Tài liệu Xây dựng phương pháp phát hiện 6 - Monoacetylmorphin trong mẫu nước tiểu bằng GC và MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013   1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Trường HÀ NỘI 2013   2 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ Dược học, em xin được gửi lời trân trọng cảm ơn tới thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Xuân Trường. Cám ơn sự tận tình chỉ bảo, cũng như sự động viên của thầy đã giúp em vượt qua những khó khăn để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Sự hiểu biết sâu sắc của thầy đã thắp sang tình yêu khoa học cho mỗi học viên may mắn được thầy hướng dẫn. Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, đặc biệt các thầy cô trong bộ môn kiểm nghiệm thuốc- độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học. Tôi xin được cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp nơi tôi công tác, cùng các anh chị công tác tại Trung tâm Giám định ma túy-Viện Khoa học Hình sự, đặc biệt là Th.s Đỗ Duy Nam, Th.s Hoàng Ngọc Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, chồng, em trai đã động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa học. Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Minh Nguyệt     3 MỤC LỤC   ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1. Vài nét về các nhóm ma túy.................................................................................. 3 1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy ....................................................... 3 1.1.2.Phân loại các chất ma túy.................................................................. 4 1.2. Các chất ma túy nhóm opiat................................................................................. 5 1.2.1. Lịch sử............................................................................................... 5 1.2.2. Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [5] ........................ 5 1.3. Chất chuyển hóa 6-MAM ................................................................................... 11 1.3.1. Cấu tạo, tính chất 6-MAM .............................................................. 11 1.3.2. Các phương pháp phân tích 6-MAM. ............................................. 14 1.4. Kĩ thuật chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 24 1.4.1. Kiểm tra sơ bộ................................................................................. 24 1.4.2. Tách chiết mẫu............................................................................... 25 1.4.3. Dẫn xuất hóa mẫu phân tích........................................................... 25 1.4.4. Chất nội chuẩn................................................................................ 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................... 27 2.2. Hóa chất và thiết bị: ............................................................................................. 27 2.3. Phương pháp và nội dung nghiên cứu.............................................................. 27 2.3.1. Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) ............ 27 2.3.2. Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết ................. 28 2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng GC- MS ..................................................................................................... 29 2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................... 32   4 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................... 33 3.1. Xây dựng quy trình chiết, phân tích 6-MAM trong nước tiểu.................... 33 3.1.1. Lựa chọn điều kiện phân tích 6-MAM trên GC-FID ...................... 