Tài liệu Xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng hptlc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VINH DŨNG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VINH DŨNG Mã sinh viên :1301077 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà 2. NCS. ThS. Đào Thị Cẩm Minh Nơi Thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất 2. Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Để khóa luận tốt nghiệp dược sĩ được hoàn thành một cách thuận lợi nhất, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình và động viên của các quý Thầy, Cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên, bạn bè và gia đình. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS.Phạm Thị Thanh Hà NCS.ThS. Đào Thị Cẩm Minh là những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi và động viên tôi những lúc khó khăn nhất. Bên cạnh đó cũng cho tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh , Dược sĩ Thái Khoa Bảo Châu, Dược sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền đã luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể quý giảng viên, kĩ thuật viên bộ môn Hóa phân tích- Độc chất đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn. Xin cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, toàn thể các quý Thầy Cô đặc biệt quý Thầy Cô bộ môn Hóa phân tích-Độc chất đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường để có thể vận dụng tốt nhất vào khóa luận của mình. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 17, tháng 5, năm 2018 Nguyễn Vinh Dũng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1. Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược ..............................................................................................................................3 1.1.1. Trên thế giới ....................................................................................................3 1.1.2. Tại Việt Nam ..................................................................................................4 1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .....................................................................5 1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý của các thuốc giảm đau,chống viêm .....................5 1.2.2. Cơ chế tác dụng, tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc giảm đau, chống viêm . .............................................................................................7 1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích ...................................................................9 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..................................................................................9 1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(HPTLC) .................................................10 1.4. Một số nghiên cứu về nhóm thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược.......................................................................................13 1.4.1. Trên thế giới ................................................................................................13 1.4.2. Tại Việt Nam ...............................................................................................15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................17 1.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ..............................................17 1.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu .......................................................17 1.1.2. Thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu ..........................................................18 1.1.3. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................18 1.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................19 1.2.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .......................................................................19 1.2.2. Khảo sát dung môi pha động ........................................................................19 1.2.3. Thẩm định phương pháp ...............................................................................20 1.2.4. Sơ bộ khảo sát các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường ......21 1.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..................................................................23 3.1. Khảo sát dung môi pha động ...............................................................................23 3.2. Khảo sát dung môi chiết và loại tạp ....................................................................25 3.2.1. Khảo sát dung môi loại tạp ...........................................................................26 3.2.2. Khảo sát dung môi chiết ...............................................................................27 3.3. Thẩm định phương pháp .....................................................................................30 3.3.1. Tính chọn lọc. ...............................................................................................30 3.3.2. Tính thích hợp hệ thống. ...............................................................................31 3.3.3. Khoảng tuyến tính.........................................................................................32 3.3.4. Độ đúng, độ chính xác. .................................................................................33 3.3.