Tài liệu Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid d được phân lập từ quả của cây chà chôi

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HOÀNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HOÀNG Mã sinh viên: 1301169 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. NCS. ThS. Nguyễn Lâm Hồng 2. TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất 2. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng – Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam và NCS. ThS. Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc Chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích và Độc Chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, giúp tôi có thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Lê Công Vinh cùng các anh chị ở trung tâm tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực nghiệm tại viện. Những kinh nghiệm và kỹ năng học hỏi đƣợc đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác và thực tế hơn. Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa học này. Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Văn Hoàng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN .......................................................................................................2 1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Euphorbiaceae) .....................................................................................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại ......................................................................................................2 1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) ...........................................................................2 1.1.3. Chi Cách hoa (Cleistanthus) ................................................................................2 1.1.4. Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) .................................................3 1.1.5. Các nghiên cứu về chi Cleistanthus....................................................................4 1.2. Hợp chất cleisindosid D...............................................................................................5 1.3. Tổng quan về chất chuẩn .............................................................................................6 1.3.1. Khái niệm chất chuẩn ..........................................................................................6 1.3.2. Phân lo ại chất chuẩn .............................................................................................7 1.3.3. Quy trình thiết lập chất chuẩn .............................................................................7 1.4. Tổng quan về tạp chất ..................................................................................................8 1.4.1. Khái niệm và phân loại ........................................................................................8 1.4.2. Tạp chất liên quan.................................................................................................9 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................... 13 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị............................................................................................ 13 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 13 2.1.2. Hóa chất, dung môi............................................................................................ 13 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị................................................................................................. 13 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 14 2.2.1. Khảo sát và xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D tinh chế đƣợc bằng HPLC/DAD ....... 14 2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp ................................................................................... 14 2.3. Phƣơng pháp nghiên c ứu .......................................................................................... 15 2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D đã tinh chế bằng HPLC/DAD .............................. 15 2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích .................................................................. 15 2.4. Xử lý kết quả .............................................................................................................. 19 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................ 20 3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D bằng phƣơng pháp HPLC/DAD ....................................................................................................................... 20 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ............................................................ 20 3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D.................................................................................. 26 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.......................................................................... 27 3.2.1. Độ đặc hiệu ......................................................................................................... 