hct(%) của chuột nhắt trước và sau điều trị Đồ thị 2.7. Trị số Hb(%) của chuột nhắt trước và sau khi tiêm APH Đồ thị 2.8. Trọng lượng lách (g) chuột nhắt sau điều trị Đồ thị 2.9. Số lượng hồng cầu (triệu/mm3) chuột nhắt trước và sau điều trị Đồ thị 2.10. Trị số Hct(%) của chuột nhắt trước và sau điều trị Đồ thị 2.11. Trị số Hb(%) của chột nhắt trước và sau khi tiêm APH Đồ thị 2.12. Trọng lượng lách (g) chuột nhắt sau điều trị 33 34 49 50 54 55 56 56 58 59 60 61 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp hạt nano bằng phương pháp đồng kết tủa Hình 1.2. Phổ nhiễu xạ của mẫu hạt C15 Hình 1.3. Phổ nhiễu xạ của mẫu hạt C 65 Hình 1.4. So sánh đường cong từ hóa của C9 và C10 Hình 1.5. Đường cong từ hóa của hai mẫu C9 và C42 Hình 1.6. Các đường cong từ hóa của các mẫu C55, C65, C75 Hình 1.7. Ảnh SEM của các mẫu C19 và C15 Hình 1.8. Ảnh SEM của các mẫu C9 và C42 Hình 1.9. Ảnh SEM của các mẫu C55, C65 và C75 Hình 1.10. Ảnh TEM của các mẫu có kích cỡ khác nhau Hình 1.11. Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu H4,H8,H9,H11,H12 Hình 1.12. Ảnh TEM của mẫu H4 đã phủ starch Hình 1.13. Ảnh FESEM của mẫu H4 đã phủ starch Hình 1.14. Lấy thân nhiệt của Thỏ Hình 1.15. Gan Thỏ trước khi tiêm chất lỏng từ Hình 1.16. Gan Thỏ sau khi tiêm 2 phút Hình 1.17. Gan Thỏ sau khi tiêm 15 phút Hình 1.18. Xương sống Thỏ khi chưa tiêm chất lỏng từ Hình 1.19. Xương sống Thỏ sau khi tiêm 18 phút 7 8 8 9 10 10 11 11 12 13 17 20 20 26 26 27 27 27 27 6 PHẦN TỔNG QUAN Trong những năm gần đây công nghệ nanô đã phát triển mạnh mẽ trên thế giới, nhiều thành tựu đã được ứng dụng trong các ngành kinh tế và trong đời sống. Một trong những lĩnh vực đang được thế giới quan tâm và được các nhà khoa học cũng như chính phủ các nước đầu tư cho nghiên cứu ứng dụng là phục vụ cho lĩnh vực y sinh học nhằm bảo vệ sức khỏe con người [1]. Các hạt nano từ đã được quan tâm nghiên cứu vì các ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực như làm bộ nhớ dung lượng cao, …từ tính, chất hấp thụ sóng viba…đặc biệt là trong lĩnh vực sinh y học như chẩn đoán và điều trị các bệnh nan y như ung thư, các phép tách chiết tế bào, DNA, protein, phân phối thuôc đến đúng các mô bệnh, nâng nhiệt cục bộ tại các mô bệnh để diệt tế bào ung thư và trươc hết là chẩn đoán chính xác căn bệnh ung thư khi còn sơ khai nhờ chụp ảnh cộng hưởng từ nhờ các chất tương phản nano từ. Giới thiệu về cộng hưởng từ (MR)và ảnh cộng hưởng từ (MRI): Tạo ảnh cộng hưởng từ là một kỹ thuật hiện đại, cho ta thấy hình ảnh của cơ thể dưạ trên nguyên lý của cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Đó là sự khác nhau về cường độ của tín hiệu mà mỗi mô trong cơ thể tạo ra tương ứng với xung của tần số vô tuyến. Nếu ta đặt một từ trường mạnh B0 không thay đổi lên một tập hợp các proton như hạt nhân hydrogen trong phân tử nước, thì mômen từ spin của proton sẽ chuyển động tuế sai xung quanh trục z của từ trường với tần số Larmor : ω0 = γB0 Sau đó ta đặt thêm một từ trường xung biến thiên với tần số vô tuyến vuông góc với từ trường ngoài đúng bằng với tần số larmor thì sẽ có sự hấp thụ cộng hưởng xảy ra, Các proton sẽ chuyển lên các mức năng lượng cao hơn. Khi ngắt xung tần số vô tuyến thì có sự hồi phục của proton về trạng thái ban đầu và phát ra một lượng nhỏ của bức xạ điện từ được các cuộn dò phát hiện và chuyển thành hình ảnh. Hai tác nhân ảnh hưởng đến ảnh của cộng hưởng từ là mật độ proton và các hằng số thời gian hồi phục từ dọc (T1) và ngang (T2). Trong 1 mm3 có gần 6.6 x 1019 proton. Khi có hiện tượng cộng hưởng xảy ra thì chỉ cần có 2 x 1014 proton