Tài liệu Xác định và phân tích trình tự hệ gene ty thể hoàn chỉnh của giống lợn ỉ tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Đức Hiếu XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ HỆ GENE TY THỂ HOÀN CHỈNH CỦA GIỐNG LỢN Ỉ TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội –2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Đức Hiếu XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ HỆ GENE TY THỂ HOÀN CHỈNH CỦA GIỐNG LỢN Ỉ TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Võ Thị Bích Thủy TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh Hà Nội –2016 Lời cảm ơn Trước tiên, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Võ Thị Bích Thủy và TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh những người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn thạc sĩ này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, người đã luôn tạo điều kiện nghiên cứu tốt nhất cho tôi, cũng như luôn quan tâm, giúp đỡ và trao đổi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Lai Thành, người đã giúp đỡ, định hướng ban đầu cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, và bạn bè tôi vì đã luôn bên tôi trong công việc cũng như ngoài cuộc sống. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Đức Hiếu . MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................... v MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2 1.1. Giới thiệu về giống lợn Ỉ..................................................................................... 2 1.1.1. Nguồn gốc giống vật nuôi ............................................................................... 2 1.1.2. Giống lợn nhà (Sus scrofa) ............................................................................. 2 1.1.3. Giống lợn Ỉ ...................................................................................................... 3 1.2. Tầm quan trọng của các nghiên cứu về lợn tại Việt Nam ..................................... 6 1.3. Marker trong nghiên cứu đa dạng di truyền .......................................................... 7 1.3.1. Cấu trúc hệ gen ty thể...................................................................................... 9 1.3.2. Ty thể trong nghiên cứu đa dạng di truyền ................................................... 10 1.4. Phƣơng pháp giải trình tự Sanger ........................................................................ 12 1.5. Phƣơng pháp phân tích sự chủng loại phát sinh .................................................. 17 1.5.1. Cây chủng loại phát sinh ............................................................................... 17 1.5.2. Phương pháp Bayesian.................................................................................. 19 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 21 2.1. Đối tƣợng ............................................................................................................. 21 2.2. Vật liệu và trang thiết bị ...................................................................................... 21 2.3. Phƣơng pháp ........................................................................................................ 21 2.3.1. Thu mẫu ......................................................................................................... 21 2.3.2. Tách chiết mẫu DNA tổng số (với nguồn mẫu là máu). ................................ 21 2.3.3. Thiết kế mồi ................................................................................................... 22 2.3.4. Khuếch đại trình tự hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR ................................... 23 2.3.5. Giải trình tự trên máy ABI 3500 ................................................................... 24 2.3.6. Xử lí kết quả giải trình tự .............................................................................. 25 2.3.7. Phân tích trình tự .......................................................................................... 