Tài liệu Xác định và phân tích họ gen mã hóa nhân tố phiên mã nuclear factor yb trên sắn (manihot esculenta crantz) bằng công cụ tin sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ THẢO XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH HỌ GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NUCLEAR FACTOR-YB TRÊN SẮN (Manihot esculenta Crantz) BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ THẢO XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH HỌ GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NUCLEAR FACTOR-YB TRÊN SẮN (Manihot esculenta Crantz) BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM THỊ LÝ THU TS. LÊ QUỲNH MAI Hà Nội, năm 2019 LỜI CẢM ƠN Thời gian làm báo cáo gói gọn trong hai năm nhưng vô cùng quý báu và hữu ích đối với bản thân em. Em có cơ hội vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn và hoàn thiện những lỗ hổng kiến thức, đồng thời giúp em có cơ hội tiếp xúc với môi trường công việc cũng như rèn luyện các kỹ năng làm việc, kỹ năng giao tiếp trong cuộc sống. Trước tiên, với tấm lòng tôn sư trọng đạo, em xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô tại Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội, các Thầy Cô khoa Sinh học đã dạy bảo em trong suốt thời gian hai năm cao học vừa qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phạm Thị Lý Thu – Viện Di truyền Nông nghiệp, TS. Lê Quỳnh Mai – Khoa sinh học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, và truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu để em hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô, chú, anh, chị phòng Sinh học phân tử – Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi và tốt nhất cho em trong quá trình thực tập. Cuối cùng xin kính chúc tất cả quý Thầy Cô, cùng TS. Phạm Thị Lý Thu, TS. Lê Quỳnh Mai lời chúc sức khỏe và thành công. Hà Nội, tháng 10 năm 2019 Học viên Lê Thị Thảo i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i MỤC LỤC ...................................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây sắn .................................................................3 1.2 Vai trò của cây sắn và tình hình sản xuất, tiêu thụ sắn Việt Nam .....................4 1.2.1 Vai trò của cây sắn ......................................................................................4 1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn Việt Nam ..............................................6 1.3. Đặc hình hình thái học, đặc điểm di truyền của sắn .........................................8 1.3.1. Đặc hình hình thái học................................................................................8 1.3.2 Đặc điểm di truyền của sắn .......................................................................10 1.4. Tổng quan về họ NF-YB ...............................................................................13 1.4.1. Cấu trúc NF-Y và tiểu phần NF-YB ........................................................13 1.4.2 Vai trò của NF-YB đối với thực vật ..........................................................14 1.4.3. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen của NF-Y và NF-YB...............................15 1.4.4 Tình hình nghiên cứu NF-YB trên thế giới ...............................................18 1.4.5 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .............................................................21 1.5. Phân tích họ gen mã hóa NF-YB bằng công cụ tin sinh học ..........................22 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................... 