Tài liệu Xây dựng phương pháp biến nạp cho bacillus subtilis 1012 và bacillus subtilis wb800n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ MỸ TIÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TP. Hồ Chí Minh – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ MỸ TIÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N Chuyên ngành: Vi sinh Mã số chuyên ngành: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG TP. Hồ Chí Minh – Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và các thầy cô thỉnh giảng đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt 2 năm học. Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành đến GS. TS Trần Linh Thước. Thầy luôn là tấm gương sáng cho em trên con đường học tập và nghiên cứu. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phan Thị Phượng Trang và thầy Nguyễn Đức Hoàng. Thầy cô đã tận tâm hướng dẫn, định hướng và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu vô cùng quý báu, đồng thời luôn hỗ trợ em hết mình trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như tạo mọi điều kiện cho em có thể phát huy tốt năng lực của mình. Cảm ơn thầy cô vì tất cả những thành quả em đạt được ngày hôm nay. Em xin cảm ơn các anh chị, các em và các bạn đang học tập và làm việc tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học đã luôn hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình làm thí nghiệm, đồng thời chia sẻ những kinh nghiệm nghiên cứu cũng như mọi vui buồn trong công việc. Đặc biệt là cảm ơn anh Trí Nam, chị Ngọc Phương, anh Tuấn Anh, anh Hoài Nam, anh Lương Thắng và các bạn Tinh Tươm, Kiều Thanh, Châu Duyên, các em Huy, Vương, Toàn, Phương, Trí, Lan, Lệ. Mọi người đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua. Cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu. Và trên hết, con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến ba mẹ và gia đình, những người đã luôn ở bên cạnh con, luôn yêu thương và là chỗ dựa vững chắc nhất cho con khi bước đi trên con đường mà con đã chọn. TP. Hồ Chí Minh tháng 4 năm 2015 Phạm Thị Mỹ Tiên Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC .........................................................................................................................i DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................................vii DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................xi LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Bacillus subtilis ........................................................................... 3 1.1.1. 1.1.2. Đặc điểm vách tế bào ................................................................................... 4 1.1.3. Dinh dưỡng và sinh trưởng .......................................................................... 6 1.1.4. Ưu điểm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ................................ 6 1.1.5. 1.2. Đặc điểm chung ........................................................................................... 3 Ứng dụng của B. subtilis trong sản xuất protein tái tổ hợp ......................... 7 Một số phương pháp biến nạp vật chất di truyền vào B. subtilis ....................... 8 1.2.1. Phương pháp biến nạp tự nhiên ................................................................... 8 1.2.1.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 8 1.2.1.2. Ưu và nhược điểm ................................................................................. 8 1.2.2. Phương pháp biến nạp qua protoplast .......................................................... 9 1.2.2.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 9 Trang i Mục lục 1.2.2.2. 1.2.3. Ưu và nhược điểm ............................................................................... 10 Phương pháp điện biến nạp........................................................................ 10 1.2.3.1. 1.2.3.2. Tác động của dòng điện đến màng tế bào ........................................... 11 1.2.3.3. 1.3. Nguyên tắc .......................................................................................... 10 Ưu và nhược điểm của phương pháp điện biến nạp ........................... 12 Các yếu tố ảnh hưởng tần suất biến nạp của phương pháp điện biến nạp........ 12 1.3.1. Đặc điểm của tế bào khả nạp ..................................................................... 13 1.3.2. Môi trường tăng trưởng và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên tính khả nạp ............................................................................................................. 14 1.3.2.1. Áp suất thẩm thấu và các chất thẩm thấu trong môi trường tăng trưởng ........................................................................................................... 15 1.3.2.2. Các chất tác động lên vách tế bào trong quá trình nuôi cấy ............... 16 1.3.2.3. Nhiệt độ ............................................................................................... 17 1.3.3. Ảnh hưởng của cấu trúc và kích thước DNA lên tính khả nạp.................. 17 1.3.4. Thông số điện biến nạp .............................................................................. 18 1.4. Ảnh hưởng của điện trường đến tế bào vi khuẩn ............................................. 18 1.5. Tình hình nghiên cứu phương pháp điện biến nạp cho Bacillus ...................... 19 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 20 2.2. Vật liệu ............................................................................................................. 20 Trang ii Mục lục 2.2.1. Nguồn nguyên liệu sinh học ...................................................................... 20 2.2.1.1. Chủng vi khuẩn ................................................................................... 