Tài liệu Xây dựng phương pháp elisa gián tiếp xác định dư lượng fluoroquinolone trong sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= HẮC BÁ THÀNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 1 http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Học viên: HẮC BÁ THÀNH Hà Nội - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 2 http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 7 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU……………………………………….. 9 1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………………………………………… 9 1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………9 1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng………………………………………………… 9 1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone…………. 12 1.1.4. Ngƣỡng giới ha ̣n cho phép ở mô ̣t số thƣ̣c phẩ m…………………………… 18 1.2. Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone……. 22 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC-MS)…... 22 1.2.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay)………… 23 1.2.2.1. Nguyên lý phƣơng pháp ELISA…………………………………………. 24 1.2.2.2. Các phản ứng ELISA…………………………………………………….. 25 b. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)……………………………………………... 26 c. ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)……………………………………….. 28 1.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp ELISA……………………………………………. 29 1.4. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi……………………………… 29 1.5. Tác hại của Fluoroquinolone tồn dƣ trong thực phẩm………………………. 30 1.6. Tác hại của Fluoroquinolone đến môi trƣờng……………………………….. 31 1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng ELISA phát hiện dƣ lƣợ ng Fluoroquilone……………………………………………………………………... 32 1.5.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc………………………………………………… 32 1.5.2. Các nghiên cứu trong nƣớc………………………………………………… 34 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………………… 36 2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………….. 36 2.1.1. Dụng cụ, thiết bị……………………………………………………………. 36 2.1.2. Hoá chất……………………………………………………………………. 36 2.1.3. Các dung dịch đệm…………………………………………………………. 37 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………….. 38 2.2.1. Mục tiêu của nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.2. Địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu………………………………………… 38 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 3 http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.3.1. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….. 38 a. Phƣơng pháp tổ ng hơ ̣p hapten gắ n LEV với OVA/BSA……………………….. 38 b. Phƣơng pháp ta ̣o kháng thể đa dòng kháng LEV trên thỏ…………………….. 40 c. Phƣơng pháp ELISA gián tiế p xác đinh ̣ dƣ lƣơ ̣ng LEV………………………... 41 2.2.3.2. Giới hạn phát hiện nồng độ và độ đặc hiệu của nghiên cứu…………….. .44 2.2.3.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của LEV khi gây nhiễm nhân tạo……………. 44 2.2.3.3. Chuẩn bị mẫu sữa………………………………………………………… 45 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………. 47 3.1. Các thông số phản ứng ELISA gián tiếp…………………………………….. 48 3.2. Kết quả phản ứng ELISA gián tiếp………………………………………….. 48 3.5. Đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp………………………………………..55 3.6. Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV trong sữa……………………… 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 59 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 4 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [16]......................................................................................... 19 Bảng 3.1. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA........................................................ 47 Bảng 3.2. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA........................................................ 48 Bảng 3.3. Bảng kết quả hiệu suất thu hồi................................................................. 53 Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng LEV ở các mẫu sữa……………………54 DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone.......................................................... 8 Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin ................................................................... 