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................24 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................24 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................24 2.3.1. Phương pháp xác định gen mã hóa NF-YB trên hệ gen của sắn ..............24 2.3.2. Phương pháp phân tích cấu trúc gen ........................................................25 2.3.3. Phương pháp xác định đặc tính protein ....................................................26 2.3.4. Phương pháp dự đoán vùng điều hòa cis- trên vùng promoter của gen mã hóa NF-YB của sắn .............................................................................................27 2.3.5. Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện của gen mã hóa NF-YB .............28 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 31 ii 3.1. Kết quả xác định và chú thích họ gen mã hóa tiểu phần NF-YB trên hệ gen của sắn....................................................................................................................31 3.2. Kết quả phân tích cấu trúc gen mã hóa tiểu phần NF-YB ở sắn ....................36 3.3. Kết quả phân tích đặc tính họ gen mã hóa tiểu phần NF-YB ở sắn ...............38 3.4. Kết quả phân tích yếu tố điều hòa cis- trên vùng promoter của các gen mã hóa tiểu phần NF-YB ở sắn ...................................................................................41 3.5. Kết quả phân tích dữ liệu biểu hiện của gen mã hóa NF-YB ở sắn ...............45 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 49 ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 50 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1:Một số CRE cơ bản....................................................................................19 Bảng 1.2: Danh sách các loại thực vật đã nghiên cứu họ NF-YB trên thế giới ........17 Bảng 3.1: Mã định danh và thông tin chú thích họ gen mã hóa tiểu phần NF-YB ở sắn..............................................................................................................................33 Bảng 3.2: Một số thông số đặc điểm và tính chất protein thuộc họ NF-YB ở sắn ...38 Bảng 3.3: Một số CRE liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở mô được dự đoán trong vùng promoter của họ gen mã hóa NF-YB ở sắn ............................................41 Bảng 3.4: Các CRE đáp ứng hóc môn ......................................................................43 Bảng 3.5: Các CRE đáp ứng bất lợi ..........................................................................44 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ khái quát vai trò của cây sắn .............................................................5 Hình 1.2: Biểu đồ diện tích và sản lượng sắn Việt Nam giai đoạn 2010 – 2016 (TCTK, 2017) ..............................................................................................................7 Hình 1.3: Hình ảnh các bộ phận của cây sắn ..............................................................9 Hình 1.4: Hình ảnh thể hiện mối quan hệ tiến hóa về hệ gen của tập đoàn giống sắn (Bredeson et al, 2016) ...............................................................................................12 Hình 2.1: Giao diện cơ sở dữ liệu Phytozome ..........................................................24 Hình 2.2: Giao diện cơ sở dữ liệu NCBI ...................................................................25 Hình 2.4: Giao diện cơ sở dữ liệu Expasy ................................................................27 Hình 2.5: Giao diện cơ sở dữ liệu TargetP................................................................27 