26 2.3.8. Phân tích sự chủng loại phát sinh ................................................................. 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 27 3.1. Thu thập và giải trình tự hệ gen ty thể lợn Ỉ ........................................................ 27 3.1.1. Thu mẫu ......................................................................................................... 27 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số................................................................................. 27 3.1.3. Khuếch đại hệ gen ty thể ............................................................................... 28 3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR .............................................................................. 31 3.1.5. Kiểm tra kết quả giải trình tự ........................................................................ 32 3.2. Phân tích hệ gen ty thể lợn Ỉ ................................................................................ 32 3.2.1. Dự đoán gen ty thể ........................................................................................ 33 3.2.2. Kết quả sắp xếp trình tự ................................................................................ 42 3.2.3. Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự hoàn chỉnh ................................. 46 3.2.4. Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự D loop ........................................ 47 3.2.5. Sự chủng loại phát sinh ở Sus scrofa ............................................................ 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 54 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 65 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Khối lượng lợn Ỉ và Ỉ pha qua các mốc tuổi (kg) ............................................ 4 Bảng 1.2. Khối lượng lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ ......................................................................... 5 Bảng 2.1. Trình tự mồi PCR .......................................................................................... 22 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 24 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng giải trình tự ............................................................... 25 Bảng 3.1. Cấu trúc của hệ gen ty thể lợn Ỉ ................................................................... 34 Bảng 3.2. Khu vực địa lý và các thông số thành phần trình tự của các giống lợn ....... 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của ba loại đường năm carbon ribose, deoxyribose và dideoxyribose ................................................................................................................ 13 Hình 1.2. Sơ đồ phản ứng giải trình tự Sanger. Ở đây, các mồi giải trình tự được gắn phóng xạ và các phản ứng tạo ra các đoạn trình tự bổ sung với khuôn DNA .............. 14 Hình 1.3. Cấu trúc và phổ phát xạ huỳnh quang của bốn loại dye succinylfluorescein được phát triển bởi DuPont .......................................................................................... 15 Hình 1.4. Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản ................... 16 Hình 3.1. Hình ảnh các cá thể lợn Ỉ .............................................................................. 27 Hình 3.2. DNA tổng số được tách từ mẫu máu lợn Ỉ .................................................... 28 Hình 3.3. Sản phẩm PCR khuếch đại các mồi 1-30 với nhiệt độ gắn mồi 54oC ........... 29 Hình 3.4. Sản phẩm PCR khếch đại tại nhiệt độ gắn mồi 53oC và 51oC ...................... 30 Hình 3.5. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR hệ gen ty thể ............................................ 31 Hình 3.6. Ví dụ cho phần kết quả giải trình tự đủ độ tin cậy và được lựa chọn ........... 32 Hình 3.7. Cấu trúc dạng vòng của hệ gen ty thể lợn Ỉ được xây dựng bởi phần mềm GenomeVX ..................................................................................................................... 