33 3.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết .................................................. 34 3.1.3. Khảo sát lựa chọn pH môi trường chiết xuất 6-MAM trong mẫu nước tiểu ................................................................................................... 38 3.1.4. Khảo sát sự ổn định 6-MAM trong mẫu nước tiểu ......................... 40 3.1.5. Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6-MAM và phân tích trên GC-MS trong mẫu nước tiểu.................................................................................. 44 3.1.6. Quy trình phân tích 6-MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏnglỏng, dẫn xuất hóa và phân tích trên GC-MS........................................... 47 3.2. Thẩm định phương pháp định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng GC-MS...............................................................................................................49 3.2.1. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu .................................................... 49 3.2.2 Đường chuẩn, khoảng làm việc, Giới hạn phát hiện (LOD) , ngưỡng phát hiện (Cut off)..................................................................................... 51 3.2.3. Độ đúng......................................................................................... 53 3.2.4. Độ chính xác ................................................................................. 54 3.2.5. Độ thu hồi ....................................................................................... 55 3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế ............................................. 56 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 60 4.1 Về thẩm định phương pháp phân tích 6-MAM trong nước tiểu ................. 60 4.2 Về phân tích mẫu thực tế ..................................................................................... 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 63       5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT/ KÝ HIỆU   6 – MAM 6 – monoacetylmorphine AC Acetylcodein BSA N, O-bis-trimethylsilylacetamit BSTFA N, O-bis-trimethylsilyifluoroacetamide Clof Chloroform DCM Dichlorometan Ete Diethylete EI Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm electron EtAc Ethylacetat GC-MS Sắc ký khí – khối phổ HPLC (High performance liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao IS (Internal Standard) Chất nội chuẩn LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện LOQ (Limit of Quantification) Giới hạn định lượng M-3-G Morphin – 3 – glucuronic M-6-G Morphin – 6 – glucuronic PFPA Anhydric pentafluoropropionic RSD Phương sai SD Độ lệch chuẩn   6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin ........................................................ 6 Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat .................................... 10 Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM ............................................................. 11 Hình 1.4. Sơ đồ máy khối phổ ........................................................................ 21 Hình 1.5. Sơ đồ quá trình ion hóa bằng EI...................................................... 22 Hình 1.6. Sơ đồ bẫy ion tứ cực ....................................................................... 24 Hình 3.1: Phổ đồ của hỗn hợp chất chuẩn methadone, morphine, 6-MAM, Octacosan trong CTSK GC-FID. .................................................................... 34 Hình 3.2: Phổ đồ GC của mẫu chiết bằng chloroform trong trường hợp không loại tạp ............................................................................................................. 