Tài liệu Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG 1301056 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và PGS.TS Vũ Đặng Hoàng đã tận tình hướng dẫn, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên ở Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt năm năm học qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2 1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin ........................................................ 2 1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin ................................................. 2 1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ..... 3 1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước .......................................... 5 1.2.1. Pha tĩnh ............................................................................................... 5 1.2.2. Pha động ............................................................................................. 6 1.2.3. Cơ chế tách.......................................................................................... 7 1.2.4. Ưu điểm ............................................................................................... 8 1.2.5. Nhược điểm ......................................................................................... 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 10 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 10 2.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 10 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 10 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 10 2.2.3. Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 11 2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động ............................................................ 12 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 13 2.3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................... 15 2.4. Áp dụng phương pháp .............................................................................. 18 2.5. Xử lý kết quả ............................................................................................ 18 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 19 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 19 3.1.1. Khảo sát pha tĩnh ............................................................................. 19 3.1.2. Khảo sát pha động ............................................................................ 20 3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu ............................................................. 23 3.1.4. Khảo sát về thể tích tiêm mẫu .......................................................... 23 3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện .......................................................... 24 3.2. Phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ....................... 24 3.3. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 25 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................... 25 3.3.2. Độ chọn lọc ....................................................................................... 25 3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................... 26 3.3.4. Độ lặp lại........................................................................................... 28 3.3.5. Độ đúng ............................................................................................. 29 3.3.6. Độ thô ................................................................................................ 31 3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường ................... 32 3.4.1. Công thức tính ................................................................................... 32 3.4.2. Kết quả định lượng ............................................................................ 32 3.5. Bàn luận chung ......................................................................................... 33 3.5.1. Ưu điểm của phương pháp ................................................................ 33 3.5.2. Nhược điểm của phương pháp .......................................................... 34 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 35 4.1. Kết luận .................................................................................................... 35 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 35 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril CIL Cilastatin Cilastatin DHP-1 Enzyme dehydropeptidase-I Enzym dehydropeptidase-I HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography IMI Imipenem Imipenem IPC Ion – pair Chromatography Sắc kí tạo cặp ion NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận LC-MS Liquid Chromatography - Mass Sắc kí lỏng khối phổ Spectrometry RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo UV Ultraviolet Tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL ......................................................... 2 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng ............. 4 Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát ........................................................ 