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .......................................................36 3.4. Sơ bộ khảo sát các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường .............38 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................................48 4.1. Về phương pháp xử lý mẫu .................................................................................48 4.2. Về lựa chọn phương pháp phân tích ...................................................................49 4.3. Về thẩm định phương pháp .................................................................................50 4.4. Sơ bộ khảo sát các chế phẩm đông dược thu thập trên thị trường ......................50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................55 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống(Association of Official Analytical Chemists) COX Cyclooxygenase HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer chromatography) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) INDO Indomethacin IBU Ibuprofen KETO Ketoprofen LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) LC Liquid chromatography MS Khối phổ (Mass spectrometry) MS/MS Khối phổ hai lần (tandem mass spectrometry) M Sắc ký lỏng (Phân tử khối) NSAID Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drug) PTHQ Phương trình hồi quy PARA Paracetamol PIRO Piroxicam PDE-5 Phosphodiesterase-5 S/N Tín hiệu/nhiễu(signal-to-noise) Spic Diện tích pic QT Quy trình TOF Thời gian bay(Time of flight) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) UV Cực tím (Ultra violet) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của paracetamol .................................................................5 Hình 1. 2. Cấu trúc hóa học của piroxicam ....................................................................6 Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của indomethacin ...............................................................6 Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của ketoprofen ...................................................................6 Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của ibuprofen .....................................................................7 Hình 1. 6. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ................................................12 Hình 3. 1. Kết quả khảo sát 4 hệ dung môi pha động ...................................................23 Hình 3. 2. Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động n-hexan: ethyl acetat: acid acetic (6:2,5:1,5) ......................................................................................................................24 Hình 3. 3. Kết quả quét phổ UV vủa 5 chất phân tích ..................................................25 Hình 3. 4. Kết quả khảo sát dung môi loại tạp trên 3 nền ............................................27 Hình 3. 5. Kết quả khảo sát dung môi chiết trên nền viên nang ...................................29 Hình 3. 6. Quy trình xử lý mẫu .....................................................................................29 Hình 3. 7. Sắc ký đồ thể hiện độ chọn lọc của 5 chất phân tích trên 3 nền mẫu ..........30 Hình 3. 8. Sắc ký đồ analog thể hiện độ chọn lọc của 5 chất phân tích trên 3 nền mẫu .......................................................................................................................................31 Hình 3. 9. Sắc ký đồ xác định LOD trên nền nén của 5 chất phân tích ........................37 Hình 3. 10. Biểu đồ số lượng mẫu ở mỗi dạng bào chế của các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường .........................................................................................38 Hình 3. 11. Biểu đồ nơi thu mẫu và số lượng mẫu có và không có số đăng ký ...........39 Hình 3. 12. Biểu đồ địa điểm thu mẫu ..........................................................................39 Hình 3. 13. Sắc ký đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường ..........42 Hình 3. 14. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính Paracetamol ......................................43 Hình 3. 15. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính Paracetamol ......................................43 Hình 3. 16. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính indomethacin ....................................44 Hình 3. 17. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính giả Paracetamol ................................44 Hình 3. 18. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính giả Indomethacin ..............................45 Hình 3. 19. Biểu đồ số mẫu dương tính được kết luận qua hai phương pháp TLC và HPTLC...........................................................................................................................45 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. So sánh giữa HPTLC và TLC .....................................................................11 Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau, chống viêm trên thế giới ....14 Bảng 1. 3. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau chống viêm tại Việt Nam ....15 Bảng 2. 1. Chất chuẩn - hóa chất dùng trong nghiên cứu .............................................17 Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát dung môi loại tạp .............................................................26 Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát dung môi chiết .................................................................28 Bảng 3. 3. Kết quả đánh giá tính thích hợp trên hệ thống HPTLC ...............................32 Bảng 3. 4. Kết quả khoảng tuyến tính của 5 chất phân tích ..........................................33 Bảng 3. 5. Kết quả đánh giá độ đúng, độ chính xác của 5 chất phân tích ....................34 Bảng 3. 6. Kết quả phân tích LOD, LOQ trên 3 nền mẫu của 5 chất phân tích ...........38 Bảng 3. 7. Kết quả định lượng mẫu dương tính paracetamol và indomethacin ...........46 ĐẶT VẤN ĐỀ Sản phẩm chăm sóc sức khỏe bằng thảo dược, thuốc có nguồn gốc Đông dược đang được sử dụng trên toàn thế giới như là lựa chọn thay thế hiệu quả và tương đối an toàn cho các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược. Theo tổ chức y tế thế giới có đến 80% dân số ở các nước đang phát triển đang sử dụng các sản phẩm này cho việc chăm sóc sức khỏe của họ và doanh thu của các sản phẩm này tại thị trường châu Âu năm 2003 là 5 tỷ đô la Mỹ [trong đó tiêu thụ nhiều nhất là Đức (39%) và Pháp (21%)] [26]. Tuy nhiên, các sản phẩm này không được quy định nghiêm ngặt như các loại thuốc hiện đại, do đó không có sự kiểm soát có hệ thống về chất lượng của chúng. Trong nhiều các trường hợp chúng được bán bởi các cơ sở thuốc Đông y gia truyền để điều trị các bệnh mãn tính. Để chứng minh rằng sản phẩm của họ hiệu quả, một số cơ sở đã cố tình trộn trái phép thuốc tổng hợp hóa dược cho sản phẩm của mình. Việc này có thể gây ra nguy cơ nghiêm trọng cần được quan tâm khi sử dụng thuốc trong một thời gian dài [38] . Trong một nghiên cứu tại Đài Loan tiến hành trên 2609 mẫu thuốc đông dược, có tới 23,7% trong số đó phát hiện trộn thuốc hóa dược hay một nghiên cứu khác trên 3320 mẫu thuốc có nguồn gốc thảo dược ở Singapore thì 1,2% trong số đó phát hiện trộn trái phép thuốc hóa dược[28],[42],[39]. Các loại thuốc được sử dụng để pha trộn bao gồm: (1) Các thuốc giảm đau và chống viêm nhóm steroids và không steroids (NSAIDs) để điều trị viêm khớp dạng thấp, dị ứng và hen suyễn: (2) Các chất ức chế PDE-5 điều trị rối loạn chức năng tình dục; (3) sibutramin để điều trị chứng béo phì và (4) các thuốc điểu trị đái tháo đường nhóm sulfonylure (clorpropamid, tolbutamid, glibenclamid) [38]. Trong đó, nhóm thuốc giảm đau chống viêm được phát hiện nhiều nhất [38],[34]. Việc sử dụng lâu dài các chế phẩm đông dược có trộn lẫn thuốc nhóm giảm đau chống viêm được trộn với liều cao có thể gây ra những tác dụng không mong muốn và biến chứng rất nguy hiểm như: Loét dạ dày, xuất huyết tiêu hóa, suy thượng thận, suy gan, co thắt phế quản, giảm đời sống hồng cầu,…[38],[2], [3]. Với thực tế trên, việc phát hiện và xử lý kịp thời những trường hợp trộn trái phép thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược là hết sức cấp bách hiện nay để đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược như phát hiện một số corticoid bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng [10], sắc ký lỏng hiệu năng 1 cao [15] hay kĩ thuật khối phổ [14] và gần đây là xác định một số thuốc giảm đau, chống viêm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [12]. Gần đây, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tại trường Đại học Dược Hà Nội đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất paracetamol, piroxicam, indomethacin và natri diclofenac trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC với hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat: acid acetic (6: 2,5: 1,5) ; đã ứng dụng trên 29 mẫu chế phầm đông dược thu thập trên thị trường và phát hiện được một mẫu có trộn paracetamol với hàm lượng 37,64 mg/liều [12]. Tiếp nối nghiên cứu trên, nhằm nghiên cứu và thẩm định thêm 2 chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm là ketoprofen và ibuprofen có thể được trộn trái phép trong chế phẩm đông dược và mở rộng ứng dụng phát hiện trên số lượng lớn các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC”. Với mục tiêu: 1. Đánh giá phương pháp xác định đồng thời paracetamol,piroxicam, indomethacin, ketoprofen và ibuprofen trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC. 2. Sơ bộ khảo sát tình hình trộn lẫn không khai báo paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen và ibuprofen trong chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường bằng phương pháp HPTLC. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông dược 1.1.1. Trên thế giới Trên thế giới hiện nay, vấn đề trộn trái phép thuốc tân dược trong chế phẩm đông dược đang diễn ra rất phổ biến ở nhiều nước. Các nhóm thuốc tân dược hay được phát hiện trộn vào các chế phẩm đông dược là nhóm hạ nhiệt, giảm đau chống viêm steroid và non-steroid, nhóm ức chế enzym phosphodiesterase-5, nhóm giảm béo phì, nhóm điều trị tăng huyết áp và nhóm thuốc tiểu đường [24],[36],[37]. Nhóm thuốc được phát hiện trộn trái phép nhiều nhất vẫn là các nhóm thuốc giảm đau và chống viêm steroid và non-steroid [38],[34]. Đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành trong thời gian qua ở các nước trên thế giới đã phát hiện một số chất trộn trái phép như: Ở Indonesia, trong một chế phẩm bột dược liệu với chỉ định giảm đau, chống viêm có tên Jamu Ragel được phát hiện trộn lẫn dipyron, phenylbutazon và oxyphenbutazon được phát hiện bằng LC-ESIMS/MS bởi M. J. Bogusz và cộng sự [22],[30]; một sản phẩm thực phẩm chức năng ở Trung Quốc được phát hiện có trộn lẫn ibuprofen bằng LC-MS/MS bởi Q.Liang [31] hay một loạt các sản phẩm viên nang và nén tại các chợ thuốc ở Ấn Độ được phát hiện trộn lẫn dexamethason, diclofenac, piroxicam và betamethason bằng LC-MS/MS và LC-MS/TOF [38],[21]. Đặc biệt, một nghiên cứu ở Anh bằng phương pháp HPLC đã phát hiện rất nhiều chất thuộc nhóm glucocorticoid là hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, clobetason propionat được trộn chỉ trong một chế phẩm dạng kem được công bố là có nguồn gốc thảo dược [35]. Tại Hàn Quốc, nghiên cứu của So-Hyun Cho và cộng sự đã khảo sát khoảng 300 chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp trên thị trường từ năm 2010 đến năm 2013, kết quả cho thấy có 30% mẫu khảo sát phát hiện có trộn các chất giảm đau chống viêm như: betamethason, prednisolon, cortison, prednison, dexamethason [25]. Tại Singapore, Aik-Jiang Lau và cộng sự đã phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS [30]. Cũng tại Hàn Quốc, Hyung Joo Kim và cộng sự đã tiến hành kiểm tra trên 214 mẫu bao gồm 126 mẫu thực phẩm và 88 mẫu thực phẩm chức năng từ năm 2010-2012 bằng LC-MS/MS [29]. Kết quả phát hiện 53 mẫu dương tính với 6 chất có tỉ lệ lần lượt như 3 sau: ibuprofen,33%; diclofenac,19%; naproxen,16%; piroxicam ,15%; acetaminophen, 14% và indomethacin, 3%; Trong đó sản phẩm hoàn và viên nang chiếm khoảng 70%. Một số nước Đông Nam Á như Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây dựng phương pháp để phát hiện các thuốc hóa dược giảm đau chống viêm trộn vào chế phẩm đông dược. Tại Thái Lan, Chutima Limmatvapirat và cộng sự đã dùng phương pháp TLC phát hiện 2 chất thuộc nhóm glucocorticoid trộn trong chế phẩm đông dược là dexamethason và prednisolon từ năm 2007 đến năm 2011 lần lượt là 28,57%; 10,39%; 3,33%; 4,41% và 6,95% [32]. 1.1.2. Tại Việt Nam Tại Việt Nam, từ lâu nhiều người đã tin dùng những sản phẩm có nguồn gốc thảo dược do niềm tin vào tính an toàn của các sản phẩm này và thời gian gần đây nhu cầu này càng tăng cao. Mặt khác, Việt Nam chúng ta cũng có nguồn tài nguyên cây thuốc Nam dồi dào nên các sản phẩm đông dược cũng rất nhiều và đa dạng. Tuy nhiên, nhiều sản phẩm được bán tràn lan trên mạng và tại các chợ thuốc mà chất lượng của chúng lại không được kiểm soát chặt chẽ nên có nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng nếu các sản phẩm này được trộn trái phép các thuốc hóa dược. Bằng chứng là một số sản phẩm đã bị phát hiện trên thị trường như: - Nang mềm Tăng phì hoàn(Ceng Fui Yen) do Công ty TNHH Dược phẩm WELIP – Malaysia sản xuất, Công ty CP Dược liệu TW 2 nhập khẩu, trộn dexamethason và cyproheptadin - Cơ sở thuốc gia truyền lương y Dương Ngô Hiếu (Địa chỉ: Đồng Ngô, Ngọc Vân, Tân Yên, Bắc Giang) sản xuất 2 thuốc chưa được cấp phép lưu hành: Thuốc KQ 3 Thận khí hoàn chữa đái tháo đường trộn glibenclamid và GB Giải biểu hoàn trộn paracetamol. - Viên nang Mãnh Nam do Công ty TNHH Dược phẩm Ngọc Khánh (Địa chỉ: Xã Nam Hồng, Đông Anh, Hà Nội) sản xuất có chứa acetylsildenafil; Viên nang Bổ Thận Hà Thành do Công ty TNHH Hà Thành sản xuất có chứa sildenafil,...