36 Hình 3.3 : Phổ đồ GC của mẫu chiết bằng chloroform trong trường hợp đã loại tạp ............................................................................................................. 36 Hình 3.4: Biểu đồ biểu thị hiệu suất chiết 6-MAM của các dung môi ........... 37 Hình 3.5: Đồ thị biểu thị khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu ở các giá trị pH .................................................................................................................... 39 Hình 3.6: Phổ đồ GC của mẫu chiết với chloroform ở pH=9........................ 40 Hình 3.7: Phổ đồ GC của mẫu chiết trong ngày đầu ...................................... 41 Hình 3.8: Phổ đồ GC của mẫu chiết trong ngày thứ 5.................................... 42 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ 6-MAM trong thời gian bảo quản ................................................................................................................. 42 Hình 3.10: Sơ đồ phản ứng dẫn xuất 6-MAM + PFPA .................................. 44 Hình 3.11: Sự thay đổi hình dạng, chiều cao, thời gian lưu pic khi dẫn xuất: 6-MAM cho pic tại 11,92 phút và 6-MAM-PFP cho pic tại 10,67 phút ........ 46 Hình 3.12: Đồ thị đường chuẩn định lượng .................................................... 53 Hình 3.13: Phổ đồ kết quả phân tích của mẫu M03........................................ 59   7 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat ..................................... 6 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung môi chiết trong trường hợp đã loại tạp ...... 37 Bảng 3.2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào pH mẫu ............................................................................................................ 39 Bảng 3.3: Kết quả sự thay đổi tỷ lệ diện tích pic của 6-MAM và chất nội chuẩn trong quá trình bảo quản mẫu nước tiểu.............................................. 41 Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất chiết 6-MAM theo quy trình đã lựa chọn.......... 43 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống .................................. 51 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ .... 52 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độ đúng................................................. 54 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp ..................... 56 Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế ....................... 57 Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế...................................................... 58   8 ĐẶT VẤN ĐỀ   Ma túy là một vấn nạn, không chỉ trong nội bộ của một quốc gia mà còn là vấn đề cần được quan tâm của nhiều nước. Toàn cầu hóa đã mang lại nhiều cơ hội cho sự phát triển kinh tế- xã hội, song cũng đặt ra nhiều thách thức lớn trong công cuộc đấu tranh với tệ nạn ma túy, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Hiện nay, do mức độ nghiêm trọng từ phương thức đến thủ đoạn sản xuất, vận chuyển, buôn bán ma tuý ngày càng tinh vi đã ảnh hưởng không nhỏ đến công tác quản lý, đấu tranh ngăn chặn ma túy của các nước. Cũng như các quốc gia khác trong khu vực và quốc tế, Việt Nam đã có nhận thức sâu sắc về tác hại của ma túy đối với cá nhân, cộng đồng và xã hội. Việc đấu tranh phòng, chống ma túy ở Việt Nam là một mặt trận nóng bỏng, được cả xã hội quan tâm. Quốc hội Việt Nam đã thông qua Luật phòng, chống ma túy năm 2001, Luật sửa đổi, bổ sung một số điều của Luật phòng, chống ma túy năm 2008. Chính phủ Việt Nam đã tập trung chỉ đạo thực hiện các luật, nghị quyết của Quốc