14 Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn .................................................. 16 Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng........................................... 18 Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống………………………………………..25 Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc ............................................................................ 26 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.................................................... 26 Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày ....................................... 29 Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL .................................................................... 30 Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI .................................................................... 30 Bảng 3.7. Kết quả độ thô ..................................................................................... 31 Bảng 3.8. Kết quả định lượng imipenem trong chế phẩm .................................. 33 Bảng 3.9. Kết quả định lượng cilastatin trong chế phẩm .................................... 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin ..................................................... 3 Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC ....................................................................... 7 Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh .................................................................... 19 Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động ............................................... 20 Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng .............................................................. 23 Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI………………………………………................24 Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL…………………………………………………24 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Cilastatin ................................................................................................. 27 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của imipenem ................................................................................................ 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong công tác phòng và điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh do nhiễm khuẩn. Các kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng rất phổ biến ở Việt Nam nhưng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc cũng khá cao, trong số đó có imipenem [5]. Imipenem có phổ tác dụng rất rộng trên phần lớn các vi khuẩn Gram dương, Gram âm, ưa khí, kị khí và bền vững với các β-lactamase của vi khuẩn nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. Tuy nhiên, nó lại bị phân hủy bởi enzym dehydropeptidase-I (DHP-I) ở ống thận, do vậy nó thường được kết hợp với cilastatin, một chất ức chế DHP-I, trong các chế phẩm thuốc tiêm [3],[16]. Theo Cục Quản lí Dược Việt Nam, từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 có 15 số đăng kí trong nước và 47 số đăng kí nước ngoài với chế phẩm chứa hai hoạt chất trên [4]. Để đảm bảo được hiệu quả điều trị của imipenem trong lâm sàng cũng như giảm tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc, cần kiểm soát tốt hàm lượng của imipenem trong các chế phẩm được sản xuất và lưu hành tại Việt Nam. Imipenem và cilastatin chủ yếu được phân tích bằng kỹ thuật sắc kí tạo cặp ion vì chúng có độ phân cực cao [2],[13],[20]. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không thể dùng cột để phân tích pha đảo với đối tượng khác [8]. Một kỹ thuật khác có thể dùng để phân tích hai hợp chất trên là sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC). HILIC sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh phân cực nên lưu giữ tốt các hợp chất phân cực như imipenem và cilastatin. Theo tôi tìm hiểu, tính đến nay trên thế giới mới có một số ít nghiên cứu sử dụng HILIC để định lượng imipenem và cilastatin trong chế phẩm, còn tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước” với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng HILIC. 2. Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng imipenem và cilastatin trong một chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin 1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin Imipenem (IMI) là một kháng sinh carbapenem trong nhóm β-lactam, có phổ tác dụng rất rộng nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. IMI thường được kết hợp với cilastatin (CIL) để ức chế sự phân huỷ của IMI ở thận bởi enzyme DHP-I. Đặc điểm cấu tạo và một số tính chất lý hóa của IMI và CIL được liệt kê trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL Đặc điểm IMI CIL Công thức cấu tạo Công thức C12H17N3O4S C16H26N2O5S 299,3 358,4 Acid (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxy acid (Z)-7-[[(R)-2-amino-2- ethyl]-3-[[2[(iminomethyl) carboxyethyl]sulphanyl]-2- phân tử Phân tử lượng (g/mol) Danh pháp amino]ethyl]sulphanyl]-7-oxo-1- [[[(1S)-2,2-dimethylcyclopropyl] azabicyclo[3.2.0]hept-2-en-2- carbonyl]amino]hept-2-enoic