33 Hình 3.8. Cấu trúc bậc hai của 22 loại tRNA được mã hóa trên hệ gen ty thể lợn Ỉ .... 41 Hình 3.9. Một phần trình tự D loop của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp. ........................................................................................................... 43 Hình 3.10. Một phần trình tự hoàn chỉnh của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp .............................................................................................. 44 Hình 3.11. Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự hoàn chỉnh được phân tích theo phương pháp Bayesian .................................................................................................. 47 Hình 3.12. Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự D loop được phân tích theo phương pháp Bayesian .................................................................................................. 49 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid tRNA RNA vận chuyển rRNA RNA ribosome P:C:I Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol RFLP Restriction fragment length polymorphism WB bp SNP Giống lợn hoang Base pair Đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) MỞ ĐẦU Lợn Ỉ đã từng là một giống lợn đƣợc nuôi rất phổ biến tại các tỉnh Bắc Bộ của Việt Nam. Giống lợn này mang nhiều đặc điểm di truyền quý nhƣ mắn đẻ, khả năng chống chịu bệnh tốt, chất lƣợng thịt thơm ngon. Tuy nhiên do kích thƣớc nhỏ, tốc độ sinh trƣởng chậm, không kinh tế, vì vậy số lƣợng lợn Ỉ đƣợc nuôi đang ngày một giảm đi và giống này có nguy cơ sẽ biến mất. Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về di truyền phân tử đối với giống lợn Ỉ, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể làm công cụ nghiên cứu nguồn gốc di truyền của lợn Ỉ. Hệ gen ty thể rất dễ khuếch đại, kích thƣớc nhỏ, bên cạnh đó chúng còn đƣợc coi là dấu hiệu phân tử (marker) trong lĩnh vực đa dạng sinh học. Những kết quả trong nghiên cứu này sẽ trở thành cơ sở phân phục vụ cho các hoạt động bảo tồn nguồn gen cũng nhƣ các nghiên cứu sâu hơn về di truyền phân tử trên đối tƣợng lợn Ỉ. Mục tiêu và phƣơng pháp này đã đƣợc chúng tôi thực hiện trong đề tài “Xác định và phân tích trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của giống lợn Ỉ tại Việt Nam”. Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về giống lợn Ỉ 1.1.1. Nguồn gốc giống vật nuôi Quá trình thuần hóa vật nuôi đƣợc diễn ra khoảng 8,000 - 10,000 năm trƣớc tại Tây Nam Á, Đông Á và Châu Mỹ, [16]. Điều này không hoàn toàn là ngẫu nhiên bởi tại thời điểm đó, sau khi Kỷ băng hà (12,200–11,100 năm trƣớc) kết thúc, khí hậu bắt đầu trở nên ấm hơn và theo mùa hơn. Một số quần thể ngƣời bắt đầu phát triển nhanh chóng và trở thành các trung tâm dân cƣ, hình thành nên các khu vực quan trọng. Quá trình định cƣ này thƣờng diễn ra tại các khu vực đất đai màu mỡ tự nhiên, thích hợp cho nông nghiệp, hoặc tại các vị trí nằm giữa các vùng đất rộng lớn, đóng vai trò liên kết các vùng đất này lại với nhau, và là điểm dừng chân của những ngƣời di cƣ. Sự tăng lên của cả dân số bản địa và di cƣ đã khiến nhu cầu cung cấp thực phẩm tăng lên, kích thích kinh tế nông nghiệp và các quá trình thuần hóa các giống nông nghiệp [43, 72, 82]. Ba khu vực Tây Nam Á (Vùng Trăng lƣỡi liềm màu mỡ và rìa phía đông của nó, hƣớng về phía lƣu vực Ấn Độ) [77], Đông Á (Trung Quốc và các nƣớc phía nam Trung Quốc) và khu vực dãy Andean của Nam Mỹ [16] đƣợc coi là các khu vực chính diễn ra quá trình thuần hóa giống vật nuôi. Gia súc, cừu, dê, lợn và trâu đƣợc thuần hóa tại hai khu vực châu Á, trong khi lạc đà không bƣớu và lạc đà Alpaca đƣợc thuần hóa ở Nam Mỹ. Ngựa là ngoại lệ, chúng đƣợc thuần hóa tại các khu vực độc lập phía bắc, ngoài ra ngựa dƣờng nhƣ là loài gia súc lớn đƣợc thuần hóa gần đây nhất (khoảng 6000 năm trƣớc) [39, 93]. 