11 Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin ........................................................................ 11 Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin .................................................................... 12 Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin ....................................................................... 13 Hình 6. Cấu trúc phân tử Marbofloxacin ................................................................. 13 Hình 7. Cấu trúc phân tử Orbifloxacin..................................................................... 14 Hình 8. Cấu trúc phân tử Sarafloxacin ..................................................................... 14 Hình 9. Cấu trúc phân tử Levofloxacin .................................................................... 15 Hình 10. Sơ đồ các phản ứng ILISA……………………………………………..23 Hình 11. Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp .............................................................. 25 Hình 12. Tổng hợp liên hợp của LEV với OVA (LEV - OVA) .............................. 38 Hình 13. Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh ………………………….………...41 Hình 14. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn ...................................................... 51 Hình 15. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn…………………………………49 Hình 16. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn gốc....................................................................................................................50 Hình 17. Cấu trúc phân tử của Fluoroquinolone………………………………..51 Hình 18. Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo của Fluoroquinolone…………………...52 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 5 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ELISA HPLC GC-MS OD TMB EU FAO WHO MRLs FDA PBST PBS SD HPRO QĐ TT - BNN Enzym - Link Immuno sorbent Assay High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) Gas Chromatography/Mass Spetrometry (Sắc ký khí - khối phổ) Optical Density (Mật độ quang học) 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine Liên minh Châu Âu Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc Tổ chức y tế thế giới Maximum Residual Limit Food and Drug Administration Phosphate buffer saline Tween Phosphate buffer saline Standard deviation (độ lệch chuẩn) Horseradish peroxidase Quyết định Thông tƣ - Bộ nông nghiệp Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 6 http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Fluoroquilone là mô ̣t trong nhƣ̃ng nhóm kháng sinh tổ ng hơ ̣p hoá ho ̣c , có tác dụng diệt khuẩn rộng hiệu quả, có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn một cách nhanh chóng nên kháng sinh nhóm Fluoroquilone ngày càng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhiề u trong phòng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và thuỷ sản. Trƣớc thực trạng nguy cơ và kiểm soát dịch bệnh chƣa thật nghiêm ngặt, dƣ lƣợng của loại kháng sinh này thƣờng tìm thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp nhƣ thịt, cá, trứng, sữa,...Trong quá trình nuôi dƣỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lƣợng Fluoroquilone còn lại trong thịt, sữa, gia cầm và thủy sản...Việc lạm dụng kháng sinh Fluoroquilone trong phòng bệnh, điều trị, kích thích sinh trƣởng hay bảo quản đối với ngành chăn nuôi dẫn đến sự tồn dƣ kháng sinh trong chăn nuôi, vì thế ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức khoẻ ngƣời tiêu dùng. Điều này gây nhiều mối nguy hiểm, hiện tƣợng kháng thuốc của một số vi khuẩn nhƣ: Salmonella, Campylobaccer spp, Escherichia coli,…hậu quả là giảm hiệu quả của kháng sinh nói chung, kháng sinh dòng Fluoroquilone nói riêng đối với các chủng vi khuẩn. Để bảo vệ ngƣời tiêu dùng ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dƣ lƣợng thuốc kháng sinh trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con ngƣời vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định lƣợng của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EU in 1996” [12], trong đó quy định rõ hàm lƣợng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ nhƣ với Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Âu, Hoa kỳ và các nƣớc Bắc Mỹ đã cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Tồ n dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩ m ảnh hƣởng xấ u đế n sƣ́c khoẻ cô ̣ng đồ ng và môi trƣờng . Đây là mô ̣t trong nhƣ̃ng nguyên nhân gây nên các bê ̣nh nan y , tăng nguy cơ di ̣ƣ́ng, tăng khả năng xuấ t hiê ̣n cá c nguồ n gen kháng thuố c ở các chủng vi Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 7 http://www.lrc.tnu.edu.vn sinh vâ ̣t gây bê ̣nh . Viê ̣c tồ n dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩ m (thịt, thuỷ hải sản , trƣ́ng, sƣ̃a,…) là rất phổ biến ở nƣớc ta . Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà quan trọng hơn là ảnh hƣởng đến uy tín các sản phẩ m nông nghiê ̣p nƣớc ta, ảnh hƣởng nghiêm trọng đế n sƣ́c khoẻ con ngƣời và môi trƣờng. Đã nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc nghiên cứu nhằm phát hiện dƣ lƣợng kháng sinh Fluoroquilone trong thực phẩm nhƣ HPLC, LC-MS, GC-MS, … với độ chính xác cao, bên cạnh các đặc điểm ƣu việt, phƣơng pháp trên yêu cầu cao về thiết bị, hóa chất, trình độ sử dụng. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) là phƣơng pháp miễn dịch dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể đã có ứng dụng nhiều trong xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm, môi trƣờng, y học… Mục đích của nghiên cứu này là dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng tôi xây dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiế p xác đinh ̣ dƣ lƣơ ̣ng kháng sinh Levofloxacin trong sƣ̃a ở điề u kiê ̣n phòng thí nghiê ̣m. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 8 http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone 1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone Quinolone (Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Difloxacin, Marbofloxacin, Ofloxacin...) là nhóm kháng sinh nhân tạo gồm những dẫn xuất của quinolein. Quinolone đầu tiên (acid nalidixic) có phổ kháng khuẩn hẹp (tác dụng trên vi khuẩn Gram âm). Kháng sinh đầu tiên trong nhóm là acid nalidixic đƣợc phát hiện vào năm 1962, đƣợc phân lập nhƣ một tạp chất trong sản xuất quinine sau đó một loạt các quinolon thế hệ I đƣợc tổng hợp nhƣ cinoxacin, oxolinic, pipermidic…Trong cấu trúc không gian không có nhân piperidin và không có nguyên tử Flour. Quinolon thế hệ I có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng trên vi khuẩn gram âm (trừ Pseudomonas aeruginosa) [1,10]. Hiện nay quinolon thế hệ I nhanh chóng bị kháng thuốc nên hạn chế đƣợc sử dụng [11]. Quinolone đƣợc fluor hóa gọi là Fluoroquinolone đã đƣợc đƣa vào sử dụng trong lâm sàng vào những năm 1970. Fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: Phổi, gan, mật, xƣơng, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy... và qua đƣợc hàng rào nhau thai. Fluoroquinolone bài thải chủ yếu qua đƣờng tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận.[1,2,10] do vậy nhóm Fluoroquilone đƣợc sử dụng trong y học, chăn nuôi thú y, thủy sản…[10,11]. 1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng Fluoroquilone là gốc thuốc kháng sinh hiệu quả, phổ rộng đƣợc sử dụng nhiều và phổ biến cả ở ngƣời và động vật (trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản…). Tuy nhiên tác dụng phụ của chúng đã đƣợc xác nhận. Sử dụng quá liều và Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 9 http://www.lrc.tnu.edu.vn tồn dƣ các gốc thuốc này trong thực phẩm là vấn đề không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Fluroquinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có khả năng khuếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó đƣợc sử dụng phổ biến và hiệu quả trong thú y. Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trƣờng và sức khoẻ cộng đồng (WHO, 1998). Nhóm Fluroquinolones đƣợc sử dụng trong thú ý gồm các loại sau: Danofloxacin (Advocin, Advocid), Difloxacin (Dicural,Vetequinon), Enrofloxacin (Baytril), Ibafloxacin (Ibaflin), Marbofloxacin (Marbocyl, Zenequin), Orbifloxacin (Orbax, Victas), Sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin). Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn xuất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí: Có gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: Có thể gắn thêm F; vị trí 2,6,8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [15]. Cơ chế tác động của Fluoroquinolone là ức chế tổng hợp acid nucleic. Gốc quinolone (acid nalidixic và các Fluoroquinolone) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzyme DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Các quinolon đều ức chế tổng hợp AND - gyrase, là enzym mở vòng xoắn AND, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 http://www.lrc.tnu.edu.vn vậy ngăn cản sự tổng hợp AND của vi khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng trên cả ARNm nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon đều là kháng sinh diệt khuẩn [10]. Quinolon thế hệ 1: Acid nalidixic, acid oxolinic, cinocacin, flumequin, acid pipemidic, acid promidic…Quinolon thế hệ 1 chỉ ức chế AND- gyrase nên chỉ có tác dụng diệt vi khuẩn gram âm đƣờng tiết niệu và đƣờng tiêu hóa, không có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) [10,11]. Các Fluoroquinolon có tác dụng trên 2 enzym đích là AND gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn, nên phổ kháng khuẩn rộng hơn. Hoạt tính kháng khuẩn mạnh so với quinolon thế hệ 1 từ 10 - 30 lần [10]. Phổ kháng khuẩn của các Fluoroquinolon gồm: E. coli, Salmonela, Shigella, Enterobacter, Neisseria spp, P. aeruginosa, Eterococi, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp, Proteus mirabilis, Morganella morgani, Morganella catarrhalis, Haemophilus fluenzae, Bacteroides fragilis, Streptococus pneumonia, Streptococcus aureus kể cả loại đã kháng methicilin. Các vi khuẩn trong tế bào cũng bị ức chế bởi nồng độ Fluoroquinolon trong huyết tƣơng nhƣ Chlamydia, Mycoplasma, Brucella, Mycobacterium [10]. Quinolon thế hệ 2: Rosoxacin, Norfloxacin, Lomefloxacin, Ofloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin, có khác tƣơng đối về tác động gyrase và topoisomerase IV: Trên vi khuẩn gram âm hiệu lực kháng gyrase mạnh hơn, còn trên vi khuẩn gram dƣơng lại có hiệu lực kháng topoisomerase IV mạnh hơn thế hệ 1, đặc biệt là chúng có tác dụng trên Pseudomonas aeruginosa có tác dụng nhanh và mạnh hơn do khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài gram âm chúng còn tác dụng trên cả gram dƣơng, trừ Pseudomonas aeruginosa [3,10,11]. Quinolon thế hệ 3: Amifloxacin, Levofloxacin, Lerofloxacin, Pefloxacin, Rufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin tác động cân bằng trên 2 enzym, vì vậy phổ kháng khuẩn phổ rộng trên gram dƣơng kể cả Streptococus pneuminiae nhƣng trên Pseudomonas aeruginosa tác dụng yếu hơn so với Ciprofloxacin. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 http://www.lrc.tnu.edu.vn Quinolon thế hệ 4: Moxifloxacin, Trovafloxacin, phổ tác dụng trên tất cả các loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng hiếu khí, trên Streptococus pneuminiae tác dụng gấp 10 lần so với Ciprofloxacin và mạnh gấp 2 lần so với Sparfloxacin [10], ngoài ra tất cả các kháng sinh trong nhóm còn có tác dụng trên vi khuẩn kỵ khí. Riêng moxifloxacin nhạy cảm trở lại với các vi khuẩn kháng với các kháng sinh nhóm quinolon [10,13,14]. Nhƣng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acidnucleic này mà kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đƣợc cho là có nguy cơ gây đột biến gene, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai và khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra, sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có thể gây rối loạn phát triển xƣơng. Nguyên nhân có thể do kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có phản ứng các ion hóa trị II (Mg2+). Nghiên cứu của Jason et al. (2009) trên cừu non đã cho thấy kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đã gây tác động lớn, làm cho hệ xƣơng, sụn hầu nhƣ không phát triển trong thời gian sử dụng kháng sinh nhóm này. Trƣớc đây, đã có các nghiên cứu về việc ảnh hƣởng đến sự phát triển xƣơng, sụn của thú non (chó, cừu) khi sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone nhƣng do hiệu quả điều trị và mức độ cần thiết của các kháng sinh nhóm kháng sinh này mà ngƣời ta đã bỏ qua tác hại của nó. Bên cạnh đó, sự tồn lƣu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này. 1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone - Danofloxacin: + Tên khoa học: (1S)-1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-7-(5-methyl-2,5diazabicyclo[2.2.1]hept-2-yl)-4-oxo-3-quinoline cacboxylic axit methanesulphonate. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 12 http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin + Công thức phân tử: Danofloxacin - C19H20O3FN3 + Trọng lƣợng phân tử: 357,39 g/mol. + Nhiệt độ sôi: Danofloxacin 263°C. + Danofloxacin là một Fluoroquinolone tổng hợp với phổ rộng hoạt tính kháng khuẩn. Nó đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh đƣờng hô hấp ở gà, trâu, bò và lợn. Danofloxacin không có ý định để sử dụng trong chăn nuôi bò sữa sản xuất sữa cho con ngƣời và không ở gà mái đẻ [15]. - Difloxacin: + Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-7-(4-methylpiperazin-1-yl)-4oxoquinoline-3-carboxylic acid. Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin + Công thức hóa học: C21H19F2N3O3. + Trọng lƣợng phân tử: 399 g/mol. + Difloxacin ức chế men gyrase DNA của vi khuẩn và các enzyme topoisomerase II, ức chế sự sao chép AND và phiên mã, tác dụng trên vi khuẩn Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 13 http://www.lrc.tnu.edu.vn gram âm và gram dƣơng. Difloxacin là một kháng sinh fluoroquinolone thƣờng đƣợc sử dụng trong y học và thú y [15]. - Enrofloxacin: Enrofloxacin là kháng sing thuộc nhóm Fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. + Tên khoa học: 1 - Cyclopropul - 7- (4 - ethylpiperazin-1-yl) - 6 fluoro - 1,4 - dihydro - 4 - oxo - 3 - quinolinecarboxylic acid. Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin + Công thức hóa học: C19H22FN3O3 + Trọng lƣợng phân tử: 359,4 g/mol + Nhiệt độ nóng chảy: 219 - 221oC + Tính chất: Là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nƣớc ở pH = 7, có hai giá trị pKa: Khoảng 5 và 8 - 9. + Enrofloxacin đƣợc đƣa vào gia súc, gia cầm dƣới dạng nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, hoặc do ngƣời chăn nuôi trộn vào thức ăn, hoặc vào môi trƣờng sống của các loài thủy sản [15]. - Ibafloxacin: + Tên khoa học: 6,7-dihydro-5,8-dimethyl-9-fluoro-1-oxo-1H, 5H-benzo (i,j) axit quinolizine-2-carboxylic. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin + Công thức hóa học: C15H14FNO3 + Trọng lƣợng phân tử: 275 g/mol + Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, hoạt động bằng cách ngăn chặn một enzyme DNA gyrase, enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy trong các tế bào của vi khuẩn, và không có một chức năng tƣơng tự trong tế bào động vật. Bằng cách ngăn chặn gyrase DNA và ngăn chặn tạo ra các protein phát triển [15]. - Marbofloxacin: + Tên khoa học: 9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)7-oxo-7H pyridol (3,2,1-ij)(4,2,1) benzoxadiazin-6 axit carboxylic. Hình 6. Cấu trúc phân tử Marbofloxacin + Công thức hóa học: C17H19FN4O4 + Trọng lƣợng phân tử: 362,356 g/mol. + Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, làm suy yếu các vi khuẩn gyrase DNA [15]. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 http://www.lrc.tnu.edu.vn - Orbifloxacin: + Tên khoa học: 1-Cyclopropyl-7-[(3s, 5r-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]-5,6,8trifluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid. Hình 7. Cấu trúc phân tử Orbifloxacin + Công thức hóa học: C19H20F3N3O3 + Trọng lƣợng phân tử: 395,37 g/mol. + Orbifloxacin là diệt khuẩn chống lại một loạt các vi khuẩn gram âm và gram dƣơng và có tác dụng hữu kháng khuẩn của nó thông qua sự can thiệp với các enzyme của vi khuẩn DNA gyrase đó là cần thiết cho việc duy trì và tổng hợp DNA của vi khuẩn [15]. - Sarafloxacin: +Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-4-oxo-7-piperazin-1ylquinoline3-carboxylic acid. Hình 8. Cấu trúc phân tử Sarafloxacin + Công thức hóa học: C20H17F2N3O3 + Trọng lƣợng phân tử: 385,36 g/mol. + Sarafloxacin là một kháng sinh Fluoroquinolone hoạt động bằng cách ức chế các vi khuẩn DNA-topoisomerase II. Nó đã đƣợc đề xuất để sử dụng trong Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 16 http://www.lrc.tnu.edu.vn nƣớc uống của gia cầm để điều trị vi khuẩn bệnh, và trong thức ăn cá để điều trị các bệnh nhƣ nhọt, vibriosis và redmouth ruột [15]. - Levofloxacin: + Tên khoa học: (S)-9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin1-yl)-7-oxo-7H-pyrido [1,2,3-de]-1,4-benzoxazine-6-carboxylic acid. Hình 9. Cấu trúc phân tử Levofloxacin + Công thức hóa học: C18H20FN3O4. + Trọng lƣợng phân tử: 361,368 g/mol. + Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế tổng hợp acid nucleic. Levofloxacin có tác dụng diệt khuẩn do gắn với topoisomerase II của vi khuẩn (AND - gyrase) và topoisomerase IV là những enzyme thiết yếu của vi khuẩn tham gia xúc tác trong quá trình sao chép, phiên mã và sửa AND của vi khuẩn nên làm mất hoạt tính enzyme. Do không có khả năng mở vòng xoắn để thực hiện việc sao chép mã di truyền nên vi khuẩn bị tiêu diệt. Levofloxacin là đồng phân L - isome của Ofloxacin, nó có tác dụng diệt khuẩn mạnh gấp 8 - 128 lần so với đồng phân D - isome và mạnh gấp 2 lần so với Ofloxacin racemic. Levofloxacin, cũng nhƣ các Fluoroquinolon khác là kháng sinh phổ rộng có tác dụng trên nhiều vi khuẩn kỵ khí tốt hơn các Fluoroquinolon khác, tuy nhiên tác dụng invitro trên Pseudomonas aeruginosa lại yếu hơn so với Ciprofloxacin. Sau khi dùng, levofloxacin đƣợc hấp thu nhanh và gần nhƣ hoàn toàn; nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng thƣờng đạt đƣợc sau 1 - 2 giờ; sinh khả dụng tuyệt đối xấp xỉ 99%. Các thông số dƣợc động học của levofloxacin sau khi dùng đƣờng tĩnh Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 17 http://www.lrc.tnu.edu.vn mạch và đƣờng uống với liều lƣợng tƣơng đƣơng và gần nhƣ nhau, do đó có thể sử dụng hai đƣờng này thay thế cho nhau. Khoảng 30 - 40% Levofloxacin gắn với các protein huyết tƣơng, trong vòng 3 ngày. Levofloxacin phân bố rộng rãi trong cơ thể, kháng sinh thâm nhập tốt vào niêm mạc phế quản, phổi và dịch lót biểu mô hô hấp, dịch bọng nƣớc ở da, tuyến tiền liệt và đạt nồng độ cao trong nƣớc tiểu, tuy nhiên thuốc khó thấm vào dịch não tủy. Tỷ lệ gắn protein huyết tƣơng là 30 - 40%. Levofloxacin rất ít chuyển hóa trong cơ thể và thải trừ qua nƣớc tiểu ở dạng còn nguyên hoạt tính, chỉ dƣới 5% liều điều trị đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu dƣới dạng chất chuyển hóa desmathyl và N - oxid, các chất chuyển hóa này có rất ít hoạt tính sinh học. Thời gian bán thải của Levofloxacin từ 6 - 8 giờ, kéo dài ở ngƣời bệnh suy thận [4,13,14]. 1.1.4. Ngƣỡng giới ha ̣n cho phép ở mô ̣t số thƣ̣c phẩ m Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ (FDA: Food and Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn lƣu kháng sinh nhóm Fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản nhập khẩu. Ở châu Âu, EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs - Maximum Residual Limit) đối với dƣ lƣợng thuốc trong thực phẩm cung cấp cho con ngƣời vào những năm 1990. Trong “Council directive 96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg. Ủy ban thực phẩm CODEX thành lập bởi FAO và WHO đã quy định MRL đối với Danofloxacin và Sarafloxacin dùng trong thú y ở các loại thịt, gan lợn, bò và gà tƣơng ứng trong khoảng là 50 - 400 µg/kg và 10 - 80 µg/kg. Trong Liên minh châu Âu, giới hạn dƣ lƣợng tối đa (MRL) của kháng sinh trong sữa bột nhƣ benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin là 4 mg/kg. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 18 http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [16] Giới hạn tồn dƣ Định lƣợng Hoạt tính Loài Cơ quan tối đa (MRL) chất tồn dƣ (µg/kg) Danofloxacin Danofloxacin Bò, cừu, dê, Thịt 200 lợn Mỡ 100 Gan 400 Thận 400 Sữa 30 Gia cầm Da và mỡ 100 Gan 400 Thận 400 Thịt 100 Các loài khác Mỡ 50 Gan 200 Thận 200 Difoxacin Difoxacin Bò, cừu, dê Thịt 400 Mỡ 100 Gan 1400 Thận 800 Lợn Thịt 400 Da và mỡ 100 Gan 800 Thận 800 Gia cầm Thịt 300 Da và mỡ 400 Gan 1900 Thận 600 Các loài khác Thịt 300 Da 100 Gan 800 Thận 600 Enrofloxacin Tổng của Bò, cừu, dê Thịt 100 Enrofloxacin Mỡ 100 và Gan 300 Ciprofloxacin Thận 200 Lợn, thỏ Thịt 100 Mỡ 100 Gan 200 Thận 300 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 19 http://www.lrc.tnu.edu.vn Gia cầm Các loài khác Flumequin Flumequin Bò, cừu, dê, lợn Gia cầm Cá thu khác Sarafloxacin Fluroquinolone Sarafloxacin Gà Levofloxacin Cá hồi Bò, cừu, dê Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 20 Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Sữa Thịt Mỡ Gan Thận Da và thịt Thịt Mỡ Gan Thận Da và mỡ Gan Da và Thịt Sữa http://www.lrc.tnu.edu.vn 100 100 200 300 100 100 200 200 200 300 500 1500 50 400 250 800 1000 200 200 250 500 1000 10 100 30 100