Hình 2.6: Giao diện cơ sở dữ liệu PlantCARE .........................................................28 Hình 2.7: Hình ảnh minh họa các mô sắn (Wilson et al, 2017) ................................29 Hình 3.1: Hình ảnh BlastP ........................................................................................32 Hình 3.2: Vị trí phân bố của các gen mã hóa tiểu phần NF-YB trên sắn .................35 Hình 3.3: Cấu trúc các gen của họ NF-YB trên sắn ..................................................36 Hình 3.4: Mức độ biểu hiện của họ NF-YB ở 4 mô trong điều kiện thường ............46 Hình 3.5: Mức độ biểu hiện của họ NF-YB ở 7 mô trong điều kiện thường ............47 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ cái viết Thuật ngữ Tiếng Anh Thuật ngữ Tiếng Việt tắt ABA ABRE AURE BLAST Abscisic acid Axit abscisic Abscisic acid responsive Yếu tố đáp ứng axit abscisic element Auxin responsive element Yếu tố đáp ứng auxin Basic local alignment search Công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản tool Protein-protein BLAST Công cụ căn trình tự protein CAAT-binding factor Yếu tố bám–CAAT International Center for Trung tâm Nông nghiệp Nhiệt Tropical Agriculture đới Quốc tế CRE Cis regulatory element Yếu tố điều hòa cis- cTP Choloroplast transit peptide Peptide vận chuyển lục lạp DNA Deoxyribonucleic acid Acid đêoxyribônucleic ER Endoplasmic reticulum Lưới nội chất ERE Ethylene responsive element Yếu tố liên quan đến ethylene EST Expressed sequence tags Thẻ hiển thị trình tự Gibberellin responsive element Yếu tố liên quan đến gibberellin The gene structure display Chương trình hiển thị cấu trúc server gen HAP Histo-aspartic protease Histo-aspartic protease HCN Hydrocyanic acid Axit hydrocyanic HMF Histone fold motif Motif gấp khúc histone HSE Heat stress element Yếu tố đáp ứng nóng Jasmonate acid responsive Yếu tố đáp ứng đến axit elements jasmonate Kilodalton Đơn vị trọng lượng phân tử BLASTP CBF CIAT GARE GSDS JARE kDa vi LTRE MBS mTP Low temperature responsive Yếu tố đáp ứng lạnh element MYB binding site Vị trí bám MBS Mitochondrial targeting Peptide hướng tới mục tiêu ty thể peptide Molecular weight Trọng lượng phân tử Nation center for Trung tâm thông tin công nghệ biotechnology information sinh học quốc gia NF-Y Nuclear factor Y Yếu tố phiên mã Y pI Isoelectric point Điểm đẳng điện RNA Ribo nucleic acid Acid ribonucleic Salicylic acid responsive Yếu tố đáp ứng axit salicylic mW NCBI SARE element Seretory pathway signal Peptide tín hiệu con đường bao peptide gói TCHQ - Tổng cục hải quan TCTK - Tổng cục thống kê TF Transciption factor Yếu tố phiên mã USD United States dollar Đô la Mỹ SP vii MỞ ĐẦU Trong vài thập kỷ trở lại đây, sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử đã tạo ra một khối lượng rất lớn thông tin liên quan đến các trình tự sinh học, cấu trúc gen, và nhiễm sắc thể. Tin sinh học ra đời tiếp cận thuật toán máy tính đã giúp cho việc lưu trữ, tìm kiếm, phân tích, xử lý và dự đoán các kết quả nghiên cứu sinh học diễn ra hiệu quả. Những nghiên cứu trong tin sinh học tập trung vào: (1) đánh dấu, mô tả và phân tích các trình tự DNA; (2) so sánh các trình tự DNA, protein bằng cách căn các trình tự và tạo cấu trúc ba chiều của các phân tử protein; (3) mô phỏng sự tương tác giữa các phân tử này với các chất, các phân tử khác. Tin sinh học còn hỗ trợ các nghiên cứu đa dạng và tiến hóa sinh vật góp phần làm sáng tỏ thêm bản chất các quá trình sinh học. Sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những giống cây trồng lâu đời và quan trọng phục vụ nhiều lợi ích khác nhau cho