1.1.2. Giống lợn nhà (Sus scrofa) Giống lợn nhà hiện nay (Sus scrofa) bắt nguồn từ hai nhóm lợn rừng hoang dại. Đó là lợn rừng Châu Âu (Sus scrofaferus) và lợn rừng Châu Á (Sus orientalis, Sus cristatus sus vittatus) đƣợc con ngƣời thuần hoá trong thời gian dài mà thành. Căn cứ vào hình dáng của tai, ngƣời ta chia cả hai nhóm lợn nguyên thuỷ Châu Âu và Châu Á Nguyễn Đức Hiếu 2 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ thành hai loại: Lợn tai dài và lợn tai ngắn. Giống lợn lai cổ đại là do giống lợn nguyên thuỷ Châu Âu và nguyên thuỷ Châu Á tạp giao mà thành. Giống lợn này đƣợc nuôi chủ yếu tại các nƣớc dọc theo Địa Trung Hải. Trong đó lấy giống lợn lông xoăn Roman và lợn ở bán đảo Balkan lai với lợn Trung Quốc là giống thành thục sớm, phẩm chất thịt ngon, mềm, ở đời sau cho tự giao và hình thành giống lợn lai cổ đại. Các giống lợn nhà nuôi hiện nay là do các giống lợn Cổ đại trƣớc kia thông qua các phƣơng pháp tạp giao cải lƣơng khác nhau mà dần hình thành nên [5]. 1.1.3. Giống lợn Ỉ a. Đặc điểm của giống lợn Ỉ  Nguồn gốc xuất xứ Lợn Ỉ có nguồn gốc từ giống lợn Ỉ mỡ ở miền Bắc Nam Định. Qua một thời gian dài, giống lợn Ỉ mỡ đã tạp giao với các nhóm giống lợn khác trở thành giống lợn Ỉ ngày nay với hai loại hình chính là Ỉ mỡ và Ỉ pha.  Phân bố Trƣớc những năm 70 lợn Ỉ đƣợc nuôi hầu nhƣ ở khắp các tỉnh đồng bằng Bắc bộ nhƣ Nam Định, Hà Nam, Hà Tây, Hƣng Yên, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hải Dƣơng, Thái Bình, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hoá, Hải Phòng. Vị trí phổ biến của nó dần dần phải nhƣờng cho lợn Móng Cái có sức sinh sản tốt hơn, và từ cuối những năm 70 lợn Ỉ thu hẹp dần lại số lƣợng nhƣ ngày nay, chỉ còn sót lại ở một số xã của tỉnh Thanh Hoá. b. Đặc điểm sinh học  Đặc điểm ngoại hình: Lợn Ỉ có nhiều loại hình trong đó phổ biến là Ỉ mỡ và Ỉ pha. Lợn Ỉ mỡ: Lợn Ỉ mỡ cũng có lông da đen bóng, đa số có lông nhỏ thƣa, một số có lông rậm (lông móc) nhƣ Ỉ pha. Đầu hơi to, khi béo trán dô ra, mặt nhăn nhiều, nọng cổ và má sệ từ khi lợn 5-6 tháng tuổi, mắt híp, mõm to bè và ngắn, môi dƣới thƣờng dài hơn môi trên, lợn nái càng già mõm càng dài và cong lên nhƣng luôn ngắn hơn Ỉ pha. Vai nở, ngực sâu, thân mình ngắn hơn Ỉ pha, lƣng võng, khi béo thì trông ít võng Nguyễn Đức Hiếu 3 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ hơn, bụng to sệ, mông nở từ lúc 2-3 tháng, phía sau mông hơi cúp. Chân thấp hơn Ỉ pha, lợn thịt hoặc hậu bị có hai chân trƣớc thẳng, hai chân sau hơi nghiêng, lợn nái thì thƣờng đi chữ bát, hai chân sau yếu. Lợn Ỉ pha: Lợn Ỉ pha có lông da đen bóng, đa số có lông nhỏ thƣa, một số có lông rậm lông móc). Đầu to vừa phải, trán gần phẳng, mặt ít nhăn, khi béo thì nọng cổ và má chảy sệ, mắt híp. Mõm to và dài vừa phải, lợn nái càng già mõm càng dài và cong lên. Vai nở vừa phải, từ 8-9 tháng vai bằng hoặc lớn hơn mông, ngực sâu. Thân mình dài hơn so với ỉ mỡ, lƣng đa số hơi võng, khi béo thì trông phẳng, bụng to, mông lúc nhỏ hơi lép về phía sau, từ 6-7 tháng mông nở dần. Chân thấp, lợn thịt hoặc hậu bị thì hai chân trƣớc tƣơng đối thẳng, hai chân sau hơi nghiêng, lợn nái thì nhiều con đi vòng kiềng hoặc chữ bát [1]. c. Khả năng sản xuất  Khả năng sinh trƣởng Khả năng sinh trƣởng và tầm vóc của hai nòi lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ là tƣơng đƣơng nhau, chúng đƣợc thể hiện qua khối lƣợng và kích thƣớc các chiều của chúng ở các bảng sau (bảng 1.1 và 1.2): Bảng 1.1. Khối lượng lợn Ỉ và Ỉ pha qua các mốc tuổi (kg) [1] Lợn Ỉ pha Tháng tuổi Lợn Ỉ mỡ Trung bình Biến động Trung bình Biến động Sơ sinh 0.425 0.25-0.77 1 2.034 1.1-3.8 2 4.401 2.0-6.6 4.528 2.0-7.0 3 7.525 5.0-12.0 7.3 4.5-11.7 6 24.9 18.0-42.0 22.5 15.5-40.0 9 39.9 30.0-55.0 41.3 28.0-52.0 12 48.2 40.0-66.0 Nguyễn Đức Hiếu 4 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Bảng 1.2. Khối lượng lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ [1] Vòng ngực (cm) (cm) (cm) 1 38.4 39.5 77.7 74.9 44.4 41.5 83.9 81.4 48.4 42.9 90 84.7 >3 49.4 44.1 95.6 87.6 1 36.3 38.8 75.6 73.5 2 42.2 40.5 82 80.5 3 46.5 42 88.7 83.5 >3  Dài thân 3 Lợn Ỉ mỡ Cao 2 Lợn Ỉ pha Khối lƣợng (kg) Giống lợn Năm tuổi 49.3 42.6 91.5 86.3 Khả năng sinh sản Lợn đực Ỉ có hiện tƣợng nhảy cái rất sớm, ngay từ lúc 3 - 4 tuần tuổi đã tập nhảy lên lƣng cái, đến 40 ngày tuổi