20 2.2.1.2. Plasmid ................................................................................................ 20 2.2.2. Môi trường - hóa chất - thiết bị - dụng cụ sử dụng ................................... 21 2.2.2.1. 2.2.2.2. Hóa chất và thuốc thử ......................................................................... 22 2.2.2.3. 2.3. Môi trường .......................................................................................... 21 Dụng cụ - thiết bị ................................................................................ 23 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 24 2.3.1. Tách chiết plasmid ..................................................................................... 24 2.3.1.1. Biến nạp plasmid vào E. coli OmmiMAX .......................................... 25 2.3.1.2. Tách plasmid bằng midi kit ................................................................. 25 2.3.1.3. Biến nạp plasmid vào B. subtilis theo phương pháp thông thường .... 25 2.3.2. Xây dựng quy trình điện biến nạp ............................................................. 26 2.3.2.1. Dựng đường cong tăng trưởng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ............................................................................................................. 27 2.3.2.2. Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp với xử lý tế bào bằng lysozyme ................................................ 28 2.3.2.3. Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào với nhiệt độ lạnh 4oC ............................................ 31 2.3.3. Khảo sát hiệu suất biến nạp với các plasmid khác nhau ............................ 32 Trang iii Mục lục 2.3.4. Kiểm tra plasmid sau khi được biến nạp vào tế bào B. subtilis ................. 33 2.3.5. Khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào B. subtilis ........ 35 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. Xây dựng quy trình điện biến nạp. ................................................................... 36 3.1.1. Đường cong tăng trưởng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. .... 36 3.1.2. Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào bằng lysozyme. ................................................................ 37 3.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N................................ 37 3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ lysozyme lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ............................................................................... 41 3.1.2.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý với lysozyme lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ........................................................ 43 3.1.2.4. 3.1.3. Ảnh hưởng của hiệu điện thế đến tần suất biến nạp ........................... 46 Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp ủ lạnh tế bào ở 4oC ............................................................................... 50 3.1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N................................ 50 3.1.3.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ lạnh lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ............................................................................... 52 Trang iv Mục lục 3.1.3.3. Ảnh hưởng của hiệu điện thế lên tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ........................................................................................ 55 3.2. Khảo sát tần suất biến nạp với các plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ .......... 57 3.3. Kiểm tra plasmid sau khi được điện biến nạp vào tế bào B. subtilis ................ 59 3.4. Khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N........................................................................................................ 61 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận............................................................................................................. 64 4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 655 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang v Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR tương ứng với plasmid ............ 34 Bảng 3.1: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N nuôi trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ở 7 thời điểm tăng trưởng được xử lý lysozyme ...................................................................................................... 38 Bảng 3.2: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý với các nồng độ lysozyme: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml .......................... 42 Bảng 3.3: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý nồng độ lysozyme 1 µg/ml trong thời gian: 5; 10; 15; 20 phút ... ....................................................................................................................................... 44 Bảng 3.4: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý lysozyme biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV ....................................................................................................................................... 47 Bảng 3.5: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N nuôi trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ở 7 thời điểm tăng trưởng được xử lý ủ lạnh 4oC. ................................................................................................................. 51 Bảng 3.6: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N bằng phương pháp ủ lạnh 4oC trong 12; 24; 36; 48 giờ .................. 53 Bảng 3.7: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV bằng phương pháp ủ lạnh ....................................................................................................................................... 