carboxylic Tính chất vật lí Bột màu trắng, trắng ngà hay Bột vô định hình màu trắng hay vàng nhạt. Hơi tan trong nước, hơi vàng, hút ẩm. Rất dễ tan trong khó tan trong methanol [2]. nước và methanol, khó tan trong ethanol khan [2]. Tính chất hóa pka1 = 3,2 và pka2 = 9,9. pka1 = 2,53 và pka2 = 9,14. học Lg P = -3,9 [24]. Lg P = -1,3 [23]. Độ ổn định Bị phân hủy trong môi trường acid và base. 2 Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều chế phẩm chứa hỗn hợp IMI và CIL đang được lưu hành. Các hàm lượng hay được sử dụng là IMI 500 mg (hoặc 750 mg) và CIL 500 mg (hoặc 750 mg) với dạng bột để pha tiêm bắp; IMI 250 mg (hoặc 500 mg) và CIL 250 mg (hoặc 500 mg) với dạng bột để pha tiêm truyền tĩnh mạch [3]. 1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin Trên thế giới có một số nghiên cứu về phân tích đồng thời IMI và CIL trong chế phẩm. Phương pháp quang phổ đạo hàm được áp dụng để phân tích đồng thời hai chất này [9],[17]. Tuy nhiên, do IMI dễ bị phân hủy thành thienamycin [16] có cấu trúc gần giống IMI (hình 1.1) nên việc sử dụng phương pháp quang phổ đạo cần cân nhắc tới khả năng bị phân hủy của IMI. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay được sử dụng để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm do có thể tách riêng được tạp chất. IMI và CIL là những hợp chất phân cực có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại (UV) nên phương pháp hay được sử là sắc kí tạo cặp ion (IPC) và HILIC kết nối với detector tử ngoại. Trong đó, IPC được sử dụng phổ biến hơn và được quy định trong một số dược điển [2],[13],[20]. Chất tạo cặp ion được sử dụng ở đây là natri hexansulfonat do nó có khả năng tạo cặp với các nhóm chức amin của IMI và CIL. Sản phẩm tạo thành sau khi tạo cặp ion có độ phân cực kém hơn so với IMI và CIL, do đó chúng được lưu giữ tốt hơn trên pha tĩnh kém phân cực. Việc sử dụng kĩ thuật sắc kí tạo cặp ion có ưu điểm là sử dụng các loại cột pha đảo thông dụng hiện nay. Tuy nhiên, nó có nhược điểm là chất tạo cặp ion lưu giữ rất tốt trong cột, do vậy thường không thể sử dụng cột để phân tích pha đảo. HILIC là kĩ thuật mới hơn có khả năng phân tích trực tiếp IMI và CIL do có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. Bảng 1.2 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về phân tích đồng thời IMI và CIL bằng sắc kí lỏng. 3 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng STT Tác giả Phương Điều kiện tiến hành pháp Pha tĩnh Pha động Kết quả Bước tR CIL tR IMI sóng 1 2 Dược điển Cột C18 (250 x 4,6 Natri hexansulfonat trong dung dịch đệm Việt Nam V mm, 10 µm) duy trì phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng 2 ml/phút. [2] ở 50 ± 1oC. Dược điển IPC IPC Nhật 16 [13] Cột C8 (200 x 4,6 Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic, mm, 10 µm) duy trì natri 1-hexan sulfonat và dinatri dihydrogen ở khoảng 50oC. ethylendiamin tetracetat dihydrat trong 254 nm Khoảng 250 nm 3 phút nước, pH 7,0. 3 USP 38 [20] IPC Cột C18 (300 x 4,6 Natri 1-hexansulfonat trong dung dịch đệm 254 nm mm) duy trì ở 50 ± phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng khoảng 2 ml/ 4 Natalija Nakov [16] HILIC 1oC. phút. Cột Purospher Hỗn hợp ACN : amoni format (45 mM, pH STAR (150 × 4,6 5,5) = 68:32 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. mm, 5 µm) duy trì ở 25°C. 4 254 nm 3,5 phút 4,8 phút Trên thế giới hiện nay mới có một số ít nghiên cứu sử dựng HILIC để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm. Nghiên cứu của N. Nakov [16] sử dụng pha động gồm hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm amoni format 45 mM, pH 5,5 để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm cho kết quả về thời gian lưu của các chất ngắn (dưới 5 phút). Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là hệ số kéo đuôi của cilastatin lớn (AS(CIL)= 1,6), hệ số chắn của đường chuẩn cao (Y-intercept của CIL và IMI lần lượt là -2,6% và -8,8%). Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài với mục đích xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC và cải thiện được các hạn chế của nghiên cứu trên. 1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước HILIC là kĩ thuật sắc kí lỏng sử dụng pha tĩnh phân cực giống sắc kí lỏng pha thuận (NPLC) và pha động phân cực giống sắc kí lỏng pha đảo (RPLC) [7]. So với RPLC, HILIC có khả năng lưu giữ tốt hơn các chất phân cực. So với NPLC, HILIC sử dụng dung môi pha động ít độc hại hơn và tăng khả năng hòa tan các chất phân cực. Đối tượng phân tích của HILIC thường là các hợp chất phân cực, như các acid amin [6], peptid [14], kháng sinh [21], carbohydrat [10]… 1.2.1. Pha tĩnh Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica và dẫn xuất của nó. Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC [7]. Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số lượng cột polyme trên thị trường cũng như các nghiên cứu về HILIC trên cột polyme là không nhiều. Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia thành 2 loại là silica không dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa. - Silica không dẫn xuất: Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica. Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động có pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. So với RPLC, các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần khi tách các hợp chất phân cực [8]. Nhược điểm của nó là có thể xảy ra hiện tượng quá tải cột. 5 - Silica dẫn xuất hóa: Theo trạng thái tích điện, pha tĩnh silica dẫn xuất hóa được chia thành các nhóm sau: + Trung tính: amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin… + Lưỡng cực: sulfoalkyl betain… + Tích điện dương: amino propyl, silica bao latex… +Tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic, poly hydroxyethyl A, poly sulfoethyl A. Pha tĩnh silica không dẫn xuất được sử dụng phổ biến hơn loại dẫn xuất hóa do rẻ hơn và khả năng lưu giữ tốt với nhiều chất. 1.2.2. Pha động HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril (ACN) cùng với một lượng nhỏ nước [7]. Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ bay hơi thường được sử dụng. Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18]. Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi không proton đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng làm pha động cho HILIC (ví dụ như dioxan hoặc tetrahydrofuran). Alcol cũng có thể được sử dụng, tuy nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích so với các dung môi khác [11]. Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải: Aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl formamid ~ methanol < nước [7]. Thông thường, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của chất phân tích. Đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động và lực ion. Trong HILIC, chúng làm thay đổi sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích. Đối với chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất [7]. Đối với các chất phân tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động. Nếu trong cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion, nồng độ đệm tăng sẽ 6 làm giảm thời gian lưu. Trong trường hợp tương tác ion không ảnh hưởng đến việc lưu giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém). Nồng độ đệm thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19]. Các loại đệm hay được sử dụng là đệm acetat và đệm format do có khả năng bay hơi, thuận lợi trong việc kết nối với detector khối phổ. Đệm phosphat ở nồng độ thấp cũng có thể được sử dụng trong trường hợp phân tích không sử dụng detector khối phổ. Đệm phosphat có ưu điểm là có khoảng pH đệm rộng do dó phân tách tốt nhiều chất, tuy nhiên lại dễ bị tủa trong ACN tỷ lệ cao. Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như natri perclorat 100-300 mM) có thể được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong muốn. Tuy nhiên do các muối này không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để sử dụng trong sắc kí lỏng kết nối với khối phổ [7]. HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ. 1.2.3. Cơ chế tách Về cơ bản, có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách trong HILIC: thứ nhất là sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt của pha tĩnh; thứ ba pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, tiếp theo các chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [7]. Hiện nay, cách mô phỏng thứ ba được thừa nhận rộng rãi. Hình 1.2 minh họa cơ chế tách này: Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC 7 Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề mặt pha tĩnh. Chất phân tích khi đi qua cột sắc kí sẽ được phân bố giữa pha động và lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này. Như vậy, chất phân tích càng phân cực, nó sẽ được lưu giữ lâu hơn trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Nói cách khác, quá trình phân tách phụ thuộc vào độ phân cực của chất phân tích và lớp solvat hoá trên bề mặt pha tĩnh. Khi nồng độ ACN (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực. Khi nồng độ của nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, và lượng nước hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi [7]. Nói chung, thông thường khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động, hay nói cách khác là giảm độ phân cực của pha động thì thời gian lưu của chất phân tích trong HILIC cũng sẽ tăng theo [8]. Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể có thêm các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh. 1.2.4. Ưu điểm HILIC có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sắc kí khác khi phân tích các chất phân cực. Trong RPLC, do sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh kém phân cực nên các chất phân tích phân cực mạnh sẽ không được lưu giữ hoặc lưu giữ kém. Trái lại, trong HILIC chất phân tích được phân bố ở cả lớp dung môi thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng lưu giữ các chất phân tích phân cực. NPLC hoặc IPC hay được sử dụng trong việc phân tích các hợp chất phân cực. Tuy nhiên, do NPLC sử dụng dung môi pha động độc hại và khả năng hòa tan chất phân tích phân cực [8] kém nên nó không phải là phương pháp tối ưu cho việc phân tích các chất phân cực. Khác