hội, ban hành được nhiều văn bản hướng dẫn thi hành pháp luật về phòng, chống ma túy, cũng như đã thành lập Ủy ban Quốc gia về phòng, chống ma túy. Trong những năm qua, việc phòng, chống ma tuý tại Việt Nam đã đạt được những kết quả quan trọng. Tuy vậy, tệ nạn ma túy vẫn diễn biến phức tạp và tiếp tục gây ra các hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chiến lược phát triển kinh tế, trật tự, an toàn xã hội và phát triển nòi giống. Điều này đòi hỏi Việt Nam cần tiếp tục có các giải pháp đồng bộ trong việc đấu tranh ngăn chặn các tệ nạn và tội phạm liên quan đến ma túy. Một trong những biện pháp hỗ trợ cho công tác phòng ngừa là phát hiện, đánh giá mức độ sử dụng ma túy của các đối tượng sử dụng các chất ma túy [2]. Theo thời gian, các đối tượng sử dụng chất ma túy ngày càng đa dạng, tinh vi hơn. Điều này thể hiện không chỉ trong việc tàng trữ, sử dụng các chất   1 ma túy mà còn trong quá trình khai báo khi bị bắt. Một số thuốc có sản phẩm chuyển hóa giống sản phẩm chuyển hóa của một số chất ma túy, điều này thường được các đối tượng lợi dụng trong quá trình khai báo nhằm thoát tội. Vì vậy công tác phát hiện các chất ma túy đòi hỏi ngày càng hoàn thiện hơn khắc phục những lỗ hổng mà tội phạm có thể lợi dụng được [2], [9]. Heroin là một trong những chất ma túy nguy hiểm nhất và phổ biến nhất trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Heroin được bán tổng hợp từ Morphine. Khi vào cơ thể, một trong những sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của heroin được tìm thấy là Morphine, đây cũng là sản phẩm chuyển hóa của một số thuốc chứa hoạt chất codein, morphine, opium. Vì vậy khi phát hiện Morphintrong dịch sinh học không thể kết luận đối tượng đã sử dụng Heroin. 6-Monoacetylmorphin(6-MAM) là sản phẩm chuyển hóa trung gian của Heroin trong cơ thể, đồng thời cũng là “chìa khóa” để phân biệt Heroin với các opiat khác. Tuy nhiên, nồng độ của 6-MAM trong nước tiểu thường rất nhỏ, cần có những thiết bị phân tích hiện đại, có độ nhạy cao để nhận dạng. Trên thế giới để xác định việc sử dụng Heroin người ta thường tiến hành phân tích sản phẩm chuyển hóa trung gian 6-MAM. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu toàn diện về vấn đề này [6], [11]. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nhiệm vụ “xây dựng phương pháp phát hiện 6-Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng GC-MS” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện 6- Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC-MS). 2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu nước tiểu thực tế.   2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về các nhóm ma túy 1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy Trong quá trình phát triển, con người đã biết sử dụng một số loại cây cỏ giúp cho tinh thần sảng khoái, chống mệt mỏi. Từ thế kỉ thứ 3 trước công nguyên đã có tài liệu ghi nhận việc sử dụng thuốc phiện. Thuốc phiện được coi như một loại thần dược chữa bách bệnh. Điều đó dẫn tới việc lạm dụng thuốc phiện của loài người. Năm 1806, Serturner đã phân lập được một chất tinh khiết đặc trưng cho tác dụng chính của thuốc phiện và gọi tên là Morphine. Nó còn được gọi tên là Narcotic, nghĩa là mê mẩn, túy lúy. Ở Việt Nam, ban đầu thuật ngữ “ma túy” dùng để chỉ thuốc phiện. Tuy nhiên cho tới ngày nay khái niệm đó đã được mở rộng, nó bao gồm thuốc phiện, các sản phẩm thiên nhiên khác như cần sa, cô ca… và hàng loạt các sản phẩm bán tổng hợp, tổng hợp khác. Một cách tổng quát nhất, ma túy được định nghĩa: “các chất ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý, sinh lý người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó” [6], [9], [11]. Tại Việt Nam, điều 2 luật phòng chống ma túy được Quốc hội khóa X, kỳ họp thứ 8 thông qua ngày 9 tháng 12 năm 2000 quy định: a. Chất ma túy là các chất gây nghiện, chất hướng thần được quy định trong các danh mục do Chính phủ ban hành. b. Chất gây nghiện là chất kích thích hoặc ức chế thần kinh, dễ gây tình trạng nghiện ðối với ngýời sử dụng. c. Chất hýớng thần là chất kích thích, ức chế thần kinh hoặc gây ảo giác, nếu sử dụng nhiều lần có thể dẫn tới tình trạng nghiện ðối với ngýời sử dụng [4].   