cuộc sống. Hiện nay, sắn được đánh giá là cây lương thực, cây công nghiệp và nguyên liệu thiết yếu, là giải pháp kinh tế cho hàng triệu nông dân sống ở những vùng nông thôn của Đông Nam Á, bao gồm cả Việt Nam. Vì thế, cây sắn luôn thu hút được nhiều sự quan tâm nhất là khi trong thời gian gần đây hệ gen của loài vừa được giải mã thành công. Quá trình sinh trưởng và phát triển thực vật cũng như sắn sẽ luôn chịu ảnh hưởng từ các yếu tố ngoại cảnh bất lợi. Hạn hán, đất nhiễm mặn và nhiệt độ là yếu tố môi trường chính ảnh hưởng đến sự phân bố địa lý của thực vật trong tự nhiên, giới hạn năng suất cây trồng trong nông nghiệp và đe dọa an ninh lương thực. Cây thích nghi với môi trường sống nhờ khả năng điều chỉnh biểu hiện gen đáp ứng với các bất lợi phi sinh học. Quá trình này có sự tham gia của nhóm nhân tố phiên mã điều chỉnh hoạt động các gen trong việc ứng phó với các bất lợi môi trường. Nhân tố phiên mã (Transcription factor, TF) là một nhóm protein điều hòa đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Nuclear factor Y (NF-Y) là một trong những nhóm nhân tố phiên mã quan trọng và được tìm thấy ở tất cả các loài thực vật. 1 Các nghiên cứu đã chứng minh rằng, NF-Y không chỉ liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển ở thực vật mà còn tham gia vào quá trình điều hòa sự hoạt động gen và liên quan đến cơ chế đáp ứng với các tác nhân bất lợi (Mu et al, 2013). Về cấu trúc, NF-Y gồm 3 tiểu phần, NF-YA, NF-YB và NF-YC. Trong đó, NF-YB được đặc trưng bởi vùng gấp histone (histone fold motif, HFM) và lõi histone H2B (CBFD_NFYB_HMF, Pfam: PF00808) (Laloum et al, 2013). Đặc điểm này cho phép xác định một cách hệ thống về tiểu phần NF-YB ở các loài thực vật dựa vào một số công cụ tin sinh học trực tuyến. Cùng với sự phát triển và ứng dụng của tin sinh học đã cho phép nghiên cứu về họ gen NF-Y trên một số cây trồng quan trọng như như lúa (Oryza sativa) (Miyoshi et al, 2003), đậu tương (Glycine max) (Quach et al, 2015), cà chua (Solanum lycopersicum) (Li et al, 2016), cam (Citrus sinensis) (Hà và cs. 2017). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về họ NF- YB ở cây sắn (Manihot esculenta Crantz) được công bố tại Việt Nam. Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã NF-YB trên sắn dựa trên vật liệu nghiện cứu là hệ gen của giống sắn mô hình AM560-2 (Bredeson et al, 2016) trên cơ sở dữ liệu Phytozome v11.0 (Goodstein et al, 2012) bằng công cụ tin sinh là cần thiết để góp phần đa dạng thêm cơ sở dữ liệu về họ gen có nhiều chức năng sinh học khác nhau này, trong đó đáng chú ý là tính chống chịu với tác nhân bất lợi của môi trường. Sử dụng công cụ tin sinh học để tìm kiếm, mô phỏng xác định cấu trúc, phân tích đặc tính NF- YB sẽ giúp cho những nghiên cứu thực nghiệm sau này đạt hiệu quả cao, góp phần xây dựng hệ cơ sở dữ liệu về họ NF-Y trên đa dạng các loài thực vật. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định và phân tích họ gen mã hóa nhân tố phiên mã nuclear factor-YB trên sắn (Manihot esculenta Crantz) bằng công cụ tin sinh học”. 2 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây sắn Cây sắn tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, là cây có nguồn gốc lâu đời và được trồng ở nhiều nước trên thế giới. Cây sắn cũng như các cây có củ khác, rất khó phát hiện chính xác nguồn gốc phát sinh và tiến hóa. Vào cuối thế kỷ XVIII, nhiều tác giả đặc biệt là Crantz cho rằng tất cả các loài thuộc chi Manihot đều có nguồn gốc Châu Mỹ. Năm 1772, Raynal đưa ra ý kiến cho rằng sắn có nguồn gốc ở Châu Phi. Sau đó, một số tác giả khác như Humboldt, Brown, Moreaude Jonnes, Saint-Hilaire và