trên 1 mm3 nước tham gia quá trình này thì tín hiệu do chúng gây ra cũng đủ để nhận biết trên ảnh cộng hưởng từ. Nếu từ trường ngoài hướng dọc theo trục z thì các thời gian hồi phục dọc ( hay spin- mạng) và hồi phục ngang (hay spin-spin) lên hệ với các tín hiệu hồi phục có dạng: mz = m (1 − e -t / T ) mx,y = m sin (ω0t + φ )e −t / T t- thời gian, ( hằng số pha). T1 đặc trưng cho sự mất mát nhiệt cho môi trường xung quanh. T2 đặc trưng cho sự lệch pha của proton với từ trường xoay chiều. Chất lượng của ảnh cộng hưởng từ có thể tăng cường bằng các chất tương phản. Nguyên lý về chất tương phản là làm sao để thay đổi được các hằng số T1 và T2. Bằng cách giảm T1 là ta đã tăng độ khuếch đại của tín hiệu lên. Bằng cách giảm T2 là ta đã tăng tính tương phản của ảnh. Bằng cách dùng các chất tương phản từ tính thì ta có thể làm giảm được các hằng số T1 và T2. 1 2 1 Ferrit kích thước hạt nanô được quan tâm đến từ lâu bởi khả năng gắn kết với các chất có hoạt tính sinh học như enzym, kháng nguyên, DNA. Đây cũng là hướng có nhiều triển vọng ứng dụng trong y sinh học. Trong các vật liệu nanô có từ tính, chúng ta thấy rất nhiều tác dụng trên có thể thu được với ôxit sắt hai (II) và ba (III). Các ôxit sắt có những ứng dụng rất có triển vọng như: dùng ôxit sắt nanô để đánh dấu và phân lập tế bào, chữa bệnh theo phương thức nâng nhiệt cục bộ bởi từ trường, phân phối thuốc và đặc biệt, nâng cao chất lượng hình ảnh của cộng hưởng từ hạt nhân MRI [2]. Được tập trung nghiên cứu ứng dụng trong y sinh học như vậy, có lẽ vì ôxit sắt rất thân thiện với thế giới sinh học, trong đó có con người. Sắt có trong thành phần của máu, vì vậy từ lâu khi bị thiếu máu người ta phải uống thuốc chứa sắt để khỏi bệnh! Gần đây đã có những thông báo tổng hợp hạt ôxit sắt nanô và xử lí bề mặt của chúng nhằm sử dụng làm vật liệu sinh học và các loại “thuốc” trị bệnh khác nhau [3]. • Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trước đây có nhiều tác giả nghiên cứu tổng hợp ferrit kích thước nanô trong các điều kiện khác nhau như điều chế từ Fe(OH)2 ở 90oC [4], hay tổng hợp ở nhiệt độ phòng [5]. Cả hai công trình trên đều tiến hành trong mội trường kiềm mạnh pH=10-12. Gần đây có tác giả đã công bố phương pháp tổng hợp ferrit kích thước nanô ở trong khoảng 3-20oC, pH=7-9, với điều kiện này phù hợp với các phân tử sinh học nhạy cảm như trypsin, avidin. Tuy nhiên với kích thước của ferrit cở 10 nm thì từ lực quá nhỏ khó tách chúng ra khỏi nước do đó cần điều chế kích thước lớn hơn. Tác giả Tada M. và cộng sự [6] đã thành công trong việc điều chế ferrit kích thước 30 nm khá phù hợp với việc nghiên cứu gắn kết với các chất có hoạt tính sinh học. Hatanaka và cộng sự cũng đã thành công trong việc gắn kết FITC-avidin lên hạt ferrit nanô kích thước nhỏ 10 nm [7]. Một số tác giả khác lại đưa ra phương pháp tổng hợp ferrit kích thước nanô nhờ phản ứng đồng kết tủa giưa hai dung dịch FeCl2 và FeCl3 bằng pipet nhỏ giọt 0,04 ml/giây và vòi phun áp điện kích cỡ 50 µm, tốc độ 0,01 ml/giây[8]. Kích thược hạt thu được khi dùng pipet nhỏ giọt là 5-8 nm, khi dùng vòi phun áp điện là từ 3 đến 5 nm. Một công trình nghiên cứu đáng chú ý nữa là tổng hợp ferrit kích thước nanô có điều chỉnh kích cỡ trong các dung dịch điện ly khác nhau [9]. Hầu hết các chất tương phản đều là các chất thuận từ. Chất tăng cường tương phản đầu tiên được đưa ra thị trường là chromium-EDTA, nhưng do tính bền trong thời gian quá dài, nên đã hạn chế sử dụng trong lâm sàng. Hiện nay trên thị trường đang lưu hành chất axit gadolium-diethylenetriamine pentaacetic ( GdDTPA) với