tinh trùng đã có khả năng thụ thai, tuy nhiên tuổi sử dụng để phối tốt nhất là từ 6 tháng tuổi, lƣợng tinh xuất một lần trung bình từ 50 - 100 ml, thời gian sử dụng đực giống tốt nhất trong 2 - 3 năm. Lợn cái Ỉ 4 - 5 tháng tuổi là động dục và có khả năng thụ thai, tuy nhiên tuổi phối giống tốt nhất là khoảng 7 tháng tuổi. Chu kỳ động dục của lợn Ỉ trung bình trong khoảng 19 - 20 ngày (biến động từ 17 đến 24 ngày). Thời gian động dục trung bình 3 4 ngày, thời điểm phối giống tốt nhất là ngày động dục thứ hai. Thời gian mang thai trung bình trong khoảng 110 - 115 ngày. Ở đàn lợn Ỉ Thanh Hóa, lợn cái thành thục về tính sớm, lúc 3 tháng tuổi có biểu hiện động dục, 4 tháng tuổi có khả năng thụ thai. Chu kỳ động dục thƣờng từ 19 - 21 ngày, thời gian động dục kéo dài 4 - 5 ngày (biến động 3 - 8 ngày). Tuổi phối giống đầu tiên tốt nhất là 8 tháng tuổi, lúc đó khối lƣợng cơ thể đạt 35 - 40 kg. Thời gian Nguyễn Đức Hiếu 5 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ mang thai trung bình là 110 ngày, số con đẻ ra trung bình đạt 8.8 - 11.3 con/ lứa và con cái có tuổi sử dụng có thể tới 10 - 11 năm [1]. 1.2. Tầm quan trọng của các nghiên cứu về lợn tại Việt Nam Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với 80% dân số sống ở nông thôn và 70% lấy nông nghiệp làm nguồn kinh tế chính của họ [62]. Trong lĩnh vực nông nghiệp, trồng lúa nƣớc và chăn nuôi lợn đƣợc liên kết chặt chẽ với đời sống của ngƣời nông dân Việt Nam. Chăn nuôi luôn chiếm một vị trí quan trọng trong hệ thống nông nghiệp Việt Nam nói chung và ở các gia đình nông thôn nói riêng [21]. Chăn nuôi lợn là một nghề truyền thống ở Việt Nam, đóng một vai trò chủ chốt đối với đời sống kinh tế và văn hóa của ngƣời nông dân [49]. Lợn đƣợc nuôi giữ lâu đời và vô cùng phổ biến, trở thành một trong những giống vật nuôi quan trọng nhất. Phần lớn chăn nuôi lợn ở Việt Nam là chăn nuôi nhỏ. Có tới 80% sản lƣợng thịt lợn đến từ các cơ sở chăn nuôi nhỏ với một đến hai lợn nái và dƣới mƣời con lợn nuôi lấy thịt [48]. Trong khu vực chăn nuôi, nuôi nhỏ lẻ tại miền Bắc Việt Nam chiếm tới 41% tổng thu nhập từ lợn, đóng góp chủ yếu từ các khu vực dân tộc thiểu số [38]. Lợn đƣợc nuôi nhỏ lẻ vừa để bán vừa để phục vụ tiêu dùng cho chính các hộ gia đình. Do đó, chúng quan trọng ở nhiều khía cạnh nhƣ cung cấp hàng hóa cho kinh tế, tăng cƣờng thu nhập, tạo công ăn việc làm bảo đảm sinh kế cho ngƣời nông dân, cải thiện chất lƣợng bữa ăn cho gia đình. Tại các khu vực miền núi, nuôi lợn gắn bó chặt chẽ với văn hóa truyền thống, phong tục tập quán của các dân tộc thiểu số, nhƣ các ngày lễ hội đón năm mới hay các dịp đặc biệt trong suốt một năm [35]. Số lƣợng lợn tại Việt Nam trong những năm gần đây đã tăng lên nhanh chóng. Năm 2001, số lƣợng lợn đƣợc nuôi là khoảng 21,8 triệu con, và đạt xấp xỉ 24,7 triệu con vào năm 2005, tăng bình quân 6,3% một năm. Năm 2005, 2,3 triệu tấn thịt lợn đƣợc tạo ra, và 2006 là 2,4 triệu tấn, chiếm lần lƣợt 81% và 71,5% tổng sản lƣợng thịt của các năm tƣơng ứng [71]. Hơn 90% lƣợng thịt lợn đƣợc cung cấp trong nƣớc bởi các hộ nông dân và hơn 98% các hộ gia đình Việt Nam tiêu thụ sản phẩm thịt lợn [6]. Nguyễn Đức Hiếu 6 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Đặc biệt là tại các hộ gia đình ở các tỉnh miền núi, phần lớn các hộ đều sử dụng chính sản phẩm thịt họ nuôi. Một số nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để đánh giá hiệu suất của các giống lợn tại các trang trại và các trung tâm giống về các giống ngoại lai, các giống lai và một số đặc điểm của các giống bản địa nhƣ khả năng sinh sản, sinh trƣởng, cũng nhƣ phần trăm thịt nạc [2-4]. Do điều kiện chăn nuôi nhỏ, hiệu suất của chăn nuôi lợn tại Việt Nam nhìn chung vẫn ở mức thấp. Những thông tin di truyền về các giống lợn bản địa Việt Nam còn khá hạn chế. Mặc dù việc phân biệt các giống bản địa Việt Nam có thể đƣợc thực hiện thông qua các đặc điểm hình thái rất riêng biệt của chúng, nhƣng thông tin về di truyền vẫn hết sức quan trọng. Chúng giúp kiểm soát tốt hơn, chính xác hơn các giống và có thể tìm ra mối liên hệ giữa