De Candolle lại khẳng định nguồn gốc của cây sắn là ở Châu Mỹ. Năm 1886, De Candolle coi Brazil là trung tâm phát sinh của loài. Năm 1973, dựa trên những nghiên cứu phạm vi rộng từ Nam Mỹ đến Argentina, Roges và Appan đã xác định được chi Manihot có 98 loài sắn hoang dại phân bố khắp vùng nhiệt đời của Châu Mỹ. Nassar (1978) xác định có 4 trung tâm phát sinh loài sắn hoang dại: vùng Đông Bắc Brazil có 2 trung tâm còn lại ở Mexico và Bolivia. Đến nay các nhà khoa học đã thống nhất quan điểm và đi đến khẳng định nguồn gốc của cây sắn ở châu Mỹ, với trung tâm phát sinh của nó nằm ở Đông Bắc Brazil thuộc lưu vực sông Amazon (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Về phân loại học, loài Manihot esculenta Crantz nằm trong chi Manihot thuộc họ thầu dầu gồm cây có hoa, hạt kín, hai lá mầm. Bauhin (năm 1651) là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ chi này, khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thầy tu Pháp A. Thevet mang từ Brazil về. Ông đặt tên loài là Manihot Theveti. Có thể cho rằng loài cây đó hiện nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz. Năm 1776, Crantz công bố một loài có tên Manihot escuenta căn cứ vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam. Năm 1938, Cifferi trở lại với cách gọi tên của Crantz. Năm 1973, Rogers và Appan đưa ra bảng phân loại cuối cùng được nghiên cứu trong 20 năm về chi Manihot với phương pháp phân loại số lượng đã phân loại cho 98 loài thành 17 nhóm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Nguyễn Hoàng Lâm, 2013). 3 Hiện nay, sắn đã được trồng hơn 100 nước ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều ở Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ. Ở Châu Á, sắn du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII và Sri Lanka vào thế kỷ XVIII. Sau đó, sắn được trồng ở Trung Quốc, Myanmar và các nước Châu Á khác ở cuối thế kỷ XVIII đầu thế kỷ XIX. Cây sắn du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVIII. Hiện chưa có tài liệu chính xác về nơi trồng và năm trồng đầu tiên. Sắn được canh tác ở hầu hết các tỉnh ở Việt Nam nhiều nhất là vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, trung du và miền núi phía Bắc, ven biển Nam Trung Bộ và ven biển Bắc Bộ (Đường Hồng Dật, 2006). 1.2 Vai trò của cây sắn và tình hình sản xuất, tiêu thụ sắn Việt Nam 1.2.1 Vai trò của cây sắn Sắn là cây lương thực quan trọng bên cạnh các loại cây như lúa, ngô, khoai lang. Các bộ phận của cây sắn gồm: lá, thân, củ đều được sử dụng. Thân sắn để làm giống, nguyên liệu cho công nghiệp cellulose, làm nấm, củi đun. Củ sắn và lá sắn có giá trị sử dụng cao. Nó cung cấp nguồn dinh dưỡng cho con người và vật nuôi. Lá sắn non giàu đạm được dùng như rau trong bữa ăn hàng ngày cho con người, thức ăn cho cá và cho tằm. Lá sắn ủ chua làm giảm đáng kể hàm lượng axit HCN (hydrocyanic axit) được dùng bổ sung vào khẩu phần ăn của lợn, trâu, bò, v.v. Bột lá sắn có chứa nguồn protein thô cao từ 16,7%-39,9%, lipit 3,8%-10,5%, chất xơ 4,8-29%, giàu vitamin A và vitamin C sau quá trình chế biến có thể bảo quản lâu dài và sử dụng làm thức ăn cho động vật đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi. Lá sắn còn dùng như một số bài thuốc dân gian lưu truyền chữa các bệnh ngoài da, mụn, nhọt. Củ sắn tươi được sử dụng trực tiếp làm thức ăn giàu tinh bột cho người và vật nuôi (Hình 1.1). Ngoài ra, củ sắn tươi là nguồn nguyên liệu để sản xuất sắn lát, tinh bột. Phế phẩm từ quá trình sản xuất tinh bột được con người tận dụng để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, không những rẻ, tiện lợi mà đem lại hiệu quả cao (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Đường Hồng Dật, 2006). 