tên gọi là Magnetvist, cũng là chất thuận từ ( PM). Một loại khác của chất tương phản được quan tâm rất nhiều là các hạt nanô siêu thuận từ. Bởi vì các chất siêu thuận từ không có độ từ hóa còn dư khi ngắt từ trường ngoài. Khi sử dụng các chất này thì các hằng số thời gian hồi phục được rút ngắn rất nhiều so với chất tương phản thuận từ như Gd-DTPA. Các chất tăng cường tính tương phản cho ảnh của cộng hưởng từ là các hạt nano ôxyt sắt siêu thuận từ hiện đang được quan tâm. Chẳng hạn các chất FeridexI.V, được hãng Advance Magnetics tung ra thị trường, đã đựơc sử dụng chụp ảnh gan, rối loạn túi mật. Một chất tương phản ôxít sắt khác có tên Resovit được sủ dụng chụp các khối u.[10,11] Các chất tương phản ôxit sắt siêu thuận từ có một sức hấp dẫn đối với các nghiên 2 cứu và điều trị bệnh vì chúng ít gây độc hại khi hoạt động trong cơ thể, sau khi điều trị thì chúng sẽ tự phân hủy qua đường gan. Độ từ hóa bão hòa của chúng lớn nên dễ diều khiển bằng từ trường ngoài. Tùy theo từng bộ phận trong cơ thể mà người ta sử dụng các hạt có kích thước khác nhau. Chẳng hạn, chụp ảnh ruột: đường kính trung bình của hạt không nhỏ hơn 300 nm, chụp ảnh gan, lách: đường kính từ 80 – 150 nm, ảnh u bạch huyết: 20 – 40 nm, ảnh tủy xương : 20 nm… Kích thước của các hạt phụ thuộc vào các phương pháp tổng hợp: phương pháp vật lý , phương pháp hóa học và chiều dày lớp phủ bên ngoài. Lớp phủ bên ngoài phải có tính thích nghi sinh học, Chẳng hạn: Polyethylene glycol (PEG), Dextran, Polyvinylpyrrolidone (PVP), Fatty acids, Polyvinyl alcohol (PVA) , Polyacrylic acid, … Các chất tương phản ảnh cộng hưởng từ được sử dụng qua đường uống, tiêm vào tĩnh mạch hoặc tiêm thẳng vào bộ phân cần chụp, tùy theo từng bộ phận trong cơ thể[12]. Người ta cũng đã nghiên cứu khả năng gắn kết các chất có hoạt tính sinh học như enzym, kháng nguyên, DNA lên các hạt ferrit kích thước nanô [13]. Tuy nhiên công trình nghiên cứu sự gắn kết của aptamer lên ferrit kích thước nanô còn chưa được khảo sát. Đây chính là nội dung chúng tôi thấy cần tiếp tục nghiên cứu. Việc chế tạo ra các tổ hợp vật liệu nanô có gắn kết các chất mang hoạt tính sinh học cao có rất nhiều ý nghĩa. Một số công trình nghiên cứu nghiên cứu theo hướng sử dụng vật liệu cấu trúc nanô trong chẩn đoán nhanh dịch bệnh. Trong đó có đề cập đến khả năng tận dụng các tính chất của các hạt ferrit kích thước nanô dước tác động của các chất có hoạt tính sinh học như axit nucleic hay protein và virus [14]. Khi tạo ra được các tổ hợp aptamer với ferrit kích thước nanô chẳng những có khả năng góp phần chẩn đoán sớm ung thư và các bệnh do virus gây ra mà aptamer còn có khả năng dẫn các hạt sắt từ nhỏ đến gần tế bào ung thư để tiêu diệt chúng. Hơn thế nữa nếu như gắn kết được các thuốc chữa ung thư hiên đang dùng như taxol lên đó có khả năng tạo ra thuốc hoá trị liệu đặc hiệu chỉ tấn công lên tế bào ung thư.Đây là các nội dung đã chuyển sang NCCB[15]. Nghiên cứu nâng cao thể lực cũng có liên quan mật thiết đến sự gia tăng hồng huyết cầu trong máu. Từ lâu những chứng bệnh thiếu máu do thiếu sắt đã được điều trị bằng các viên thuốc chứa sắt. Trong danh mục các biệt dược điều trị căn bệnh này có trên 10 lọai khác nhau nhưng họat chất chính vẫn là muối của sắt như Sắt sunphat, Sắt fumarat, Sắt gluconat. Thời gian cuối người ta nghiên cứu sử dụng nhiều hợp chất phức sắt khác nhau trong đó có Sắt gluconat, sản phẩm điều chế từ muối sắt với gluconic acid. Theo nghiên cứu của bệnh viện Massachusetts General Hospital tại Boston trong các năm 1999-2002 cho thấy sử dụng sắt gluconat an tòan hơn là dùng Sắt