55 Bảng 3.8: Kết quả điện biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N với plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ theo hai quy trình xử lý lysozyme và ủ lạnh...... 58 Trang vi Danh mục biểu đồ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đường cong tăng trưởng của hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) ................................. 36 Biểu đồ 3.2: Bảy thời điểm tăng trưởng từ pha log đến pha cân bằng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) .. 37 Biểu đồ 3.3: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo 7 thời điểm tăng trưởng khác nhau dựa trên giá trị OD600nm trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol và xử lý lysozyme .............................................................. 40 Biểu đồ 3.4: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được xử lý lysozyme nồng độ từ: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml trong 10 phút .. 43 Biểu đồ 3.5: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được xử lý lysozyme nồng độ từ 1 µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút .... 46 Biểu đồ 3.6: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý lysozyme điện biến nạp với hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV .. ....................................................................................................................................... 48 Biểu đồ 3.7: Bảy thời điểm tăng trường từ pha log đến pha cân bằng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M). . 50 Biểu đồ 3.8: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo 7 thời điểm tăng trưởng khác nhau dựa trên giá trị OD600nm trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol và ủ lạnh 4oC 24 giờ ......................................................... 51 Biểu đồ 3.9: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 giờ ... 54 Trang vii Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.10: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol được ủ lạnh 12; 24; 36; 48 giờ ....... 56 Biểu đồ 3.11: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N điện biến nạp theo hai phương pháp xử lý tế bào với lysozyme và ủ lạnh 4oC ................................................................................................. 58 Trang viii Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của Bacillus spp. ............................................................ 3 Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương, Gram âm ............................... 5 Hình 1.3: Mô hình đơn phân murein .............................................................................. 5 Hình 1.3: Cơ chế biến nạp qua protoplast ..................................................................... 9 Hình 1.4: DNA đi vào trong tế bào trong quá trình điện biến nạp .............................. 10 Hình 2.1: Sơ đồ plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ ................................................ 21 Hình 2.2: Thang DNA (ZipRulerTM Express DNA Ladder Set – Fermentas) ............ 23 Hình 2.3: Vị trí bắt cặp của mồi trên plasmid pHT1068 ............................................. 34 Hình 2.4: Vị trí bắt cặp của mồi trên plasmid pHT43 – amyQ .................................... 34 Hình 2.5: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR...................................................... 35 Hình 3.1: Kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N thu nhận ở 7 giai đoạn tăng trưởng khác nhau trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol và được xử lý lysozyme. ................................................................ 39 Hình 3.2: Kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được xử lý với lysozyme nồng độ: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml trong 10 phút ............. 41 Hình 3.3: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được xử lý với lysozyme nồng độ 1 µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút .............. 44 Hình 3.4: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV) .......................... 47 Hình 3.6: Kết quả PCR khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ ................................................................ 75 Trang ix Danh mục hình Hình 3.5: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được ủ lạnh 4oC 12, 24, 36, 48 giờ ................................................................ 53 Hình 3.6: Kết quả PCR khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ, pKTH10 ........................................................ 60 Hình 3.7: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được điện biến nạp ........................... 61 Hình 3.8: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được biến nạp theo phương pháp thông thường ........................................................................................................................... 61 Hình 3.9: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được điện biến nạp ........ 62 Hình 3.10: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được biến nạp theo phương pháp thông thường ........................................................................................................ 