chúng với các tính trạng quý. Ngoài ra, những nghiên cứu đánh giá năng suất, chất lƣợng thịt và liên hệ chúng với sự đa dạng di truyền của các giống lợn vẫn chƣa đƣợc thực hiện nhiều ở Việt Nam. 1.3. Marker trong nghiên cứu đa dạng di truyền Việc áp dụng di truyền phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền có thể tác động lớn tới hiểu biết của chúng ta về những sự kiện đã từng diễn ra. Cụ thể, các nghiên cứu gần đây cho phép tìm ra tổ tiên của các loài gia súc hiện nay cũng nhƣ quá trình phát triển chăn nuôi trong hàng ngàn năm qua [56, 77]. Những thông tin thú vị này đã cho chúng ta hiểu biết thêm về sự sống, đặc biệt là cách thức con ngƣời tạo nên sự đa dạng sinh học nông nghiệp trong một khoảng thời gian tƣơng đối ngắn. Hơn nữa, kết hợp các nghiên cứu tiến hóa ở ngƣời [30], vật nuôi [73, 80] và cây trồng [77] có thể cung cấp cho chúng ta một cái nhìn toàn diện về xã hội loài ngƣời trên khắp thế giới. Cho đến nay vẫn có rất nhiều tranh luận giữa các nhà khảo cổ học động vật về thời điểm xuất hiện và thời gian của những thay đổi trong cấu trúc tuổi, giới tính của các quần thể động vật thuần hóa [7, 101]. Điều này để lại những câu hỏi mở về những quần thể dƣới loài hoặc thậm chí các loài tổ tiên hoang dã đã đƣợc thuần hóa và mức Nguyễn Đức Hiếu 7 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ độ đóng góp của chúng vào nguồn gen hiện đại ngày nay. Nghiên cứu phân tử cho phép trả lời các câu hỏi đó, các dấu hiệu DNA có thể đƣợc áp dụng và nghiên cứu chủng loại phát sinh, đa dạng quần thể, xác định di truyền của cá thể, đƣợc phát triển từ những năm 1970 [41, 86] nhƣng chỉ đƣợc áp dụng phổ biến cho các nghiên cứu động vật thuần hóa và đa dạng từ những năm đầu thập niên 1990 [54, 56]. Một trong những mối quan tâm toàn cầu hiện nay là sự mất dần của đa dạng sinh học nông nghiệp khi phải đối mặt với những áp lực ngày càng tăng của quá trình canh tác hiện đại. Việc xây dựng các khái niệm về tạo giống hiện đại từ giữa những năm 1800 đã gây ra nhƣng thay đổi đáng kể trong lĩnh vực chăn nuôi, đặc biệt là ở mức độ quy mô lớn [66]. Hệ quả là ngƣời nông dân dần dần thay thế các giống vật nuôi bản địa ít hiệu quả bằng các giống quốc tế có năng suất cao., do vậy một lƣợng đáng kể gia súc đã biến mất hoặc đang bị đe dọa [90]. Những dữ liệu này cũng cho thấy tầm quan trọng của việc quản lý và bảo tồn các nguồn gen động vật và thực vật ngày nay. Nhiều sự đa dạng đang mất đi mà không rõ nguyên nhân, bao gồm số lƣợng lớn các giống vật nuôi, mà không hề đƣợc quản lý và thống kê tại thời điểm hiện tại trong khi sự đa dạng sinh học này có thể chứa những vật liệu di truyền (ví dụ nhƣ các loài thích nghi bản địa) có giá trị cho sản xuất trong tƣơng lai. Có khả năng là một lƣợng lớn các giống đang và sẽ tiếp tục biến mất trƣớc khi các đặc điểm cũng nhƣ tiềm năng của chúng đƣợc nghiên cứu và đánh giá. Do đó, trong hoàn cảnh này, những chiến lƣợc để bảo tồn đa dạng gia súc là rất quan trọng và các dữ liệu nghiên cứu phân tử của các giống vật nuôi có thể sẽ trở thành cơ sở hỗ trợ việc bảo tồn sự đa dạng [16] . Để xác định đƣợc nguồn gốc thuần hóa của một loài vật nuôi, các nhà khoa học phải dựa vào một số dấu hiệu phân tử. Các marker này cần có một số đặc điểm, đầu tiên, nó nên đủ bảo thủ để cho phép xác định các đơn vị phân loại hoặc quần thể từ mức loài trở xuống. Thứ hai, nó vẫn đủ đa dạng theo phạm vi địa lý của loài để có thể xác định gần đúng sự phân bố của quá trình thuần hóa. Thứ ba, các dấu hiệu phân tử nên tiến hóa nhƣng với tỉ lệ không đổi, cho phép xác định thời điểm nguồn gốc của một Nguyễn Đức Hiếu 8 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ đa hình. Do đáp ứng đƣợc các yêu cầu này, hiện nay DNA ty thể là một công cụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu về quá trình thuần hóa. 1.3.1. Cấu trúc hệ gen ty thể Hệ gen ty thể của động vật có vú bao gồm một DNA mạch vòng có kích thƣớc 16.6 kb. Hai sợi trên mạch kép của DNA ty thể đƣợc phân biệt thành hai sợi sợi nặng (H) và sợi nhẹ (L) dựa theo tỷ lệ thành phần các nucleotide [42]. Hầu