dextran [16]. Việc nghiên cứu tiếp tục đang được triển khai và trong đó công nghệ chế tạo sắt gluconat hiệu suất cao chất lượng tốt cũng là một nội dung đáng quan tâm trong đề tài nghiên cứu về oxitsắt nanô. Gần đây có một số công trình nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của các muối gluconat Sắt, Đồng, Mangan, đặc biệt là khả năng phòng trị bệnh ung thư [23] 3 • Tình hình nghiên cứu trong nước Trong một số năm qua, nhất là từ khi chương trình khoa học cơ bản trọng điểm về khoa học và công nghệ nanô do Giáo sư Viện sỹ Nguyễn Văn Hiệu đề xuất và được nhà nước phê duyệt cho triển khai năm 2004-2005, hàng loạt các nghiên cứu vật liệu nanô và ứng dụng đã xuất hiện. Trong lĩnh vực Vật lý và Khoa học Vật liệu, tại hội nghị Vật lý toàn quốc, họp vào đầu tháng 11 năm 2005, Hà Nội, chúng ta thấy có khá nhiều báo cáo của các tập thể khoa học lớn liên quan đến vật liệu ôxit sắt dạng hạt nanô và ứng dụng. Như các báo cáo của nhóm nghiên cứu của GS Thân Đức Hiền, ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà nội về chất lỏng từ, GS Nguyễn Hữu Đức, ĐH Công nghệ, PGS Trần Hoàng Hải, Phân Viện Vật lý, TP HCM, TS Nguyễn Hoàng Hải, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội về chế tạo dịch keo của ôxit sắt dạng hạt nanô và triển vọng ứng dụng trong y sinh học [17]. Theo hướng tổng hợp vật liệu gắn liền với kĩ thuật tương thích sinh học, gần đây còn có công trình của GS Nguyễn Công Hào và TS Nguyễn Cửu Thị Hương Giang nghiên cứu chế tạo tổ hợp ôxit sắt nanô được bao bọc bằng phân tử ADN, tạo nên một siêu phân tử (vật liệu lai hữu cơ - vô cơ cấu trúc nanô), có khả năng tương thích sinh học cao[18]. Từ vài năm trước đây, tập thể khoa học của PGS Lê Quốc Minh và GS.TSKH Nguyễn Phú Thuỳ, đã tổng hợp thành công nanocomposite của ôxit sắt trong nền solgel, từ đấy có thể chế tạo màng mỏng chứa hạt sắt (kim loại) nanô, trong mạng silica [19]. Thời gian qua, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Khoa học Côngnghệ Việt nam, đã tổ chức một số khảo sát ban đầu về khả năng tổng hợp dung dịch keo (dịch keo huyền phù) nanô của ôxit sắt và bari sunphat định hướng ứng dụng trong công nghệ chuẩn đoán và điều trị [20]. Phân Viện Vật lý tại Tp. Hồ Chí Minh trong hơn hai năm nay đã bắt đầu vào việc nghiên cứu công nghệ nanô, đặc biệt đi sâu vào việc tổng hợp các hạt nanô siêu thuận từ ôxit sắt: các loại hạt nanô ferit spinel: M Fe2O4 ( M= Fe, Co, Ni, Zn, Chúng tôi đã thiết lập quy trình công nghệ tổng hợp các hạt nanô siêu thuận từ oxit sắt với sự phân bố kích thước hạt theo các yêu cầu . Bước đầu đã phủ một số hợp chất có tính thích nghi sinh học để phục vụ cho các công việc nghiên cứu trong y sinh học, đặc biệt trong việc chẩn đóan chính xác và điều trị các bệnh nan y như ung thư.[21,22]. Nắm bắt nhu cầu cấp thiêt của ngành y tế của nước ta trong chuẩn đoán và điều trị bệnh , cụ thể trong lĩnh vực chuẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ, hiện tại phải nhập ngoại hoàn toàn hoá phẩm dịch tương phản các loại ( khoảng 50.000 liều /năm 2005) phục vụ cho tất cả các cơ sở y tế có thiết bị MRI. Trong đề tài nghiên cứu này, đầu tiên chúng tôi sẽ tâp trung tổng hợp các hợp chất tăng cường tính tương phản ảnh cộng hưởng từ nhằm mục đích thay thế cho các chất phải nhập từ nước ngoài. Tiếp đến chúng tôi nghiên cứu khả năng gắn kết giữa ferrit kích thước nanô với DNA và nucleotid khác nhau nhằm tạo ra các chất mang thuốc đến tế bào đích, phục vụ phương pháp hoá trị liệu đặc hiệu trong điều trị bệnh nan y. Đồng thời triển khai ứng dụng phức Sắt với các ligan khác nhau như