27 3.2.2. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................................... 32 3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ........................... 33 3.2.4. Khoảng tuyến tính.............................................................................................. 35 3.2.5. Độ chụm .............................................................................................................. 37 3.2.6. Độ ổn định của phƣơng pháp phân tích .......................................................... 40 3.2.7. Kết quả xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D bằng phƣơng pháp HPLC/DAD 42 3.3. Bàn luận ...................................................................................................................... 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 44 I. Kết luận........................................................................................................................... 44 II. Kiến nghị ....................................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 46 PHỤ LỤC ............................................................................................................................... 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT α Hệ số chọn lọc ACN Acetonitril APG Angiosperm Phylogeny Group, Hệ thống phân loại thực vật ARS Chất chuẩn chính thức khu vực ASEAN ASEAN Association of South East Asian Nations BP British Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Anh CH2Cl2 Dicloromethan HPLC/DAD High-performance liquid chromatography with Diod Array Detector, Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod. H2 O Nƣớc ICH International Council for Harmonisation ICRS International Chemical Reference Substances, chất chuẩn quốc tế IC50 Nồng độ ức chế 50 % số lƣợng cá thể IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry LOQ Limit of quantification, giới hạn định lƣợng MeOH Methanol NIST National Institute of Standards and Technology NMR Nuclear Magnetic Resonance, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân PCRS Primary chemical reference substances, chất chuẩn sơ cấp ppm Part(s) per million, nồng độ phần triệu. RSD Relative Standard Deviation, độ lệch chuẩn tƣơng đối Rs Độ phân giải S/N Signal to noice ratio, tín hiệu/ nhiễu nền SD Standard deviation, độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ SRCS Secondary chemical reference substances, chất chuẩn thứ cấp tR Thời gian lƣu TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TKSK Tinh khiết sắc ký USP United States Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Mỹ UV Ultra Violet, tia cực tím VNRS Viet Nam Reference Substances, Chất chuẩn quốc gia Việt Nam WHO World Health Organization, Tổ chức Y Tế Thế giới DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1: Tiêu bản khô và hình ảnh hoa, quả của loài Cleistanthus tonkinensis Jabl....3 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo cleisindosid D ........................................................................6 Hình 2. 1: Cách xác định tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ................................................. 17 Hình 3. 1: Sắc ký đồ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy theo chƣơng trình gradient 1 (1) và chƣơng trình gradient 2 (2) .................................................................... 21 Hình 3. 2: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với pha động ACN – dung dịch đệm acetat pH = 4,0 theo chƣơng trình gradient 3 ................................................... 22 Hình 3. 3: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN – dung dịch acid Formic 0,1 %. .............................................................................................. 23 Hình 3. 4: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN – H2O.......................................................................................................................................... 23 Hình 3. 5: Hình ảnh đỉnh pic cleisindosid D với thể tích tiêm 20 µL (1) và 40 µL (2) 25 Hình 3. 6: SKĐ mẫu trắng (ACN – H2O) và dung dịch cleisindosid D 1000 ppm...... 28 Hình 3. 7: Hệ số tinh khiết pic cleisindosid D và phổ 3D của sắc ký đồ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm ...................................................................................................... 28 Hình 3. 8: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm phân hủy bởi H2O2 30 % trong 3 giờ so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm. ...................................................... 29 Hình 3. 9: SKĐ các dung dịch cleisindosid D bị phân hủy bởi tia UV trong 24 giờ, dung dịch acid sulfuric 0,1 N trong 1 giờ so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm.......................................................................................................................................... 30 Hình 3. 