3 Theo Nghị định số 82/2013/NĐ-CP của Chính phủ ngày 19 tháng 7 năm 2013 ban hành danh mục các chất ma túy và tiền chất, hiện nay các chất ma túy gồm 235 chất chia làm 3 danh mục và 41 tiền chất [7]. 1.1.2. Phân loại các chất ma túy. Có nhiều cách phân loại các chất ma túy [6], [9], [19]:  Dựa theo nguồn gốc: - Ma túy tự nhiên: thuốc phiện, Morphine, Cocain, Cần sa - Ma túy bán tổng hợp: Heroin ðýợc bán tổng hợp từ Morphine - Ma túy tổng hợp: Methamphetamin,  Phân loại theo tác dụng tâm, sinh lý: - Các chất ức chế thần kinh trung ýõng, có tác dụng giảm ðau, gây ngủ gồm thuốc phiện, các chất Opiat và các chất tác dụng kiểu Morphine. - Các chất kích thích thần kinh trung ýõng nhý Amphetamin, Methamphetamin, các dẫn chất mạch vòng của Amphetamin, Cocainm, cây Khat - Các chất gây ảo giác nhý Cần sa, LSD, nấm Peyote, Mescalin… - Các chất an thần, gây ngủ nhý các chất nhóm Benzodiazepin, nhóm Barbiturat. - Một số các chất dung môi bay hõi nhý Ete, Etyl acetat…  Phân loại theo tính chất hóa học: - Nhóm alkaloid : Morphine, Codein, Cocain, Heroin - Nhóm amin thõm: Amphetamin, Methamphetamin…  Phân loại theo trạng thái vật lý: rắn, lỏng…   4 Trên thực tế cách phân loại theo tác dụng tâm sinh lý được dùng phổ biến nhất trên thế giới, cách phân loại theo trạng thái vật lý ít được sử dụng vì đa số các chất ma túy ở trạng thái rắn dưới dạng tinh thể hoặc vô định hình, trừ một số ít chất lỏng như cần sa và các dung môi bay hơi. Trong phạm vi đề tài này Heroin và sản phẩm chuyển hóa của nó là đối tượng chính. 1.2. Các chất ma túy nhóm opiat. 1.2.1. Lịch sử Thuật ngữ “opiat” được dùng để chỉ những chất có trong thuốc phiện, là một sản phẩm tự nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện, tên khoa học là Papaver sonmiferum L, bao gồm morphine, codein, thebain, và các chất bán tổng hợp từ chúng như heroin, oxycodone, hydromorphone. Đầu thế kỷ XIX, lần đầu tiên morphinđược phân lập từ cây thuốc phiện, vào năm 1874 việc tổng hợp diacetylmorphinđược báo cáo. Năm 1898, sản phẩm thương mại được ra đời bởi công ty Bayer, người ta đặt tên cho loại thuốc mới này là Heroin. Đầu thế kỉ XX, Heroin được chấp nhận rộng rãi như một loại thuốc chuyên dụng, dùng thay thế Codein và Morphintrong điều trị bệnh lao và các bệnh về đường hô hấp khác. Cũng trong thời gian này, Heroin lần đầu tiên xuất hiện tại Trung Quốc. Vài năm sau, công ước quốc tế về ma túy năm 1925, kiểm soát quốc tế bắt đầu giới hạn việc cung cấp Heroin và cũng từ đây xuất hiện hành vi sản xuất heroin trái phép. Trên thế giới thuốc phiện được phân bố ở bốn khu vực chính là vùng tam giác vàng, lưỡi liềm vàng (chiếm 70% sản lượng trên thế giới), Nam Mỹ, và phía nam của Bắc- Trung Mỹ. Tại Việt Nam, cây thuốc phiện được trồng ở các tỉnh miền núi phía bắc, tuy nhiên việc trồng cây thuốc phiên đã bị cấm, diện tích trồng còn rất ít, chiếm khoảng 400 hecta [2], [6], [9] 1.2.2. Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [5]   5 Trong thuốc phiện có khoảng 40 alkaloid khác nhau, dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia làm 2 nhóm chính: nhóm có chứa nhân Phenanthren (gồm morphine, codein, thebain…) và nhóm chứa nhâm Benzylisoquinolin (như narcotin, papaverin…) ngoài ra thuốc phiện còn chứa acid meconic… 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học: A: vòng thơm B: vòng cyclohexan C: vòng alcol D: vòng piperidin   E: vòng tetrahydrofuran (cầu nối ete 4,5) Cấu tạo phân tử morphin Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat Các nhóm thế ở vị trí số Dẫn chất opiat 3 6 17 Ghi chú Morphin OH OH CH3 Heroin OCOCH3 OCOCH3 CH3 Codein CH3 OH CH3 Thebain OCH3 OCH3 CH3 Nalorphin OH OH CH2CH=CH2 (1), (2) Naloxone OH =O CH2CH=CH2 (1) Hydromorphone OH =O CH3 (1), (3) Levophanol OH H CH3 (1), (2) Oxycodon OCH3 =O CH3 (1), (2)   6 Naltrexone OH =O CH2-CPropan (1): liên kết C7 và C8 là liên kết đơn (2): thêm OH vào C14 (3): giữa C4 và C5 không có O 1.2.2.2. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng - Các chất trong nhóm đều có cấu trúc nhân phenanthren tương tự morphin, là cấu trúc quyết định tác dụng giảm đau của nhóm. - Các nhóm chức có liên quan đến tác dụng là nhóm –OH phenol ở vị trí 3, nhóm –OH alcol ở vị trí 6, và nhóm thế ở vị trí 17. Khi thay đổi nhóm – OH ở vị trí C3, C6 trong phân tử morphin thì một số tác dụng dược lý và đặc tính dược động học thay đổi: + Khi methyl hóa nhóm -OH ở vị trí C3, tác dụng giảm đau gây nghiện giảm, tác dụng giảm ho tăng lên, đồng thời sinh khả dụng đường uống cũng tốt hơn morphin. + Acetyl hóa nhóm –OH ở vị trí C3, C6 thuốc thâm nhập hàng rào máu não tốt hơn, tác dụng giảm đau gây nghiện tăng, ví dụ diacetyl morphin (Heroin) + Khử H của –OH ở C6 tạo nhóm ceton hoặc ester hóa thì tác dụng giảm đau và độc tính tăng nhưng thời gian tác dụng lại ngắn như oxymorphon, hydromorphon. + Thay –CH3 ở vị trí 17 của morphin bằng nhóm allyl –CH2-CH=CH2 thì được nalorphin, tác dụng đối kháng với morphin [5], [6]. 1.2.2.3. Dược động học của nhóm opiat Hấp thu: các chất opiat có thể đưa vào cơ thể bằng nhiều cách khác nhau, như hút, hít, uống, tiêm, nhai… tùy thuộc vào dạng có sẵn. Tuy nhiên,   7 khi dùng đường uống, các chất này bị chuyển hóa đáng kể bởi chu trình ganmật, sinh khả dụng thấp 25% đối với morphin, 35% đối với heroin, codein có sinh khả dụng đường uống cao hơn cả. Chúng thường được người nghiện sử dụng dưới dạng hút, hít, tiêm để có tác dụng nhanh chóng, tăng sinh khả dụng. Phân bố: khoảng 30% morphin liên kết với protein huyết tương, trong khi heroin chỉ liên kết với protein khi đã được chuyển hóa thành morphin. Tập trung nhiều ở cơ vân, gan, phổi, thận. Các chất này qua được hàng rào máu não, nhau thai, sữa mẹ. Tuy nhiên heroin qua hàng rào máu não tốt hơn morphin. Chuyển hóa và thải trừ: các chất opiat chủ yếu chuyển hóa ở gan. Quá trình chuyển hóa bao gồm rất nhiều phản ứng, trong đó phổ biến nhất là các phản ứng thủy phân được nối tiếp bởi các phản ứng liên hợp với acid glucuronic, đồng thời có cả các phản ứng loại nhóm alkyl gắn vào Nitơ. Trong quá trình chuyển hóa, heroin nhanh chóng bị thủy phân, loại acetyl tạo 6-monoacetylmorphin, chất này tiếp tục bị loại acetyl, nhưng với tốc độ chậm hơn tạo morphin. Phần lớn lượng morphin tạo ra được chuyển hóa dưới dạng liên hợp với acid glucuronic tạo thành 2 dạng sản phẩm, dạng có hoạt tính morphin-6-glucuronic (M-6-G) và dạng không có hoạt tính morphin-3glucuronic (M-3-G). M-6-G giữ vai trò rất quan trong đối với tác dụng trên hệ thần kinh của morphin. Đối với codein, xảy ra quá trình loại acetyl ở C3 tạo morphin, các giai đoạn còn lại giống nhau đối với cả heroin và morphin. Bên cạnh đó, codein cũng được tìm thấy trong nước tiểu người sử dụng heroin, tuy nhiên đây là sản phẩm thủy phân tách loại acetyl của tạp chất acetylcodein có trong heroin.   