Sắt gluconat, Sắt dextran (nhu cầu 200.000 liều/năm 2005)v.v... đã được nghiên cứu nhằm sớm đưa vào sản xuất thử dược phẩm “ chống thiếu máu” ở Việt nam. 4 PHẦN I NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP OXIT SẮT KÍCH THƯỚC NANO ỨNG DỤNG LÀM TĂNG ĐỘ NÉT HÌNH ẢNH TRONG CỘNG HƯƠNG TỪ I.1. Mở đầu: Bắt đầu từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước nền khoa học và công nghệ thế giới đã đặt biệt chú ý tới một hướng nghiên cứu và phát triển đặc biệt kỳ lạ và lý thú mà ngày nay được gọi là khoa học và công nghệ nano. Tên gọi nano có ý nghĩa là hướng nghiên cứu này liên quan đến các vật thể, cấu trúc có kích thước khoảng từ 1 đến 100 nanomét (nm), mà một nanomét bằng một phần tỷ của mét.Các vật liệu có kích thước nano thể hiện những thuộc tính không giống với vật liệu khối tương ứng, đồng thời kích thước và bề mặt có ảnh hưởng rất lớn đến tính chất của vật liệu [1]. Đặc biệt , công nghệ nanô đã và đang có nhiều ứng dụng quan trọng trong khoa học đời sống và chăm sóc sức khỏe con người. Các nhà khoa học ngày càng bị cuốn hút khi nghiên cứu hạt nano từ đặc biệt trong lĩnh vực y – sinh học. Bởi vì hạt nano từ được coi là kẻ dẫn đường chỉ điểm lợi hại trong y – sinh như sử dụng hạt nano từ để tách từ, làm tăng tính tương phản ở ảnh cộng hưởng từ hạt nhân, làm chất dẫn thuốc, làm cảm biến thông minh ... . Các ứng dụng này có thể xem như một cuộc cách mạng về y sinh học vì có thể chuẩn đoán chính xác và điều trị hoàn toàn một số bệnh ung thư mà trước đây không thể chữa khỏi, các khối u ở các cơ quan của cơ thể người như: gan, phổi, ruột và não… đã được xác định chính xác và phá hủy mà không gây ảnh hưởng đến các mô lành xung quanh. Qua nghiên cứu cho thấy, hạt nanô từ tồn tại trong chất lỏng từ phải không mang độc tố và đảm bảo khả năng lưu thông dễ dàng trong cơ thể. Hạt nanô oxít sắt từ Fe3O4 có khả năng đáp ứng được những yêu cầu trên và đang được nghiên cứu, tổng hợp ở Việt Nam. Hiện nay phương pháp chẩn đóan bệnh băng chup ảnh cộng hưởng từ là phương pháp tiên tiến nhất trên thế giới và đã được sử dụng phổ biến ở các nươc phát triễn trên thế giới. Việc sử dụng các chất tăng độ tương phản trong ảnh chụp cộng hưởng từ như ôxit sắt siêu thuận từ đã giúp cho các bác sĩ phân biệt và chẩn đóan được các bênh tật của người bênh. Đặc biệt trong những căn bệnh nan y như ung thư, thi người bác sĩ có thể phát hiện từ rất sớm, như khối u lành tính hay ác tính, đã bị di căn chưa…giúp cho các bác sĩ đưa ra các phát đồ và phương pháp chữa trị kip thời và có thể chữa trị khỏi căn bệnh. Với tính ưu việt như vây , nhưng giá thành rất đắt, nên ở Việt Nam vẫn chưa sử dụng đại trà được. Vì vậy trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng sẽ tổng hợp được các chất tăng tính tương phản cho ảnh chụp cộng hưởng từ dự trên cơ sở của các hạt nanô ôxít sắt siêu thuân từ với các vỏ bọc có tính thích nghi sinh học để có thể đưa vào trong cơ thể con người Tham khảo các tài liệu của nước ngoài thì muốn đạt được tiêu chuẩn là chất tăng tính tương phản trong ảnh chụp công hưởng từ thì các chất lỏng từ dựa trên cơ sở của ôxit sắt phải đáp ứng các điều kiện sau đây: Tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hòa lớn và mang tính siêu thuận từ và vật liệu có tính thích hợp sinh học (không có độc tính), nghĩa là: 5 - Tính đồng nhất về kích thước liên quan nhiều đến phương pháp chế tạo. - Từ độ bão hòa liên quan đến bản chất của vật liệu. - Tính thích hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu phủ bên ngoài. Để thực hiện các điều kiện trên chúng tôi phải tổng hợp được các