10: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm bị phân hủy bởi nhiệt độ (cách thủy 80 o C) trong 2 giờ và dung dịch NaOH 0,1 N trong 15 phút so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm. ..................................................................................................... 31 Hình 3. 11: SKĐ dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm ........................................................ 34 Hình 3. 12: Biểu đồ thể hiện mối liên quan giữa diện tích và nồng độ cleisindosid D 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1: Các phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan trong 1 số tài liệu ............ 10 Bảng 3. 1: Các chƣơng trình s ắc ký đƣợc khảo sát ........................................................... 20 Bảng 3. 2: Kết quả độ phân giải của cleisindosid D với các tạp chất liền kề ................ 21 Bảng 3. 3: Chƣơng trình gradient 3 .................................................................................... 21 Bảng 3. 4: Chƣơng trình gradient chạy sắc ký .................................................................. 22 Bảng 3. 5: Phổ của cleisindosid D và các tạp chất liên quan........................................... 24 Bảng 3. 6: Độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D và hàm lƣợng tổng tạp chất qua các lần tiêm mẫu ................................................................................................................................. 25 Bảng 3. 7: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống ......................................................... 33 Bảng 3. 8: Kết quả tiêm lặp lại dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm................................. 34 Bảng 3. 9: Quy trình pha các dung dịch trong đƣờng chuẩn ........................................... 35 Bảng 3. 10: Kết quả thẩm định độ tuyến tính .................................................................... 36 Bảng 3. 11: Kết quả thẩm định độ lặp lại ........................................................................... 38 Bảng 3. 12: Hàm lƣợng tổng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D .............................................................................................................................................. 39 Bảng 3. 13: Độ tinh khiết sắc ký và hàm lƣợng các tạp chất liên quan của cleisindosid D trong quá trình bảo quản................................................................................................... 40 Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát sự ổn định của tốc độ dòng ............................................... 41 Bảng 3. 15: Độ tinh khiết sắc ký và hàm lƣợng các tạp chất liên quan của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D (%) .............................................................................. 41 Bảng 3. 16: Kết quả khảo sát độ ổn định về bƣớc sóng ................................................... 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [29]. Có nhiều hƣớng điều trị đã đƣợc sử dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp ngoại khoa,..., tuy nhiên kết quả vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều này thôi thúc các nhà khoa học luôn luôn cố gắng tìm ra các phƣơng pháp và các loại thuốc mới, có cả nguồn gốc hóa dƣợc và dƣợc liệu, để chống lại căn bệnh này. Tại Việt Nam, các thuốc điều trị ung thƣ cũng đang rất đƣợc quan tâm và phát triển, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô đạt từ 88,40 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả quyết định nghiên cứu phân đoạn giàu cleisindosid D và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ. Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phân đoạn có tác dụng hóa trị liệu ung thƣ này, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các hợp chất có mặt trong cao cồn trên. Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “ Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan trong nguyên li ệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D đƣợc phân lập từ quả của cây Chà chôi ” với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Euphorbiaceae) 1.1.1. Vị trí phân loại Cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đƣợc phân loại nhƣ sau: [24] Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Chi Cách hoa (Cleistanthus) Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) 1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu Dầu (Ba mảnh vỏ, Đại Kích) – Euphorbiaceae, là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài, đƣợc chia thành 5 phân họ bao gồm 3 phân họ một lá mầm (Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae) và 2 phân họ hai lá mầm (gồm Oldfieldioideae và Phyllanthoideae) [20]. Phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt [2][3]. Cây rất đa dạng, gồm cây bụi, cây gỗ, cây cỏ hay dây leo; thƣờng có mủ trắng hoặc trong; gốc lá có thể có 2 tuyến mật (ngoài hoa); có lá kèm hay không; hoa đơn tính; bầu dƣới 3 ô; quả nang mở bằng 3 mảnh vỏ; hạt thƣờng có mồng [2]. 1.1.3. Chi Cách hoa (Cleistanthus) Cleistanthus, tên Tiếng Việt là Cách hoa hoặc Cọc rào (cleisto: đóng, không mở và anthos: hoa kết hợp thành). Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, 2 nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4 – 6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng – 3 góc. [5][6] Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia. Ở nƣớc ta, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc và một số loài đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong dân gian với nhiều mục đích khác nhau. [4][5] 1.1.4. Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) Hình 1. 1: Tiêu bản khô và hình ảnh hoa, quả của loài Cleistanthus tonkinensis Jabl. 1.1.4.1. Đặc điểm thực vật Loài Cleistanthus tonkinensis Jabl. có tên Tiếng Việt là Chà chôi (hoặc Cọc rào), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: - Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen. - Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. - Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. - Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm. 3 Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh. [5] 1.1.4.2. Thành phần hóa học Đến nay, đã có 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan đƣợc phân lập từ quả của cây Chà chôi trong đó có hợp chất cleisindosid D. [25] 1.1.4.3. Hoạt tính sinh học Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hòa Pháp) đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật Việt Nam, trong đó có cây Chà Chôi, về hoạt tính kháng ung thƣ trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô lên tới 88,40 95,17%. [6] 1.1.5. Các nghiên cứu về chi Cleistanthus Đã có một số nghiên cứu về các hoạt chất nhóm lignan đƣợc chiết xuất ra từ một số cây thuộc chi Cleistanthus, đặc biệt là các dẫn xuất của podophyllotoxin đƣợc chiết xuất từ cây Cleistanthus boinivianus. Các chất đƣợc phân lập đã đƣợc xác định cấu trúc, sau đó đƣợc thử nghiệm lâm sàng và cho thấy kết quả khả quan trên tế bào ung thƣ buồng trứng A2780, trong đó chất 3α-O-(β-D-glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin, là một trong những chất mới đƣợc phân lập, cho khả năng ức chế tế bào A2780 mạnh nhất với trị số IC50 khoảng 33,0 ± 3,6. [18] Ngoài ra, các hoạt chất Cleistanthins A và B đƣợc chiết xuất từ cây Cleistanthus collinus cũng đã đƣợc đem thử nghiệm và cho thấy tác dụng làm giảm huyết áp, và tác dụng này phụ thuộc vào liều dùng. Cả 2 hoạt chất này đều làm giảm tác dụng của epinephrin, norepinephrin và thụ thể α-1 của dopamin. Cùng với đó, Cleistanthins B cũng làm giảm tác dụng của acetylcholin lên huyết áp trung bình [21]. Cũng trong năm 2012, M. Pratheepa cùng các cộng sự đã công bố tìm kiếm đƣợc hoạt chất mới là 4 dioctyl phthalat có mặt trong dịch chiết aceton của cây Cleistanthus collinus. Hoạt chất này liên kết với protein 53, là một loại protein ngăn ngừa ung thƣ, nên nó cũng đƣợc coi nhƣ là 1 chất ngăn ngừa ung thƣ. [22] Từ đó, các nhà khoa học tiến hành chiết xuất và tìm kiếm sự có mặt của các hoạt chất này trong các loài thuộc chi Cleistanthus. Tuy nhiên, theo các nhà khoa học, ngoài cây C. boinivianus, chỉ 5 trong hơn 140 loài xuất hiện nhóm các hoạt chất này, gồm có: C. collinus, C. patulus, C. schlechteri var. schlechteri, C. gracilis and C. indochinensis. [18] Tại Việt Nam, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động từ năm 2009. Dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô và dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. [6] 1.2. Hợp chất cleisindosid D Danh pháp IUPAC: (9R)-5-(benzol[d][1,3]dioxol-5-yl)-10-methoxy-9-(((2R,3R,5S,6R)-3,4,5trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-5,8,8a,9tetrahydrofuro[3’,4’,6,7]naphtho[2,3-d][1,3]dioxol-6(5aH)-one. Công thức phân tử: C26H28 O13 Khối lượng phân tử: 369,0 Da Công thức cấu tạo: 5 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo cleisindosid D Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton, methanol và acetonitril, kém tan trong nƣớc. 1.3. Tổng quan về chất chuẩn 1.3.1. Khái niệm chất chuẩn Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. [1][14][16][28] Chất chuẩn đƣợc dùng trong các phép thử sau: (1) Định tính bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. (2) Định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang. (3) Các phép thử định tính tạp chất và định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký. (4) Định lƣợng bằng phƣơng pháp vi sinh vật. (5) Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lƣợng. (6) Các phép thử sinh học. (7) Một số phép thử khác h ycó hƣớng dẫn trong các chuyên luận riêng. [1][13][14][17][27] 6 1.3.2. Phân loại chất chuẩn 1.3.2.1. Chất chuẩn gốc (Primary Chemical Reference Substances – PCRS) Chất chuẩn gốc là chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi, có chất lƣợng phù hợp với những mục đích sử dụng cụ thể, trong những hoàn cảnh cụ thể mà không cần phải so sánh với chất hoá học khác. [8][9][13][14][27][28] Một số chuẩn gốc nhƣ: chuẩn Quốc tế (ICRS) [27], chuẩn Dƣợc điển Mỹ (USPRS) [26], chuẩn Dƣợc điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập. 1.3.2.2. Chất chuẩn thứ cấp (Secondary Chemical Reference Substances – SCRS) Chất chuẩn thứ cấp là chất chuẩn có giá trị đƣợc xác định hoặc hiệu chuẩn bằng cách so sánh với chuẩn gốc của cùng một đại lƣợng. [13][23][27] Một số chuẩn thứ cấp nhƣ: chuẩn ASEAN (ARS) [17], chuẩn Dƣợc điển Việt Nam, chuẩn làm việc, ... 