với NPLC, HILIC sử dụng các dung môi thân thiện hơn (như ACN, nước… ), và hòa tan tốt chất phân tích phân cực. IPC có nhược điểm lớn là cột sau khi đã sử dụng bằng phương pháp này thường không thể sử dụng cho mục đích khác, tốn nhiều thời gian để ổn định hệ thống và rửa cột do chất tạo cặp ion bị lưu giữ mạnh hoặc tạo liên kết với pha tĩnh. Chính vì những lí do trên mà HILIC có ưu diểm vượt trội khi phân tích các hợp chất phân cực. 8 HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao có độ nhớt thấp nên có thể tiến hành được ở áp suất thấp hơn. Độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian phân tích [7]. Với các chất phân cực hấp thụ UV kém như các acid amin, HILIC có thể định lượng trực tiếp các chất tại bước sóng thấp do sử dụng dung môi có bước sóng tới hạn thấp [6]. Khi phân tích các hợp chất này bằng RPLC cần phải dẫn xuất hóa, vì vậy gây khó khăn cho việc định tính và định lượng chất. Trong khi đó, pha động HILIC (thường sử dụng ACN có bước sóng tới hạn là 190 nm [1]) cho phép lưu giữ ở thời gian lưu thích hợp, xác định trực tiếp nhiều chất tại bước sóng thấp cỡ 200 nm, giảm bớt công đoạn tạo dẫn xuất trong định tính, định lượng chất. HILIC có khả năng kết nối với detector khối phổ [22] nhờ pha động có chứa lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, dễ hóa hơi, thích hợp với LC-MS. Đối với RPLC, khi phân tích các hợp chất phân cực thường sử dụng pha động chứa tỷ lệ nước cao, khó hóa hơi nên không phù hợp với LC-MS. Ngược lại, pha động không phân cực của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất phân cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [8] khi phân tích bằng LC-MS. 1.2.5. Nhược điểm Bên cạnh các ưu điểm đã trình bày ở trên, HILIC cũng có một số nhược điểm như: - Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC. - Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion. - Tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC và NPLC. - Phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế. 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam của Merck Sharp & Dohme Corp. Mỗi lọ chứa một lượng bột tương đương với 500 mg imipenem và 500 mg cilastatin. Ngoài ra, chế phẩm còn chứa natri bicarbonat vô khuẩn là tá dược không có hoạt tính. 2.2. Nguyên vật liệu 2.2.1. Hóa chất - Thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam: Nhà sản xuất Merck Sharp & Dohme Corp., số lô sản xuất: N026757 và N023795, hạn dùng: 27/04/2019 và 13/02/2019. - Chuẩn imipenem: Hàm lượng 93,74% của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. - Chuẩn cilastatin natri: Hàm lượng 95,54% Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. - Tá dược natri bicarbonat: Nhà sản xuất CTCP DPDL PHARMEDIC – Việt Nam. - Acetonitril dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Methanol dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau – Tây Ban Nha. - Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Acid acetic băng dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Acid formic dùng cho MS: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Natri hydroxyd: Sản xuất bởi Merck – Đức. - Nước cất hai lần. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm chemstation. - Cột sắc kí: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Sigma Aldrich) và cột Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent). - Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan). - Máy lọc hút chân không Rocker 400. - Màng lọc cellulose 0,45 µm. - Cân phân tích Sartorius TE214S và cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE 105 – Thụy Sĩ (d = 0,01 mg). - Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan). 10 - Máy đo pH Mettler Tolero . - Pipet chính xác 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, 4,00 ml, 5,00ml, micro pipet 1001000 µl (Đức). - Bình định mức: 5,00 ml, 10,00 ml, 20,00 ml, 100,0ml. - Tủ lạnh sâu PANASONIC MDF-594. - Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, đũa thủy tinh, vial. 2.2.3. Chuẩn bị mẫu - Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước vào bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40. - Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat vào bình định mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này vào bình định mức 10,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách pha mẫu của DĐVN V [2]). - Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI và 22,2 mg CIL natri vào hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI và CIL nồng độ 2000 ppm. Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 ppm vào bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này, dùng pipet chính xác và bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm, 200 ppm, 150 ppm, 100 ppm và 75 ppm. - Dung dịch mẫu thử: + Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh khô và sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp. Cân khối lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với 500 mg IMI và 500 mg CIL. + Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam vào bình định mức 10,00 ml, hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có 11