hạt có kích thước nanô và khống chế được kích thức của các hạt , các hạt tạo ra phải mang tính chất siêu thuận từ, có nghĩa là : các hạt không có độ từ hóa còn dư khi cắt từ trường ngoài, nghĩa là lực khử từ bằng không và khi có từ trường ngoài thi nhanh chóng đạt giá trị bão hòa và có độ lớn để có thể sử dụng trong y sinh học. Để thực hiện điều kiện các hạt không độc hại và có tính thích nghi sinh học thì phải bọc các hạt bằng các lớp phủ polymer từ các chất hữu cơ hay vô cơ không độc hại và có tính thích nghi sinh học mà các nhà sản xuất trên thế giới đã lưu hành trên thị trường.Các quy trình tạo hạt ôxit sắt có kích thước nanô khác nhau : I.2. Tổng hợp các hạt nanô ôxit sắt Fe3O4. I.2.1. Các thiết bị thực nghiệm : - Máy khuấy siêu âm. - Dụng cụ nâng nhiệt và nhiệt kế. - Nam châm vĩnh cửu. - Thiết bị đo pH. - Máy sấy chân không. I.2.2. Hóa chất : - Muối Ferric chloride hexahydrate ( FeCl3.6H2O, 99% ). - Muối Ferro chloride tetrahydrate ( FeCl2.4H2O, 99% ). - Natrihydroxit (NaOH, 97%). - Khí Nitơ tinh khiết (N2, 99%). I.2.3. Quy trình tổng hợp hạt : Đầu tiên cho khuấy dung dịch NaOH bằng máy khuấy siêu âm đồng thời đun nóng dung dịch lên theo nhiệt độ cần khảo sát và giữ một thời gian đủ lâu để ổn định nhiệt độ, sau đó cho khí N2 để loại oxy. Tiếp theo nhỏ từ từ dung dịch 0.1M FeCl2.4H2O và 0.2M FeCl3.6H2O (tỉ lệ Fe2+:Fe3+ =1:2) mà đã được khuấy từ và được khử oxy bằng khí N2 tinh khiết trước đó. Phương trình phản ứng : 2FeCl3.6H2O + FeCl2.4H2O + 8NaOH = Fe3O4 + 8NaCl + 20H2O Hỗn hợp trên tiếp tục được khuấy siêu âm trong vòng 10 phút và tiếp tục khử oxy bằng khí N2. Sản phẩm hạt nanô từ Fe3O4 có màu đen được lắng bằng nam châm vĩnh cửu và rửa từ 3-5 lần bằng nước cất để loại bỏ các cặn bẩn. Sản phẩm cuối cùng đem sấy khô ở 70OC 6 Sơ đồ tổng hợp : Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp hạt nanô Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa. Một số mẫu hạt Fe3O4 được tổng hợp Bảng 1.1. Các mẫu hạt Fe3O4 được đưa đi khảo sát Mẫu C9 C15 C42 C55 C65 C75 Nồng độ Fe3+:Fe2+ 0.1 M: 0.2M 0.1 M: 0.2 M 0.1 M: 0.2 M 0.1 M: 0.2 M 0.1 M: 0.2 M 0.1 M: 0.2 M Nồng độ OH- Nhiệt độ 0.1 M 0.3 M 0.1 M 0.4 M 0.4 M 0.4 M 80oC 80oC 80oC 80oC 80oC 80oC Điều kiện thí nghiệm Không sục N2 Không sục N2 Sục N2 Sục N2 Sục N2 Sục N2 7 I.3. Kết quả thực nghiệm : Bẳng phương pháp đồng kết tủa hóa học, nhiều mẫu hạt Fe3O4 đã được tổng hợp. Tuy nhiên do kinh phí eo hẹp nên chúng tôi chỉ khảo sát ở một số mẫu. Các mẫu hạt được khảo sát về cấu trúc tinh thể, kích thước hạt, dạng hình học và độ từ hóabão hòa thông qua ảnh chụp từ các thiết bị như : nhiễu xạ tia X (XRD), Kính hiển vi điện tử quét (SEM), Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) nhằm kiểm tra quá trình tạo hạt Fe3O4. Từ đó rút ra các nhận xét và đánh giá các kết quả thu được. I.3.1. Phổ nhiễu xạ tia X Các mẫu phân tích XRD ở dạng bột mịn. Sau khi lọc bằng nước cất và lắng bằng nam châm vĩnh cữu vài lần, các mẫu hạt được đem sấy trong tủ chân không ở 70 oC trong khoảng 48 giờ để thu được mẫu hạt khô Fe3O4 . Hai mẫu C15 và C16 được đem khảo sát X-Ray. Phổ XRD được khảo sát với điện cực Cu-Kα, bước sóng λ = 1.5405 Ao, góc nhiễu xạ 2θ từ 15o – 17o, hiệu điện thế 40 kV và cường độ dòng điện 50 mA. Phổ nhiễu xạ của mẫu hạt Fe3O4 C15 Hình 1.2: Phổ nhiễu xạ của mẫu hạt C 15 Hình 1.3: Phổ nhiễu xạ của mẫu hạt C 65 8 Các mẫu được khảo sát ngẫu nhiên, có các đỉnh phổ chính tương đối trùng khớp với phổ chuẩn của hạt Fe3O4. Các hình nhiễu xạ tia X của các mẫu C15 và C65 trên cho ta thấy các đỉnh phổ tương đối trùng nhau ở các góc 2θ, chỉ sai