63 Trang x Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin bp base pair Cm Chloramphenicol DNA Deoxyribose Nucleic Acide dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate EB Electroporation Buffer EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FDA Food and Drug Administration GRAS Generally Recognized As Safe IPTG Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside kbp kilo base pair LB Luria-Bertani M Marker PCR Polymerase Chain Reaction PG Peptidoglycan SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris base acetic acid EDTA Trang xi Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương có lợi, chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, B. subtilis được sử dụng như một chủng chủ phổ biến trong nghiên cứu biến đổi di truyền và ứng dụng công nghệ sinh học trong các viện nghiên cứu, phòng thí nghiệm vì những ưu điểm như: (i) vi sinh vật an toàn được xếp vào nhóm GRAS; (ii) mật độ tăng trưởng nhanh, nuôi cấy dễ dàng; (iii) thông tin di truyền được biết rõ. Chính vì những ưu điểm trên, B. subtilis đã trở thành tế bào chủ hấp dẫn cho biểu hiện protein tái tổ hợp. Một chiến lược cần thiết và quan trọng cho các thao tác di truyền cũng như sử dụng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp trên chủng B. subtilis là biến nạp DNA vào tế bào. Có nhiều phương pháp chuyển DNA vào tế bào B. subtilis như sử dụng deoxiribonucleate, biến nạp qua protolast, xử lý với alkali hay biến nạp tự nhiên. Hạn chế của các phương pháp này là tần suất biến nạp thấp và đòi hỏi một lượng DNA lớn cho một lần biến nạp, do đó muốn dòng hóa tạo plasmid tái tổ hợp trên B. subtilis phải biến nạp qua trung gian E. coli để thu được một lượng lớn DNA. Phương pháp điện biến nạp là kỹ thuật đơn giản cho tần suất biến nạp cao và được sử dụng phổ biến cho nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Mặc dù điện biến nạp được sử dụng rộng rãi cho nhiều chủng vi khuẩn khác nhau nhưng việc sử dụng phương pháp biến nạp này cho B. subtilis vẫn còn nhiều hạn chế và đặc biệt là vẫn chưa có nghiên cứu xây dựng quy trình điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Đây là hai chủng được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm cho các nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp. Nguyên nhân chính cho vấn đề này là quy trình điện biến nạp vào các chủng B. subtilis không ổn định giữa các chủng khác nhau, phụ thuộc vào đặc điểm tăng trưởng của từng chủng. Do đó, luận văn tập trung vào “Xây dựng các phương pháp điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N” nhằm tìm ra điều kiện biến nạp cho tần suất cao ổn định, Trang 1 Lời mở đầu đơn giản cho hai chủng B. subtilis điển hình. Luận văn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tần suất điện biến nạp: sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp với xử lý tế bào bằng lysozyme hoặc sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào bằng ủ ở 4oC. - Kiểm tra xác nhận các plasmid tái tổ hợp đã được điện biến nạp vào tế bào B. subtilis bằng phương pháp PCR khuẩn lạc. - Khảo sát tần suất biến nạp với các plasmid tái tổ hợp pHT1068, pHT43 – amyQ cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp nội bào và ngoại bào. - Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp từ những plasmid đã được biến nạp. Trang 2 Phần 1 TỔNG QUAN Tổng quan 1.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 1.1.1. Đặc điểm chung Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau [4]: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus subtilis B. subtilis thuộc chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài chưa được phân loại rõ ràng), thuộc họ Bacillaecea. Họ này chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfotomaculum đặc trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử. Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của Bacillus spp. [64]. Trang 3 Tổng quan Đặc điểm của chi Bacilllus (Hình 1.1) được mô tả như sau: tế bào hình que, kích thước 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 μm, các tế bào thường xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là vi khuẩn Gram dương, di động nhờ roi. Một tế bào chỉ có duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, chịu được điều kiện bất lợi như nhiệt độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, nồng độ muối rộng, tồn tại được trong điều kiện bất lợi một thời gian dài. Vì vậy đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, nước, trong hệ tiêu hóa của một số loại thủy hải sản. Các chủng B. subtilis phân lập từ tự nhiên sẽ khó sử dụng làm tế bào khả nạp hơn các chủng đã được đột biến. Những chủng đột biến này được cải thiện khả năng tiếp nhận DNA, tăng trưởng và mất đi một số đặc tính hoang dại. Hầu hết các chủng B. subtilis sử dụng cho nghiên cứu và trong công nghiệp đều có nguồn gốc từ chủng B. subtilis 168 là chủng dị dưỡng phụ thuộc tryptophan [62]. Hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N cũng có nguồn gốc từ B. subtilis 168 và là chủng vi khuẩn được sử dụng phổ biến hiện nay do có nhiều ưu điểm nổi bật. 1.1.2. Đặc điểm vách tế bào Vách tế bào còn gọi là thành tế bào, chiếm 10 – 40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày vách tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm, Gram dương là 14 – 18 nm. Vách tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi. Nồng độ đường, muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10 – 20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có vách tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ [63]. Khi thực hiện co nguyên sinh rồi quan Trang 4 Tổng quan sát dưới kính hiển vi, thấy rõ lớp vách tế bào của vi khuẩn Gram dương và Gram âm được minh họa như Hình 1.2. A B Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương (A), Gram âm (B) [65]. B. subtilis là vi khuẩn Gram dương vách tế bào có thành phần cấu tạo cơ bản là peptidoglycan (PG) hoặc còn gọi là đơn phân murein chiếm 95% trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polymer xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm thành phần: N – acetylglucozamin (G), N – acetylmuramic acid (M), alanine, D – glutamic, D – aminoacid. Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polymer của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào. Mối liên kết giữa các chất trong đơn phân murein như Hình 1.3: Hình 1.3: Mô hình đơn phân murein [63]. Trang 5