Tài liệu Xây dựng phương pháp định tính, định lượng nguyên liệu tạp chất a của terazosin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ----- NGUYỄN THANH XUÂN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG NGUYÊN LIỆU TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ----- NGUYỄN THANH XUÂN Mã sinh viên: 1301484 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG NGUYÊN LIỆU TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS. Th.S Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dƣợc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc khi trình bày nội dung đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những ngƣời trong thời gian qua đã luôn bên cạnh hỗ trợ, động viên để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới NCS. ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy - giảng viên Bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học cho đến khi hoàn thành khóa luận này. Những điều học đƣợc từ cô là những kinh nghiệm quý báu giúp tôi bƣớc tiếp trên những chặng đƣờng khó khăn phía trƣớc. Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, phòng Đào tạo cùng các thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dƣợc và các cán bộ Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng đã hết lòng tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè và các anh, chị, em trong nhóm nghiên cứu Kiểm nghiệm tại Bộ môn Hóa Dƣợc đã luôn giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi sẽ không thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này nếu không có sự giúp đỡ của tất cả mọi ngƣời. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... MỤC LỤC .......................................................................................................... DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................. DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................ DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2 1.1. Terazosin ..................................................................................................... 2 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin ..................................................... 2 1.1.2. Tác dụng và chỉ định của terazosin....................................................... 2 1.1.3. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng .................................. 3 1.2. Tạp chất A của terazosin ............................................................................. 4 1.2.1. Một số thông tin chung về tạp A của terazosin .................................... 4 1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp chất A............................................................. 5 1.2.3. Phƣơng pháp xác định IAT bằng TLC ................................................. 5 1.2.4. Phƣơng pháp xác định IAT bằng HPLC ............................................... 6 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài ... 9 1.3.1. Phƣơng pháp TLC ................................................................................. 9 1.3.2. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................ 10 1.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích nguyên liệu hóa dƣợc ....................... 11 1.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký .................................................... 11 1.4.2. Độ đặc hiệu ......................................................................................... 12 1.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định ...................................................... 12 1.4.4. Độ chính xác ....................................................................................... 12 1.4.5. Độ đúng ............................................................................................... 13 1.4.6. Độ ổn định của dung dịch phân tích ................................................... 13 1.5. Tình hình thiết lập tạp chuẩn A trong nƣớc và trên thế giới..................... 13 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13 1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .................................................... 14 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 15 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................ 15 2.1.1. Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................... 15 2.1.2. Thiết bị ................................................................................................ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 16 2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp định tính IAT bằng TLC .............................. 16 2.2.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng IAT bằng HPLC ........ 