4 Hình 1.1: Sơ đồ khái quát vai trò của cây sắn Sắn là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước. Tinh bột sắn là nguyên liệu chính trong ngành công nghiệp sản xuất cồn. Trong ngành công nghiệp thực phẩm tinh bột để sản xuất mỳ ăn liền, bún, miến, mỳ chính, hạt tapioca. Trong ngành phụ gia thực phẩm, dược phẩm tinh bột đóng vai trò chất độn, chất gắn kết, ổn định và làm đặc dung dịch. Trong ngành dệt tinh bột hạn chế đứt chỉ và chẻ chỉ trên khung cửi. Trong ngành công nghiệp sản xuất giấy tinh bột tăng độ bền, chịu gấp, chống thấm cho giấy, cải thiện cảm quan cho giấy. Ngoài ra, tinh bột dùng như chất kết dính ứng dụng rất nhiều trong cuộc sống hàng ngày. Tóm lại, sắn ngày nay ngoài là cây lương thực truyền thống của con người, cung cấp thức ăn dồi dào cho vật nuôi, còn là cây công nghiệp cung ứng nguyên vật liệu cho các ngành công nghiệp chế biến khác nhau (Đường Hồng Dật, 2013). 5 1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn Việt Nam Ở Việt Nam, sản xuất sắn là nguồn thu nhập quan trọng của nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ. Sắn hiện trồng 40 tỉnh thành trên cả nước. Diện tích, sản lượng sắn Việt Nam trong hơn 16 năm qua (2000 – 2016) có chiều hướng gia tăng nhanh. Đặc biệt, trong những năm đầu thế kỷ 21 giai đoạn (2001–2008). Năm 2008, diện tích sắn là 554 nghìn ha, năng suất củ bình quân đạt 930,99 vạn tấn so với năm 2000, sản lượng sắn Việt Nam tăng gấp 2,33 lần, năng suất tăng 4,68 lần. Thời điểm năm 2016, diện tích sắn cả nước đạt khoảng 569,90 nghìn ha, năng suất đạt 1093,18 vạn tấn tăng gấp 5,5 lần so với thời kỳ năm 2000 (Hình 2). Trong đó các tỉnh có diện tích sắn lớn nhất gồm có: Gia Lai 64,80 nghìn ha, Tây Ninh 61,8 nghìn ha, Kon Tum 39,3 nghìn ha, Đắk Lắk 35,9 nghìn ha, Sơn La 32,8 nghìn ha, Bình Thuận 31,2 nghìn ha. Tốc độ tăng diện tích các vùng khác nhau. Diện tích sắn tăng mạnh nhất là vùng Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Năm 2012, diện tích tại hai vùng này chiếm 58,9% diện tích sắn cả nước. Năm 2012, diện tích sắn các tỉnh Tây Nguyên đạt gần 150 000 ha tăng 3,95 lần so với năm 2000. Tính bình quân tại Tây Nguyên sau chu kỳ 5 năm diện tích sắn lại tăng gấp đôi. Tại vùng Đông Nam Bộ, diện tích trồng sắn năm 2000 là 24 000 ha, năm 2005 đạt 100 000 ha, năm 2010 đạt 82 000 ha, Năm 2016 đạt 99 000 ha. Diện tích tăng nhanh giai đoạn 2000 – 2005, giảm trong giai đoạn 2006–2012, tăng nhẹ giai đoạn 2013–2016. Vùng Bắc Trung Bộ và Duyên Hải Miền Trung cũng là vùng có diện tích tăng nhanh. Năm 2016, diện tích vùng này là 67 000 ha, chiếm 11,82% so với diện tích trồn sắn cả nước (TCTK, 2017). Trong những năm vừa qua, năng suất và sản lượng sắn Việt Nam liên tục tăng. Việc tăng năng suất, sản lượng do mở rộng diện tích và áp dụng giống sắn lai. Sản lượng năm 2000 đạt 8,4 tấn/ha, năm 2012 đạt 17,7 tấn/ha. Năm 2016 đạt bình quân 19,2 tấn/ha. Năng suất sắn liên tục tăng trong năm gần đây. Năm 2012, cả nước đạt 973,52 vạn tấn, tăng từ 198,63 vạn tấn năm 2000, 671,62 vạn tấn năm 6 2005. Giai đoạn 2008-2010 sản lượng giảm do thị trường sắn khủng hoảng. Năm 2013, sản lượng đạt 973,75 vạn tấn. Năm 2016, sản lượng đạt 1093,18 vạn tấn. Hình 1.2: Biểu đồ diện tích và sản lượng sắn Việt Nam giai đoạn 2010 – 2016 (TCTK, 2017) Năm 2014, sắn tươi nội địa Việt Nam lên tới 10,36 triệu tấn. Khoảng 0,5 triệu tấn được sử dụng cho nhu cầu hộ gia đình như làm lương thực, nấu rượu, làm thức ăn chăn nuôi. Ngoài nguồn cung củ tươi nội địa hàng năm còn phải nhập thêm khoảng hơn 1 triệu tấn củ tươi chủ yếu từ Campuchia và