hết thông tin đƣợc mã hóa trên sợi nặng, với gen mã hóa cho hai rRNA, mƣời bốn tRNA, và mƣời hai protein. Sợi nhẹ mã hóa cho tám tRNA và một protein lớn. Tất cả các sản phẩn protein là thành phần của các phức hợp enzyme tham gia vào quá trình phosphoryl oxy hóa [19]. Các gen không chứa intron và ngoại trừ một số vùng điều hòa, trình tự intergentic thƣờng không tồn tại hoặc chỉ có giới hạn ở một số vùng. Cả hai loại phân tử tRNA và rRNA đều có kích thƣớc nhỏ bất thƣờng [97]. Một số gen mã hóa protein nằm chồng chéo và trong nhiều trƣờng hợp, một phần của bộ ba kết thúc tuy không đƣợc mã hóa nhƣng đƣợc tạo ra sau khi phiên mã bởi quá trình gắn đuôi polyA sau phiên mã [63]. Với những trình tự DNA ty thể đã đƣợc nghiên cứu, so sánh các chuỗi protein ty thể cho thấy những khác biệt so với mã di truyền chuẩn và có những thay đổi trong việc quy định mã bộ ba đã đƣợc tìm ra ở những loài khác nhau [64]. Ví dụ, trong hệ gen ty thể của hầu hết các loài, TGA đƣợc sử dụng nhƣ mã bộ ba mã hóa cho Tryptophan chứ không phải là stop codon. Tƣơng tự, AGR (R=A, G) mã hóa cho mã bộ ba kết thúc ở hệ gen ty thể của động vật có xƣơng sống, serine ở hệ gen ty thể động vật da gai và mã hóa cho Arginine ở hệ gen ty thể nấm men cũng nhƣ bộ mã di truyền chuẩn. Một đặc điểm đáng ngạc nhiên của hệ thống di truyền ty thể đó là sử dụng một cơ chế mã hóa đơn giản, cho phép dịch mã các codon với ít hơn 32 loại tRNA, điều này là do việc sử dụng chỉ một tRNA duy nhất với nucleotide tại vị trí đầu tiên (vị trí biến đổi) là Uracil để nhận biết tất cả các bộ ba của một họ gồm có 4 bộ ba mã hóa [11]. Ty Nguyễn Đức Hiếu 9 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ thể của nấm sử dụng Uracil tại vị trí biến đổi để đọc hai họ bộ ba mã hóa với một purine nằm tại vị trí thứ ba của mã bộ ba [36]. Cơ chế này ngăn ngừa việc đọc sai của hai họ mã bộ ba bằng cách sử dụng một Pyrimidine tại vị trí thứ ba và nó đƣợc coi là không thay đổi ở các hệ gen ty thể của động vật có xƣơng. Hơn nữa với bộ ba AGR ở động vật có xƣơng đóng vai trò bộ ba kết thúc, đồng thời việc biến đổi mã khởi đầu cho phép chỉ cần 22 tRNA là đủ để dịch mã tất cả 13 gen mã hóa cho protein của hệ gen ty thể [60, 64]. Ở các tế bào động vật có xƣơng sống diễn ra quá trình trao đổi chất, có một tỷ lệ lớn các DNA ty thể có chứa cấu trúc sợi ba, đƣợc gọi là vòng lặp thay thế hoặc D loop, trong đó bao gồm một cấu trúc sợi nucleic acid ngắn, bổ sung với sợi L và chiếm chỗ của sợi H [42]. Vùng D loop nằm giữa các gen mã hóa cho tRNA Phe and tRNA Pro và đóng vai trò vị trí kiểm soát chính quá trình biểu hiện của DNA ty thể, chứa vị trí khởi đầu tái bản và các promoter chính của quá trình phiên mã [94]. Ty thể không thể trực tiếp tự vận hành. Quá trình tái bản và phiên mã phụ thuộc vào các yếu tố đƣợc mã hóa trong nhân. Các tRNA ty thể đƣợc điều khiển với các enzyme amino acyl-tRNAsynthases và trong các động vật có xƣơng sống tất cả các protein của ribosome ty thể đều đƣợc mã hóa và tổng hợp bên ngoài bào quan. Các enzyme của các con đƣờng dị hóa khác nhau nằm trong ty thể cũng nhƣ các các thành phần của ty thể đều đƣợc mã hóa trong DNA nhân. Thậm chí cả các phức hợp enzyme của hệ thống phosphoryl oxy hóa cũng có nguồn gốc di truyền kết hợp từ cả DNA ty thể và nhân [75]. 1.3.2. Ty thể trong nghiên cứu đa dạng di truyền Hệ gen ty thể mặc dù có kích thƣớc rất nhỏ trong kích thƣớc toàn bộ hệ gen của sinh vật nhƣng nó lại đƣợc coi là một marker đa dang phân tử phổ biến nhất ở động vật trong suốt nhiều thập kỷ qua. Đã có rất nhiều những nhà di truyền học quần thể và hệ thống học áp dụng công cụ này trong nghiên cứu của họ [8, 59]. Nguyễn Đức Hiếu 10 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Trong các nghiên cứu về về nguồn gốc của các giống lợn bản địa, Fernández (2008, 2011) đã tiến hành nghiên cứu mối quan hệ giữa đa hình DNA ty thể và chất lƣợng thịt ở giống lợn Iberia. Kết quả đã phát hiện một số đa hình đóng vai trò nhƣ các chỉ thị phân tử đóng góp vào quá trình chọn giống lợn này [25, 26]. Năm 2008, Wu và cs cũng sử dụng các phân