lệch nhau về độ bán rộng của phổ. Mẫu C15 có độ bán rộng nhỏ hơn so với mẫu C65 cho thấy kích thước hạt ở mẫu C65 nhỏ hơn kích thước hạt ở mẫu C15. Qua đó cho thấy các yếu tố trong quá trình thực nghiệm ảnh hưởng đến kích thước hạt tạo thành. Dựa vào độ rộng ở ½ đỉnh phổ cực đại tính theo 2θ của các đỉnh phổ chính trong phổ XRD của các mẫu phân tích và thông qua công thức Scherrer , ta có thể tính được kích thướctrung bình của mẫu hạt C15 vào khoảng 16 – 18 nm trong khi mẫu C65 có đường kính trung bình vào khoảng 13 – 15 nm. Như vậy , bằng phổ nhiễu xạ tia X, ta có thể khẳng định phương pháp đồng kết tủa tạo ra được sảnn phẩm hạt chủ yếu nằm ở pha Fe3O4. I.3.2. Đường cong từ hóa. Như ta đã biết , độ từ hóa là một trong những yếu tố quan trọng của hạt Fe3O4 để phục vụ cho các ứng dụng trong y sinh học. Do đó các mẫu đã được khảo sát tính chất từ bằng từ kế mẫu rung (VSM). Từ các số liệu thu được với phần mềm Origin ta có thể vẽ được đường cong từ hóa của các mẫu hạt . Ta nhận thấy các mẫu khảo sát đều cho ta đường cong từ hóa có dạng như nhau là không có lực kháng từ cũng như độ từ hóa còn dư. Điều này chứng tỏ rằng các sản phẩm hạt tạo thành đều có tính siêu thuận từ. Qua các kết quả thu được ta nhận thấy rằng có một só yếu tố ảnh hưởng lên độ từ hóa bão hòa của các hạt tạo thành. Trước hết ta xét đến nồng độ OH- ban đầu trong dung dịch phản ứng. Với hai mẫu khảo sát là C9 (0.1M) và C15 (0.3M), các số liệu thu được cho ta đường cong từ hóa sau : Hình 1.4: So sánh các đường cong từ hóa của các mẫu C9 và C15 Hình trên cho ta thấy độ từ hóa bão hòa thay đổi khi ta thay đổi nồng độ OH- ban đầu . Khi OH- thay đổi từ 0.1M đến 0.3M thì độ bão hòa tăng từ 59.11 emu/g đến 64.18 9 emu/g. Như vậy, mặc dù nồng độ OH- ban đầu thay đổi không đáng kể, nhưng cũng có ảnh hưởng đến độ từ hóa bão hòa Ms. Tiếp tục phân tích đường cong từ hóa của hai mẫu hạt C9 và C42 Hình 1.5: Đường cong từ hóa của hai mẫu C9 và C42 Đây là hai mẫu hạt có chung các thông số thực nghiệm : cùng nồng độ muối sắt cũng như OH- ban đầu, phản ứng xảy ra ở 80oC. Tuy nhiên , phản ứng tổng hợp mẫu C9 được thực hiện trong điều kiện bình thường , không sục khí ni tơ N2, còn mẫu C42 được sục khí N2 trong quá trình phản ứng. Kết quả nhận được khá rõ ràng. Khi được sục khí N2 trong quá trình phản ứng, sản phẩm hạt tạo thành có độ từ hóa cao hơn hẳn so với phản ứng thông thường không được sục khí N2 : từ 59.11 emu/g ở mẫu hạt C9, độ từ hóa bão hòa đã nhảy vọt lên đến 70.73 emu/g ở mẫu C42. Kết quả này cho thấy việc sử dụng khí N2 vào quá trình phản ứng có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả đạt được. Yếu tố khảo sát cuối cùng là nhiệt độ phản ứng. Nhiệt độ được thay đổi từ 65oC đến 45 C cho các phản ứng giống nhau, và đều được sục khí N2. Kết quả nhận được là đường cong từ hóa như hình sau : o Hình 1.6: Các đường cong từ hóa của các mẫu hạt C55, C65 và C75 10 Như vậy , nồng độ OH- ban đầu cũng như nhiệt độ không ảnh hưởng mạnh mẽ đến độ từ hóa của sản phẩm hạt tạo thành như điều kiện sục khí N2 trong quá trình thực hiện phản ứng. I. 3. 3. Ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM). Các hạt được khảo sát có dạng hình học và kích thước trung dựa trên các ảnh SEM. Quan sát ảnh SEM của các mẫu hạt , ta có thể nhận thấy sự thay đổi trong kích thước hạt trung bình của các mẫu khảo sát. Từ đó có thể phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước hạt như nồng độ OH- ban đầu, điều kiện phản ứng… có hay không sục khí N2 trong quá trình thực nghiệm, nhiệt độ phản ứng , cũng như đã phân tích ở phần độ từ hóa bão hòa trước đây. Trước hết , ta quan sát ảnh chụp SEM của hai mẫu hạt C19 và C15 là hai mẫu có điều kiện phản ứng giống nhau, chỉ khác nhau về nồng độ OH- ban đầu Ảnh SEM của các mẫu hạt C9 và C15 Hình 1.7: Ảnh SEM của các mẫu C19 và C15 Ta có thể dễ dàng thấy mẫu hạt C15 (0.3M) có đường kính trung bình của hạt vào khoảng 17 – 20 nm. Kích thước này khá gần với kết quả nhân được từ phổ tia X (XRD). Trong khi đó , đường kính hạt của mẫu C9 (0.1M) có kích thước hạt trung bình nhỏ hơn, khoảng 8 – 10 nm. Như vậy khi tăng nồng độ OH- sẽ làm kích thước hạt tăng lên. Tiếp theo ta cũng khảo sát ảnh hưởng các điều kiện phản ứng đến kích thước hạt Fe3O4. Yếu tố khảo sát đầu tiên là dung dịch phản ứng được sục khí trơ trong quá trình phản ứng. Hình 1.8: Ảnh SEM của các mẫu C9 và C42 11 Ảnh SEM của hai mẫu C9 và C42 cho ta thấy kích thước trung bình của hạt nhỏ hơn và phân bố đồng đều hơn khi quá trìnhphản ứng được sục khí N2 ; mẫu C42 có kích thước hạt trung bình chỉ vào khoảng 5 – 8 nm so với mẫu C9 ( 8 – 12 nm). Yếu tố còn lại là nhiệt độ phản ứng. Trong quá trình thực nghiệm này, các thông số phản ứng được giữ nguyên, chỉ có nhiệt độ phản ứng thay đổi từ 45oC đến 65oC. Mẫu C55 Mẫu C65 Mẫu C75 Hình 1.9: Ảnh SEM các mẫu C55, C65 và C75 Khi nhiệt độ phản ứng thay đổi, kích thước hạt Fe3O4 tạo thành cũng bị ảnh hưởng theo. Các ảnh SEM từ hình trên cho thấy kích thước hạt tăng khi nhiệt độ phản ứng giảm. Ở mẫu C55, nhiệt độ phản ứng cao nhất trong 3 mẫu, nhưng kích thước hạt khá nhỏ. Các mẫu C65, C75, nhiệt độ phản ứng giảm đi thì kích thước hạt trung bình lại tăng lên. Tuy nhiên, sự thay đổi kích thước này không đáng kể, nên có thể nói , yếu tố nhiệt độ không ảnh hưởng nhiều đến kích thước hạt tạo thành. 12 ) Mẫu MH- C15 80 KV ¾ KTTB: 16- 20 nm 9 Mẫu MH- C9 thế 60, 80 KV ¾ Hạt nhỏ, rất khó xác định, dường như bị cluster 9 ¾ Hình ảnh mẫu khi invert lại màu ¾ KTTB: 9- 12 nm Mẫu MH- C42 thế 60, 80 KV ¾ KTTB: 5- 8 nm ¾ Hạt khá đồng đều Hình 1.10: Ảnh TEM các mẫu có kích cỡ khác nhau 13 I.4. Tổng hợp chất lỏng từ Một chất lỏng từ gồm có ba thành phần: hạt nano từ tính, chất hoạt hoá bề mặt và dung môi. Trong đó hạt nano từ tính là thành phần duy nhất quyết định tính chất từ của chất lỏng. Chất hoạt hoá bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano phân tán trong dung môi, tránh các hạt kết tụ lại với nhau ngay cả khi có mặt của từ trường. Chất hoạt hoá bề mặt còn có tác dụng “che phủ” hạt nano khỏi sự phát hiện của hệ thống bảo vệ cơ thể và tạo mối liên kết hoá học với các phân tử khác. Dung môi là chất lỏng mang toàn bộ hệ . Mục tiêu phần thực nghiệm là tạo ra chất lỏng từ bằng phương pháp đồng kết tủa nhằm sử dụng cho các nghiên cứu y sinh học, cụ thể là làm chất tăng tính tương phản cho ảnh cộng hưởng từ. Ở đây tôi chọn starch làm chất phủ hoạt hoá bề mặt,bởi vì starch có tính tương thích sinh học, chi phí thấp . Các tính chất cơ bản mà mẫu chất lỏng từ tạo thành cần phải có là thể hiện tính siêu thuận từ, không bị kết tụ, ở trạng thái huyền phù: lơ lững và phân bố đều trong môi trường dung dịch. I.4.1. Thiết bị thực nghiệm - Máy khuấy bằng sóng siêu âm (công suất 750W). -Một số cốc thí nghiệm, ống đong. -Dụng cụ nâng nhiệt và nhiệt kế. -Thiết bị đo độ pH -Nam châm vĩnh cửu. - Máy sấy chân không I.4.2. Hóa chất - Ferric chloride hexahydrate {FeCl3.6H2O,99%} -Ferrous chloride tetrahydrate {FeCl2.4H2O,99%} -Natri hydroxit {NaOH } -Khí Nitơ tinh khiết {N2,99%} - H2O2 - Starch Tính chất đặc trưng + Thành phần hóa học: nguồn gốc từ khoai tây với hai loại phân tử chính là Cấu trúc phân tử của Amylose 14