1.3.3. Quy trình thiết lập chất chuẩn Theo hƣớng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các bƣớc cơ bản sau: - Lựa chọn nguyên liệu - Xây dựng quy trình - Đánh giá nguyên liệu - Đóng lọ/ống - Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói - Đánh giá liên phòng - Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ - Phê duyệt kết quả 7 - Đóng gói, bảo quản, phân phối - Kiểm tra định kỳ. [13][27] Độ tinh khiết của chất chuẩn đƣợc tính theo công thức: Purity (%) = 100 – tạp hữu cơ (%) – tạp vô cơ (%) – nƣớc (%) – dung môi tồn dƣ (%) [8][27][28] 1.4. Tổng quan về tạp chất 1.4.1. Khái niệm và phân loại 1.4.1.1. Khái niệm Tạp chất là bất kỳ thành phần nào đƣợc phát sinh từ quá trình tổng hợp, phân hủy hoặc các hóa chất không mong muốn, tồn tại cùng với các hoạt chất trong dƣợc phẩm và làm giảm độ tinh khiết của dƣợc chất. Các tạp chất có thể trơ hay có tác dụng mạnh hoặc yếu về mặt dƣợc lý. Ngay cả khi xuất hiện trong sản phẩm với lƣợng nhỏ, các tạp chất sẽ ảnh hƣởng trực tiếp đến chất lƣợng thuốc, đến hiệu quả và an toàn khi sử dụng thuốc. [9][12] Các tạp chất có thể đến từ nhiều nguồn, chẳng hạn nhƣ: các tạp chất sinh ra trong quá trình tổng hợp (do các phản ứng tổng hợp hữu cơ rất khó xảy ra hoàn toàn nên các sản phẩm phụ (tạp chất) luôn xuất hiện cùng với các sản phẩm chính), các tạp chất liên quan đến quá trình chiết tách từ nguyên liệu thiên nhiên (do các hợp chất từ thiên nhiên thƣờng rất khó để chiết, tách nhau hoàn toàn), các tạp chất liên quan tới quá trình kết tinh, các dung môi tồn dƣ, các tạp chất liên quan đến công thức, các tạp chất phát sinh trong quá trình bảo quản, tạp chất liên quan đến phƣơng pháp, tƣơng tác lẫn nhau giữa các thành phần và sự phân hủy của các nhóm chức điển hình,... [9][19] 1.4.1.2. Phân loại tạp chất Tạp chất đƣợc chia làm 3 loại chính: - Tạp chất hữu cơ - Tạp chất vô cơ 8 - Tạp chất bay hơi (nƣớc và dung môi tồn dƣ) [12] a. Tạp chất hữu cơ Các tạp chất hữu cơ có thể có sẵn trong nguyên liệu ban đầu (thƣờng là các tạp chất đồng phân) hoặc đƣợc sinh ra trong quá trình sản xuất và quá trình bảo quản, bao gồm các sản phẩm phụ, các sản phẩm trung gian, các chất xúc tác, các chất thử và các sản phẩm phân hủy. [9][10][12][19] b. Tạp chất vô cơ Các tạp chất vô cơ có thể xuất hiện trong quá trình sản xuất, bao gồm các kim loại nặng, muối vô cơ hoặc hỗn hợp (thuốc thử, các chất xúc tác) và các nguyên liệu khác (từ thiết bị lọc, than hoạt,...); hoặc xuất hiện trong quá trình bảo quản (sự phân hủy các muối của dƣợc chất với các acid vô cơ,...). [9][12] c. Tạp chất bay hơi Tạp chất bay hơi gồm nƣớc và các dung môi hữu cơ dễ bay hơi đƣợc sử dụng hoặc đƣợc sinh ra trong quá trình sản xuất thuốc. Trong quá trình sản xuất mà dƣợc chất đƣợc phân lập từ dƣợc liệu, các tạp chất bay hơi có thể xuất phát từ dung môi đƣợc sử dụng để phân lập dƣợc chất, dung môi đƣợc sử dụng để tinh chế dƣợc chất, dung môi do hấp phụ hoặc bắt nguồn từ quá trình bào chế. [9] Các dung môi tồn dƣ có thể gây độc tính hoặc trơ về tác dụng dƣợc lý. Các dung môi độc, gây ung thƣ, gây nguy hại cho môi trƣờng cần tránh hoặc sử dụng với lƣợng phù hợp nếu cần thiết. Chính vì vậy cần phải có sự kiểm soát về lƣợng tồn dƣ dung môi trong sản phẩm để tránh khỏi những tác động xấu tới con ngƣời và môi trƣờng. [12] 1.4.2. Tạp chất liên quan Các tạp chất liên quan nằm trong nhóm các tạp chất hữu cơ. Có thể là các thành phần không tách đƣợc hoàn toàn ra khỏi hoạt chất chính khi tinh chế, hoặc có thể đƣợc phân hủy ra từ hoạt chất chính trong quá trình sản xuất và bảo quản [12]. Việc định danh và xác định hàm lƣợng các tạp chất liên quan có ý nghĩa vô cùng quan trọng 9 trong quy trình xây dựng chất chuẩn. Xác định các tạp chất hữu cơ chính là khía cạnh thách thức nhất trong việc phát triển một phƣơng pháp phân tích phù hợp. [9] 1.4.2.1. Các phương pháp xác định tạp chất liên quan Các phƣơng pháp định lƣợng tạp hữu cơ trong một số tài liệu tham khảo: Phƣơng pháp định lƣợng Tài liệu tham khảo WHO pharmacopoeia library (phụ lục 1.14.4) HPLC/DAD [30] BP 2016 (phụ lục 5.12) Kỹ thuật tách và phổ [8] Dƣợc điển Châu Âu 9.0 (trang 735) Kỹ thuật tách và phổ [14] USP 38 (trang 621) HPLC/DAD [26] Guidelines for the establishment, handling, storage HPLC/DAD [13] and use of ASEAN reference substances. Herbal Reference Standards: applications, HPLC/DAD [31] definitions and regulatory requirements. Reference-standard material qualification HPLC/DAD, LC – MS [9] A review on reference substances LC-MS [23] ICHQ6A HPLC/DAD [16] Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan trong 1 số tài liệu Bảng 1.1 cho thấy phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng rất phổ biến để xác định hàm lƣợng các tạp chất liên quan. Vì vậy, tiến hành nghiên cứu chi tiết về phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan sử dụng HPLC với detector DAD (HPLC/DAD). 1.4.2.2. Các kỹ thuật định lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD  Kỹ thuật 1: Chuẩn hóa diện tích Phần trăm tạp chất liên quan đƣợc tính theo công thức: Stạp đơn tạp đơn = Spic tổng tạp = 10 Stạp Spic 100 100