tích đa hình DNA ty thể nhƣ một công cụ để xác định nguồn gốc của các giống lợn bản địa phân bố ở khu vực sông Mê Kông và các vùng trung và hạ lƣu sông Dƣơng Tử [25]. Xác định trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của giống lợn Visayan, lợn Java với tổng 16.475 bp cho thấy nó có cấu trúc đặc trƣng của 13 gen mã hóa protein, 2 gen rRNA, 22 gen tRNA và một vùng điều khiển không mã hóa D-loop. Sự sắp xếp của các gen này tƣơng tự nhƣ ở các giống lợn khác. Hệ gen ty thể phân tích ở đây sẽ cung cấp nguồn tài nguyên di truyền mới để khám phá sự phát triển của lợn [23, 52]. Những lý do của việc DNA ty thể trở thành một lựa chọn tốt cho marker phân tử đó là: DNA ty thể tƣơng đối dễ khuếch đại bởi nó có nhiều bản sao trong tế bào, trình tự gen ty thể đƣợc bảo tồn rất mạnh giữa các loài động vật, với rất ít sự trùng lặp, không chứa intron, các vùng intergenic ngắn [28]. DNA ty thể có độ đa dạng cao trong quần thể tự nhiên do tỷ lệ đột biến lớn, điều này có thể trở thành các bằng chứng cho lịch sử phát triển của quần thể. Các vùng biến đổi (Ví dụ vùng D loop) thƣờng đặt giữa các vùng bảo tồn cao (DNA ribosome), ở đó các mồi PCR có thể đƣợc thiết kế. Quá trình khuếch đại không đặc hiệu chỉ xảy ra khi các cặp mồi PCR khuếch đại cả những vùng gen ty thể đã đƣợc chuyển vào hệ gen nhân ở một số loài. Rõ ràng, DNA ty thể là một giải pháp tiện lợi nhất và rẻ nhất cho việc khám phá gen của các loài mới trong tự nhiên. Vùng D loop không mã hóa cho bất kì một protein nào và có tốc độ tiến hóa cao hơn nhiều so với các các khu vực khác của hệ gen ty thể. Trong suốt hai mƣơi năm qua, D loop đã đƣợc sử dụng trong các phân tích chủng loại phát sinh. Sự khác biệt của chuỗi D loop giữa các giống bò thuộc châu Âu, Phi và Ấn Độ giúp tìm ra nguồn gốc Nguyễn Đức Hiếu 11 K23 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ của hai giống bò Bos taurus và Bos indicus bản địa là từ hai vùng riêng biệt [13]. Ngoài ra, trình tự D loop còn đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng và tính bản địa ở các loài chó, ngựa, và dê. Việc nghiên cứu hoàn chỉnh trình tự vùng D-loop ty thể của giống lợn trắng Pudong ở vùng Taihu - Trung Quốc, đã cho thấy không có sự trao đổi di truyền giữa các quần thể, và giống lợn này chỉ xuất hiện duy nhất tại đây, do vậy cần có những chính sách để bảo tồn nguồn gen bản địa quý hiếm này [95]. Bên cạnh đó, DNA ty thể có một số đặc tính sinh học cụ thể [9, 10], để trở thành một marker phân tử sử dụng trong lĩnh vực đa dạng sinh học. Đầu tiên, ty thể đƣợc di truyền vô tính theo dòng mẹ, có nghĩa là nó sẽ không xảy ra quá trình tái tổ hợp – tất cả các vùng trên hệ gen đều có nguồn gốc di truyền chung. Điều này giúp giảm bớt số lƣợng mẫu và lƣợng dữ liệu cần phân tích so với khi phân tích các loại đối tƣợng biến đổi mạnh. Thứ hai, mức độ biến đổi của DNA ty thể là thấp. Do tham gia các chức năng trao đổi chất cơ bản, các gen mã hóa trên hệ gen ty thể đƣợc coi là ít có khả năng biến đổi hơn so với các gen khác liên quan đến quá trình thích nghi. Cuối cùng, tốc độ tiến hóa của DNA ty thể đƣợc giả định là theo thời gian, chỉ chứa các đột biến đƣợc tích lũy dần theo thời gian mà không liên quan đến sự chọn lọc. Rõ ràng DNA ty thể là một marker lý tƣởng. 1.4. Phƣơng pháp giải trình tự Sanger Phƣơng pháp này đƣợc phát triển bởi Fred Sanger vào khoảng thời gian giữa những năm 1970 [79]. Thay vì sử dụng phản ứng hóa học, Sanger lựa chọn một phƣơng pháp sử dụng tới một dạng cấu trúc thứ ba của gốc đƣờng ribose. Nhƣ thể hiện trong hình 1.1, ribose có một nhóm hydroxyl tại cả hai vị trí carbon 2’ và 3’ trong khi deoxyribose chỉ có duy nhất một nhóm hydroxyl tại vị trí carbon 3’. Dạng thứ ba của ribose trong đó loại bỏ hydroxyl tại cả hai vị trí carbon 2’ và 3’. Dạng này đƣợc gọi là dideoxyribose, và bất cứ khi nào một dideoxyribose đƣợc gắn vào một chuỗi polynucleotide, quá trình kéo dài chuỗi đó sẽ bị dừng lại. Nhƣ vậy, sự kết hợp của các dideoxynucleotide riêng biệt sẽ tạo ra các chuỗi có kết thúc có chọn lọc. Nguyễn Đức Hiếu 12 K23 Sinh học thực nghiệm