17 2.2.3. Ứng dụng hai phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT ............................................................................................ 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 17 2.3.1. Phƣơng pháp TLC ............................................................................... 17 2.3.2. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................ 17 2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ..................................................... 17 2.3.4. Một số phƣơng pháp thống kê sử dụng trong nghiên cứu đề tài ........ 18 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 20 3.1. Thực nghiệm và kết quả ............................................................................ 20 3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp định tính IAT bằng TLC .............................. 20 3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng IAT bằng HPLC ........ 23 3.2.3. Ứng dụng hai phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT ............................................................................................ 36 3.2. Bàn luận .................................................................................................... 38 3.2.1. Phƣơng pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC ........................... 38 3.2.2. Phƣơng pháp định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT bằng HPLC..... 39 3.2.3. Bàn luận chung ................................................................................... 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ PHỤ LỤC ........................................................................................................... DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ACDQ : 4-Amino-2-cloro-6,7dimethoxyquinazolin ACN : Acetonitril BP (British Pharmacopoeia) : Dƣợc điển Anh DOX : Doxazosin EP (European Pharmacopoeia) : Dƣợc điển Châu Âu HL : Hàm lƣợng HPLC (High performance liquid chromatography) : Sắc ký lỏng hiệu năng cao IAT (Impurity A of terazosin) : Tạp chất A của terazosin IR (Infrared) : Tia hồng ngoại KP (Korean Pharmacopoeia) : Dƣợc điển Hàn Quốc PA (Pure Analysis) : Tinh khiết phân tích MeOH : Methanol RSD (Relative standard deviation) : Độ lệch chuẩn tƣơng đối SKĐ : Sắc ký đồ TB : Trung bình TEZ : Terazosin TLC (Thin layer chromatography) : Sắc ký lớp mỏng TLTK : Tài liệu tham khảo USP (United State Pharmacopoeia) : Dƣợc điển Mỹ USPRS (United State Pharmacopoeia Reference : Chất đối chiếu của Hội Standard) đồng Dƣợc điển Mỹ UV (Ultraviolet) : Tia tử ngoại VIS (Visible) : Ánh sáng nhìn thấy WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng 3 Bảng 1.2. Phƣơng pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin 6 Bảng 2.1. Các hệ dung môi khảo sát phƣơng pháp định tính IAT bằng TLC 17 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ pha động của phƣơng pháp TLC 21 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 26 Bảng 3.3. Các thông số của dung dịch phân giải 30 Bảng 3.4. Cách pha dung dịch thẩm định độ tuyến tính 31 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phƣơng pháp HPLC 31 Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC 32 Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC trên thiết bị khác Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian của phƣơng pháp HPLC 33 33 Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp HPLC 34 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn 35 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch thử 35 Bảng 3.12. Hàm lƣợng IAT trong nguyên liệu tổng hợp đƣợc 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin 2 Hình 1.2. Một số chế phẩm của terazosin trên thị trƣờng 4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38 4 Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin 5 Hình 2.1. Tạp chuẩn A của terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ 15 Hình 2.2. Chất chuẩn terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ 15 Hình 2.3. Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE 26 d = 0,001 mg 16 Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát pha động của phƣơng pháp TLC 20 Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phƣơng pháp định tính bằng TLC 23 Hình 3.3. Phổ UV của dung dịch IAT trong pha động 24 Hình 3.4. Sắc kí đồ thẩm định độ đặc hiệu của phƣơng pháp HPLC 28 Hình 3.5. Kết quả xác định độ tinh khiết pic tạp A thử 29 Hình 3.6. Kết quả xác định độ tinh khiết pic tạp A chuẩn 29 Hình 3.7. Kết quả chồng phổ UV pic tạp A chuẩn và pic tạp A thử 30 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic của IAT Hình 3.9. Sắc ký đồ định tính nguyên liệu IAT bằng TLC Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử định tính nguyên liệu IAT bằng HPLC 31 36 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo “Báo cáo chung tổng quan ngành y tế năm 2016”, gánh nặng bệnh tật ở ngƣời cao tuổi chủ yếu gây ra bởi các bệnh không lây nhiễm, chiếm đến 86-88% số trƣờng hợp tử vong [1]. Trong các bệnh không lây nhiễm, có hai căn bệnh rất phổ biến ở nam giới đó là tăng huyết áp và phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Terazosin là một thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic đƣợc chỉ định trong điều trị nội khoa hai căn bệnh này [24], [28], [39]. Khi kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin, một số Dƣợc điển yêu cầu thử giới hạn tạp chất, trong đó có tạp chất A (1-(4-amino6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid) [30], [40], [41], [42]. Phƣơng pháp thử giới hạn tạp chất đòi hỏi cần có tạp chuẩn A, tuy nhiên tạp chuẩn này không có sẵn mà phải mua ở nƣớc ngoài với giá thành cao, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm [16]. Từ nhu cầu thực tế, nhóm nghiên cứu đã tổng hợp và tinh chế thành công nguyên liệu tạp chất A tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [20]. Tuy nhiên, để có thể sử dụng nguyên liệu này thiết lập tạp chuẩn, cần có phƣơng pháp định tính và định lƣợng chính xác nguyên liệu IAT. Vì vậy, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng nguyên liệu tạp chất A của terazosin” đƣợc thực hiện với ba mục tiêu sau: 1- Xây dựng phƣơng pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC 2- Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT bằng HPLC 3- Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng IAT trong nguyên liệu tổng hợp đƣợc. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Terazosin 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin - Công thức cấu tạo: hình 1.1 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin - Công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl - Phân tử lƣợng: 423,89. - Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2furoyl)piperazin monohydroclorid. - Ngoài dạng khan, terazosin hydroclorid còn có dạng ngậm hai phân tử nƣớc với công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl.2H2O, phân tử lƣợng: 459,92 [42]. - Tính chất: tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, hơi tan trong nƣớc, khó tan trong methanol, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong aceton và nhexan, có khả năng hấp thụ IR và UV [29], [30], [40]. 1.1.2. Tác dụng và chỉ định của terazosin - Terazosin có tác dụng ức chế chọn lọc thụ thể α1-adrenergic nên dẫn đến giãn mạch, giảm sức cản ngoại biên, hạ huyết áp, do đó đƣợc chỉ định sử dụng đƣờng uống trong các trƣờng hợp: điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở ngƣời lớn, phối hợp với thuốc hạ huyết áp khác trong trƣờng hợp tăng huyết áp kháng trị [3], [26], [28], [39]. - Terazosin có tác dụng giãn cơ trơn, làm tăng lƣu lƣợng nƣớc tiểu và cải thiện triệu chứng tắc nghẽn, do đó đƣợc chỉ định sử dụng đƣờng uống để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tiền liệt tuyến [28], [39], [45]. Các nghiên cứu đã cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả lâm sàng giữa terazosin với 2 các thuốc cùng nhóm nhƣ alfuzosin, doxazosin, tamsulosin. Đây là một trong các lựa chọn đầu tay khi các triệu chứng tắc nghẽn chiếm ƣu thế [36], [39]. - Terazosin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt bằng cách làm gia tăng sự chết theo chu trình của các tế bào này mà không ảnh hƣởng tới chu trình tế bào bình thƣờng [35]. Bên cạnh đó, thuốc còn có thể có tác dụng tích cực đến lƣợng cholesterol trong máu của ngƣời bệnh [32]. 1.1.3. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trường Ở các nƣớc ASEAN và trên thế giới, terazosin đƣợc biết đến với nhiều biệt dƣợc khác nhau, phổ biến là viên nén với hàm lƣợng 1, 2, 5 và 10 mg (bảng 3.1 và hình 1.2) [46]. Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng STT Tên biệt dược Hàm lượng (mg) Hãng sản xuất 1 Apo-terazosin 2, 5 Apotex 2 Heitrin 1, 2, 5, 10 Amdipharm Nước lưu hành Canada, New Zealand, Singapore Ireland Mỹ, Australia, 3 Hytrin 1, 2, 5, 10 Abbott Trung Quốc, Philipin, Indonesia, Nam Phi… 4 5 6 Terazosin 1A - Pharma Terazosin Accord Terazosin HCl dihydrate 2, 5 2, 5 1A - Pharma Accord Healthcare 2 Sandoz 3 Đức Cộng hòa Séc Mỹ Hình 1.2. Một số chế phẩm của terazosin trên thị trƣờng 1.2. Tạp chất A của terazosin 1.2.1. Một số thông tin chung về tạp A của terazosin - Công thức cấu tạo: hình 1.3 - Công thức phân tử: C14H19N5O2.2HCl. - Phân tử lƣợng: 362,25. Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38 - Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid. - Tính chất: màu trắng hoặc trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy > 208oC, khó tan trong methanol, dimethyl sulfoxid [44]. - Độc tính: kích thích da, mắt và hệ hô hấp mức độ trung bình, có hại nếu nuốt phải, hít phải hoặc hấp thu qua da [44]. - Tạp chất A của terazosin theo USP tƣơng ứng với tạp chất I của terazosin theo KP X, tạp chất C của terazosin theo BP 2016 và EP 8.0. Tạp chất A của 4 terazosin cũng đồng thời là tạp chất F của doxazosin theo BP 2016 và EP 8.0 [30], [40], [41], [42]. 1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp chất A Khi dạng base hoặc muối hydroclorid của terazosin tiếp xúc với nƣớc có tính acid ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, liên kết amid bị phân cắt, tạo ra tạp chất A (hình 1.4). Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin Nếu muối hydrochlorid đƣợc tổng hợp dựa trên cơ sở phản ứng giữa terazosin base và acid hydrochloric, sản phẩm cuối cùng có thể chứa một lƣợng nhỏ acid, gây ra sự thủy phân theo thời gian [27], [29], [34]. 1.2.3. Phương pháp xác định IAT bằng TLC Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng với các điều kiện ở bảng 1.2. 5 Bảng 1.2. Phƣơng pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin Đối tượng Pha động mẫu Nguyên Cloroform - toluen - liệu TEZ methanol (9 : 1 : 6) Pha Nồng Phát hiện vết tĩnh độ IAT IAT Silica gel 60 F254 Chƣa rõ n-butanol - acid Silica acetic băng - nƣớc gel 60 (6 : 3 : 5) F254 Methanol - ethyl Silica Nguyên acetat - dung dịch gel 60 2,5 liệu IAT amoniac 25% F254 mg/ml Nguyên liệu IAT Nguyên liệu IAT Nguyên liệu IAT Methanol - aceton : Silica dung dịch amoniac gel 60 25% (7 : 2 : 0,5) F254 n-propanol - n-hexan Silica - dung dịch amoniac gel 60 25% (24 : 8 : 1) F254 Ethyl acetat Nguyên methanol - liệu DOX triethylamin (4 : 0,4 : 0,3) Silica gel 60 F254 Soi đèn UV bƣớc sóng Phun thuốc mg/ml thử Ninhydrin 2,5 mg/ml 2,5 mg/ml [29] ngắn 2,5 (8 : 2 : 0,5) TLTK [14] Soi đèn UV 254 nm và [14] 312 nm Soi đèn UV 254 nm và [14] 312 nm Soi đèn UV 254 nm và [14] 312 nm 0,05 Soi đèn UV mg/ml 345 nm [38] 1.2.4. Phương pháp xác định IAT bằng HPLC Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện nhƣ sau: 1.2.4.1. Đối tượng mẫu là nguyên liệu TEZ Phƣơng pháp 1 - Điều kiện sắc ký: 6 + Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril (1685 : 315) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 254 nm + Nhiệt độ cột: 30°C + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động. Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn A, B, C của terazosin, trong đó nồng độ IAT chuẩn là 2 µg/ml. Dung môi dùng để pha IAT gồm có: Bƣớc 1: đệm citrat pH 3,2 Bƣớc 2: hỗn hợp nƣớc, acetonitril và methanol (60 : 30 : 10) Bƣớc 3: pha động. - Lƣợng IAT trong nguyên liệu terazosin đƣợc tính dựa trên nồng độ của IAT chuẩn và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. - Giới hạn: Tạp chất A không quá 0,3% [41], [42]. Phƣơng pháp 2 - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril - triethylamin (1650 : 350 : 2) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 245 nm + Nhiệt độ cột: 30°C + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động. Dung dịch chuẩn (a) đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch thử 1000 lần với pha động. 7 Dung dịch chuẩn (b) là dung dịch chứa “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống” (trong đó có chứa IAT và một số tạp chất khác của terazosin). Dung môi dùng để pha dung dịch chuẩn (b) là pha động. - Sử dụng sắc ký đồ kèm theo “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống” và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b) để phát hiện pic tƣơng ứng với IAT. Sau đó xác định giới hạn IAT bằng cách so sánh diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử với pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a). - Giới hạn: Diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử không gấp quá 5 lần diện tích pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a) (0,5%) [30], [40]. Phƣơng pháp 3 - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) + Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm các thành phần nƣớc, acetonitril, methanol và dung dịch amoniac 0,1% tt/tt + Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút + Detector: PDA 220 nm và QDa mass + Nhiệt độ cột: 20oC và 40oC + Thể tích tiêm mẫu: 0,2 µl. - Dung dịch tiêm sắc ký: là hỗn hợp gồm TEZ và các tạp chất từ A đến O theo EP. Trong đó nồng độ IAT là 7,5 µg/ml. Dung môi pha mẫu là methanol [37]. 1.2.4.2. Đối tượng mẫu là nguyên liệu DOX - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (250 x 4 mm, 5 µm). + Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm dung dịch acid phosphoric (5g/100ml), acetonitril và nƣớc + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút + Detector: 210 nm + Nhiệt độ cột: 35oC + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. 