8 Các sản phẩm chuyển hóa được lọc qua cầu thận, sau khi tiêm tĩnh mạch heroin 20-40 giờ, lượng M-3-G trong nước tiểu là 38,2%, morphin tự do là 4,2%, 6-MAM là 1,3% và heroin tự do là 1,3%. Khoảng 90% sản phẩm chuyển hóa được bài tiết vào nước tiểu trong 24 giờ đầu. Tuy nhiên, do quá trình chuyển hóa có chu kỳ gan ruột nên có một lượng nhỏ morphin có thể tồn tại trong phân, trong nước tiểu vài ngày. thời gian bán thải của morphin khoảng 2-3 giờ ở người bình thường. Thời gian bán thải (t1/2) của heroin khoảng 5 phút. Quá trình này xảy ra tương tự morphin. Dựa vào quá trình chuyển hóa của các chất nhóm opiat, người ta xác định 6- MAM chính là sự khác biệt của heroin so với các nhóm opiat được phép sử dụng trong y học như codein, morphin. Điều đó chứng tỏ vì sao 6- MAM được ghi nhận là dấu hiệu đặc hiệu chứng minh cho việc sử dụng heroin ở người nghiện [5], [6], [9]   9 Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat   10 1.3. Chất chuyển hóa 6-MAM 1.3.1. Cấu tạo, tính chất 6-MAM - Cấu trúc hóa học   Tên gọi: 6-monoacetylmorphin, 6-acetylmorphin, 6-MAM Công thức phân tử: C19H21NO4 Phân tử lượng: 327,374 g/mol Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM 3-hydroxy-6-acetyl-(5α,6α)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan - Tính chất: 6-MAM tồn tại ở 2 dạng: dạng base và dạng muối ngậm 1 phân tử hydroclorid hoặc hydrat ngậm 3 phân tử nước. Dạng base có nhiệt nóng chảy 2000C, 1900C (DSC), tan rất ít trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol, chloroform. Dạng muối có nhiệt nóng chảy 265- 2670C, 3130C (DSC), tan trong nước và các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, chloroform [28]. - Đặc điểm 6-MAM có thời gian bán thải ngắn 0,6giờ. Thời gian phát hiện 6-MAM trong nước tiểu ngắn, khoảng 2-8 giờ, nồng độ 6-MAM trong nước tiểu rất thấp so với morphine, vì vậy rất khó để phát hiện. Có nhiều tài liệu khác nhau về sự ổn định của 6-MAM trong nước tiểu. Rop và các cộng sự cho rằng 6-MAM được thủy phân hoàn toàn trong nước trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ phòng, và 9% bị thủy phân sau 14 ngày ở nhiệt độ -200C [24].   11 Poochikian và Cradock thấy rằng hơn 50% 6-MAM bị mất đi sau 9 ngày giữ trong môi trường pH 8.6 ở nhiệt độ phòng [23]. Paul và các cộng sự cho hay 44% 6-MAM bị mất sau 2 tuần trong nước tiểu (pH=6,8), trong khi Barrett và các cộng sự phát hiện 6- MAM không bị thủy phân ở pH 4,0- 7,4 trong cùng điều kiện [22]. Fuller và Anderson nhận thấy rằng cần 12 tuần để thủy phân hoàn toàn 6- MAM trong nước tiểu thành morphintrong điều kiện pH 8,0 tại nhiệt độ phòng. Tỷ lệ thủy phân của 6- MAM biến thiên trong khoảng rộng là do sự khác biệt về lực ion của mỗi hệ đệm sử dụng trong mỗi nghiên cứu khác nhau [16]. - Tình hình nghiên cứu 6-MAM trên thế giới Trên thế giới, định lượng 6-MAM trong nước tiểu được thực hiện từ khá lâu. Năm 1989, B.D.Paul và các cộng sự đã tiến hành định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng phương pháp GC-MS. Năm 1992, P.P. Rop và các cộng sự thực hiện phát hiện 6-MAM trong huyết tương, máu, nước tiểu bằng phương pháp HPLC. Tuy nhiên về cơ bản phương pháp GC-MS vẫn được sử dụng nhiều hơn cả [22], [24]. Xung quanh việc 6-MAM có phải là dấu hiệu đặc hiệu trong phân tích, phát hiện đối tượng sử dụng heroin cũng có nhiều nghiên cứu: Năm 1997, Carol L.O’Neal và Alphonse Poklis nghiên cứu về việc bổ sung acetylcodein (AC) như một dấu hiệu phát hiện người sử dụng heroin. AC là một tạp được tìm thấy trong heroin, có lượng thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc heroin, độ ổn định trong nước tiểu cao hơn so với 6-MAM. Trong nghiên cứu này độ nhạy của AC với GC-MS cũng rất tốt. Giới hạn phát hiện (LOD) của AC là 0,5µg/L, giới hạn định lượng (LOQ) là 1.0µg/L. Trong khi   12