Lào. Khoảng 7,73 triệu tấn củ tươi có nguồn gốc trong nước và nhập khẩu được đưa vào sản xuất tinh bột. Tinh bột được sử dụng nội địa (khoảng 1,98 triệu tấn), xuất khẩu (khoảng 5,74 triệu tấn) (Tô Xuân Phúc, 2015). Việt Nam xuất khẩu cả sắn lát và tinh bột sắn. Năm 2014, lượng sắn lát xuất khẩu tương ứng 3.34 tấn củ tươi, lượng tinh bột xuất khẩu tương đương 5,74 tấn củ tươi. Trung Quốc là thị trường quan trọng nhất của Việt Nam. Mỗi năm Việt Nam xuất khẩu khoảng 1,4-1,5 triệu tấn tinh bột sắn chủ yếu vào thị trường Trung Quốc. Năm 2014, kim ngạch các sản phẩm sắn xuất khẩu ở Việt Nam đạt được từ thị 7 trường này chiếm 85%, tiếp đến là Đài Loan 4,6%, Philippines 3,8%, Malaysia 3,5%, Indonesia 1,6%. Giai đoạn từ 2010-2016, tình hình xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn có nhiều biến động. Năm 2012 đạt 1,35 tỉ USD tăng 2,41 lần so với năm 2010. Năm 2016, sắn và các sản phẩm từ sắn xuất khẩu đạt 1 tỷ USD (TCHQ, 2017). 1.3. Đặc hình hình thái học, đặc điểm di truyền của sắn 1.3.1. Đặc hình hình thái học Lá sắn là lá đơn chia thùy mọc xen kẽ trên thân. Cuống lá dài từ 3 đến 30cm và có các màu màu hồng, vàng, xanh vàng, đỏ tươi tùy theo giống. Phiến lá thường có 5-7 thùy, nhưng cũng có khi không chia thùy. Phiến lá mảnh, dạng màng, màu xanh lục, phía dưới có phấn. Phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng mô hồng và biểu bì. Phía dưới phiến lá có những tế nào nhô ra làm cho mặt lá dưới của mượt như nhung. Thân cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao trung bình từ 1-3m. Chiều cao cây phụ thuộc vào giống và điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Mặt cắt ngang thân gồm có 4 lớp: trong cùng là lõi rất xốp, tế bào rất to; tiếp theo là tầng gỗ; mô mềm của vỏ; tầng bần rất mỏng thân sắn có khả năng phân cành. Rễ sắn gồm có con và rễ củ. Rễ con mọc ra từ hom làm nhiệm vụ đồng hóa chủ yếu tập trung phần đất nông 0-30cm. Nhiệm vụ chính là hút nước, dinh dưỡng và giữ cho cây vững chắc. Rễ củ do rễ con được tập trung dinh dưỡng phình to mà thành. Củ có dạng hình trụ hoặc hình thoi. Củ có thể dài trung bình dài 30-60cm, đường kính củ trung bình: 3-7cm. Phần vỏ củ có màu nâu, nâu sẫm, hơi trắng dày khoảng 0,2-0,6 cm chiếm 0,5-3% khối lượng của củ và được cấu tạo bởi cellulose. Mặc dù nó rất mỏng nhưng rất cứng. Lớp vỏ có nhiệm vụ bảo vệ tránh tác động của các yếu tố gây tổn thương làm hư hại củ. Phần vỏ thịt nằm bên trong lớp vỏ gỗ, có màu hồng, trắng đục, trắng vàng tùy theo giống. Vỏ thịt dày khoảng 0,5- 0,6cm, chiếm tới 5-20% khối lượng củ và rất dễ bị tách khỏi lớp thịt củ. Phần vỏ thịt có chứa xenllulose, tinh bột. 8 Hình 1.3: Hình ảnh các bộ phận của cây sắn (https://dongythienluong.com/san/) Đặc biệt lớp này là nơi tập trung nhiều glucoside khi thủy phân giải phóng ra HCN gây ngộ độc cho người và gia súc. Phần thịt củ (mô dự trữ) là phần quan trọng nhất của củ sắn chiếm 90% khối lượng bột của của sắn. Ngoài ra còn có một ít sợi (tế bào gỗ) và một lượng nhỏ protein, lipit, vitamin, chất khoáng. Lõi sắn (mạch gỗ và gỗ) thường nằm ở giữa củ sắn và chạy suốt từ đầu củ đến cuối củ. Lõi sắn chiếm khoảng 0,5% khối lượng củ sắn. Thành phần chủ yếu của nó là cellulose. Hoa sắn thuộc loại hoa chum, là hoa đơn tính cùng gốc. Một số giống sắn không có hoa do không có quá trình phân hóa hoa hoặc do những mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ cành thấp nhất thường rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục giữa và nhiều trục bên hợp thành một kiểu cụm hoa gọi là chùy. Hoa cái có 5 lá đài dài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Có một bầu thường có 