8 - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch DOX với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động. Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn DOX, tạp chuẩn A, B, C, D, E, F của doxazosin, tạp chuẩn A, C của terazosin trong đó nồng độ IAT chuẩn là 1,5 µg/ml. Dung môi dùng để pha dung dịch chuẩn là hỗn hợp dung môi C và D tỷ lệ 9 : 1 trong đó C là nƣớc, D là hỗn hợp gồm 100 ml acetonitril và 2 g acid phosphoric (84 - 86%). - Hàm lƣợng (%) IAT trong nguyên liệu DOX đƣợc tính dựa vào nồng độ của IAT trong dung dịch chuẩn, nồng độ DOX trong dung dịch thử và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn. - Giới hạn: Tạp chất A của terazosin không quá 0,3%. 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.3.1. Phương pháp TLC 1.3.1.1. Nguyên tắc Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha động với những tốc độ khác nhau. Kết quả là thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng [2]. 1.3.1.2. Đại lượng đặc trưng Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, đƣợc tính theo công thức sau: a b Rf Trong đó: a: khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký (cm) b: khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi, đo trên cùng đƣờng đi của vết (cm) Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 [2], [4], [23]. 1.4.1.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm 9 Trong kiểm nghiệm, TLC chủ yếu đƣợc dùng để định tính bằng cách so sánh giá trị Rf (vị trí) và màu sắc của vết chất thử với Rf và màu sắc của vết chất chuẩn đƣợc triển khai trên cùng một bản mỏng trong cùng một điều kiện. Ngoài ra TLC còn dùng để thử tinh khiết, bán định lƣợng và định lƣợng [4], [23]. 1.3.2. Phương pháp HPLC 1.3.2.1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phƣơng pháp phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [5]. Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động [2], [23]. 1.3.2.2. Các đại lượng đặc trưng - Thời gian lƣu tR: là khoảng cách trên đƣờng nền từ điểm tiêm mẫu đến đƣờng thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất [2]. Thời gian lƣu là đại lƣợng dùng để định tính các chất [23]. - Diện tích pic S: là đại lƣợng dùng để định lƣợng các chất, có độ chính xác cao hơn so với chiều cao pic [31]. - Số đĩa lý thuyết N: là đại lƣợng dùng để biểu thị khả năng tách của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. N = 5,54 ( Trong đó: tR W1/2 2 ) hoặc N = 16 ( tR 2 W ) W: Chiều rộng đo ở đáy pic W1/2: Chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic [2], [5], [23]. - Độ phân giải Rs: là đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách nhau của 2 pic liền kề. Rs = Trong đó: 2 WA WB hoặc 1,18( - ) W1/2A W1/2B tRA, tRB: Thời gian lƣu của 2 pic liền kề nhau (A và B). WA, WB: Độ rộng đo ở đáy các pic W1/2A, W1/2B: Độ rộng đo ở nửa chiều cao pic [2], [23]. Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic tách khỏi nhau rõ ràng. Phần lớn các phép phân tích HPLC mong muốn đạt đƣợc giá trị Rs > 2,0 [2], [31]. 10 - Hệ số đối xứng As (hay hệ số kéo đuôi T): là thông số thể hiện sự đối xứng của pic Trong đó: As = W0,05 2d W0,05: Chiều rộng pic ở 1/20 chiều cao pic d: Khoảng cách từ đƣờng thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trƣớc của pic ở 1/20 chiều cao pic. Khi As = 1 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tƣởng). Giá trị As càng tăng thì sự kéo đuôi của pic càng rõ [2], [23]. 1.3.2.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm - Định tính: Dựa trên sự giống nhau về thời gian lƣu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử. - Định lƣợng: Nguyên tắc của tất cả các phép định lƣợng bằng HPLC là nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó [5]. Một số phƣơng pháp thƣờng dùng trong định lƣợng nhƣ phƣơng pháp chuẩn nội, phƣơng pháp chuẩn ngoại, phƣơng pháp thêm chuẩn, phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích… - Thử tạp chất [4], [23]. 1.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích nguyên liệu hóa dƣợc Thẩm định phƣơng pháp phân tích là quá trình để đảm bảo phƣơng pháp phân tích đạt các yêu cầu cho mục đích đề ra. Khi xây dựng phƣơng pháp phân tích mới, với phƣơng pháp định tính, cần thẩm định tiêu chí độ đặc hiệu. Với phƣơng pháp định lƣợng, các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác định, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng và độ ổn định [25], [33], [43]. 1.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký nhằm để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp [2]. Cách xác định: Tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn dùng trong định lƣợng hoặc dung dịch chuẩn khác. Sau đó đánh giá trên các đại lƣợng đặc 11