6 cánh. Trên bầu có vòi nhụy ngắn với 3 đầu nhụy uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên 9 một nửa chiều dài, nhẵn ở phía trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8-10 nhị đực xếp thành 2 vòng và mọc lên từ các thùy của một đĩa phía dưới. Bao phấn mềm, hạt phấn có 3 ngăn, dày dính, màng hạt phấn có gai nhỏ. Số lượng hoa trên cây thay đổi tùy từng giống, thường hoa đực nhiều hơn hoa cái. Trên cùng một cụm hoa, hoa cái thường nở trước hoa đực 5-7 ngày. Do đó những hoa cái nở cuối cùng sẽ nở cùng ngày với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa đực thường nở vào giữa trưa. Vào nửa cuối buổi chiều tất cả các hoa cái đều khép lại. Quả sắn thuộc loại quả nang mở khi chín đường kính quả 1-1,5cm, quả có 3 ô, mỗi ô thường có một hạt. Màu sắc từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả. Chỗ phình có khi cũng có màu sắc khác với màu sắc quả. Sau khi chín, quả tự mở và chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt. 1.3.2 Đặc điểm di truyền của sắn Sắn được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới và thuần hóa từ loài tổ tiên M. esculenta ssp. flabellifolia. Ngoài việc sắn được sử dụng như một nguồn thực phẩm, nó còn có vai trò quan trọng trong ngành thương mại tinh bột và các sản phẩm có nguồn từ tinh bột. Sắn được nhân giống thực vật và khó sinh sản. Nó có khả năng chịu được các điều kiện môi trường và thổ nhưỡng không thuận lợi như hạn hán trong thời gian dài bằng cách giảm tán lá mất nước do thoát hơi nước. Nhận thấy tầm quan trọng đó, CIAT đã tham gia vào nghiên cứu sắn từ giữa những năm 1970 tạo ra các bản đồ di truyền mật độ cao. Các nhà khoa học đã áp dụng thành công kỹ thuật SSR (Simple sequence Repeat), EST (expressed sequence tag) và SNP (Single Nucleotide Polymorphism) trên cở sở bản đồ di truyền để nghiên cứu bộ gen của cây sắn. Nhờ kết quả này, người ta có được một bản đồ liên kết với mức độ phân giải cao. Phương pháp mới có tên gọi là GBS (genotyping-by-sequencing) đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự gen đã và đang được phát triển nhằm liệt kê SNPs giữa các quần thể, lập bản đồ di truyền với các giống sắn của Châu Phi. Những nguồn kết quả như vậy cho phép chúng ta cải tiến 10 tính chống chịu bệnh và cải tiến hàm lượng dinh dưỡng trong sắn, cũng như hiểu toàn diện về cơ sở di truyền của tính kháng bệnh trên sắn. Đồng thời, số lượng lớn các EST đã được tạo ra từ tìm hiểu hệ gen sắn với mục đích nghiên cứu tính đa dạng di truyền, khả năng chống stress sinh học và phi sinh học cải thiện hàm lượng tinh bột được tích lũy trong củ. Sắn là cây đa bội thể dị hợp có bộ nhiễm sắc thể 2n=36. Để hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của sắn trên toàn thế giới các nhà khoa học đã tiến hành giải trình tự của tập đoàn giống sắn với 58 mẫu giống sắn bao gồm giống trồng trọt và mẫu hoang dại có liên quan gần với giống trồng ví dụ nhự mẫu M. glaziovii với 268 mẫu giống sắn trồng của Châu Phi cho thấy rằng hệ gen sắn ngày nay là kết quả kết hợp của hai genome cổ để nó trở thành dạng tứ bội cổ “paleotetraploidy” (Hình 1.4). Cây cao su (Hevea) và sắn là hai loài có sự tương đồng cao về trình tự DNA, có nguồn gốc từ tổ tiên chung tách ra khoảng 10 triệu năm trước đây. Đó là nguồn cơ sở dữ liệu mang tính chất so sánh rất tốt. Dự án giải trình từ cho thấy kết quả tiến hóa thú vị giữa hai loài và các giống sắn trong cùng tập đoàn sắn từ nhiều nơi trên thế giới. Kết quả của những nghiên cứu này là cơ sở khoa học để đánh giá đa dạng di truyền về tính trạng chọn lọc của các quần thể trong tập đoàn lưu trữ nguồn gen sắn (Bredeson et al, 2016). 11