[11]. - Thuốc Bổ tỳ của hiệu thuốc Bắc Đông Y gia truyền tư nhân Phước Lợi Đường: Địa chỉ: Quốc lộ 1, đối diện chợ Miếu Bông, Đà Nẵng bị phát hiện trộn dexamethasone [19]. 4 - Thuốc khu phong, truy phong tê thấp thủy được phát hiện trộn betamethasone hay mẫu chế phẩm điều trị gout trộn paracetamol, indomethacin và dexamethasone acetat đều của cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền Hinh Hòa [18]. Như vậy có thể thấy tại Việt Nam cũng có rất nhiều sản phẩm thuốc đông dược bị phát hiện trộn trái phép thuốc có nguồn hóa dược và chủ yếu là các sản phẩm không có số đăng ký. Từ thực trạng đáng báo động của việc trộn trái phép thuốc hóa dược vào chế phẩm đông dược hiện nay nếu dùng lâu dài sẽ gây ra những tác dụng phụ rất nghiêm trọng cho người sử dụng. Do đó đề tài được thực hiện nhằm phát hiện một số thuốc hóa dược thuộc nhóm giảm đau chống viêm có thể trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường. 1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý của các thuốc giảm đau,chống viêm 1.2.1.1. Paracetamol - Công thức hóa học: C8H9NO2 (M= 151,2) Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của paracetamol - Tên khoa học: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid - Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Hơi tan trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, rất khó tan trong chloroform, ether, dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96%,methyl clorid[8],[4]. - Liều dùng: 325-650 mg, cứ 4-6 giờ dùng một lần, không quá 4 g một ngày [3]. 1.2.1.2. Piroxicam - Công thức hóa học: C15H13N3O4S (M=331,4) 5 Hình 1. 2. Cấu trúc hóa học của piroxicam - Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N–(pyridin-2–yl)-2H-1,2-benzothiazin-3carboxamid 1,1-dioxyd - Tính chất: Bột kết tinh đa hình, màu trắng hay ngà vàng. Thực tế không tan trong nước, tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol khan [4],[8]. - Liều dùng: 20 – 40 mg/ ngày [3]. 1.2.1.3. Indomethacin - Công thức hóa học : C19H16ClNO4 ( M=357,8) Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của indomethacin - Tên khoa học: acid 1 - (4 - clorobenzoyl) - 5 - methoxy - 2 - methylindol - 3 - yl acetic - Tính chất: Bột kết tinh trắng đến vàng, không mùi hay hầu như không mùi.Thực tế không tan trong nước, tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol 96% [4],[8]. - Liều dùng: 25 mg/lần, uống 2–3 lần/ngày, tối đa 150–200mg/ngày [3]. 1.2.1.4. Ketoprofen - Công thức hóa học: C16H14O3( M=254,3) Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của ketoprofen - Tên khoa học : acid (2RS)-2-(3-benzoylphenyl)propanoic - Tính chất : Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, thực tế không tan trong nước, rất tan trong aceton, ethanol 96% và methylen clorid [4],[8]. 6 - Liều dùng : 50 mg, dùng 3 lần/ngày, có thể tăng liều tới 100 mg, dùng 2–3 lần/ngày [3]. 1.2.1.5. Ibuprofen - Công thức hóa học : C13H18O2 (M=206,3) Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của ibuprofen - Tên khoa học : acid (RS) - 2 - (4 - isobutylphenyl) propionic - Tính chất : Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hay tinh thể không màu. Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, và methanol và methyl clorid . Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng và carbonat kiềm [4],[8]. - Liều dùng : 400-600 mg/ lần, có thể dùng 3-4 lần/ngày, tối đa 2,4g/ ngày [3]. 1.2.2. Cơ chế tác dụng, tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc giảm đau, chống viêm . 1.2.2.1. Cơ chế tác dụng và tác dụng Các NSAID ức chế COX qua đó ức chế tổng hợp prostaglandin và thromboxan. Có hai dạng COX: COX-1 cần thiết để tổng hợp prostaglandin bảo vệ niêm mạc dạ dày và thromboxan cần thiết cho tiểu cầu kết dính, COX-2 tham gia tạo ra prostaglandin khi có viêm. Các thuốc chống viêm ức chế không chọn lọc cả hai loại COX-1và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam, diclofenac, ketoprofen. Sự khác nhau giữa các NSAID chủ yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn. Các thuốc có tính chọn lọc ít gây các tác dụng phụ, trong khi có tác dụng chống viêm, giảm đau giống như các thuốc không chọn lọc. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở thận giống như các thuốc không chọn lọc. Ngoài ra, các thuốc ức chế chọn lọc không có tác dụng ức chế tiểu cầu kết dính, còn các thuốc ức chế không chọn lọc có tác dụng ức chế kết dính tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid acetylsalicylic. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 không 7 cải thiện tiến triển dài hạn của bệnh viêm khớp dạng thấp về phương diện biến đổi cấu trúc của bệnh khi so sánh với các thuốc NSAID thông thường [3]. Các thuốc chống viêm không steroid (NSAID) đều có tác dụng chống viêm tốt nên được dùng trong các bệnh viêm khớp mạn (viêm khớp dạng thấp) nhưng thuốc không làm thay đổi được quá trình diễn biến của bệnh.Paracetamol có tác dụng giảm đau và ít có tác dụng chống viêm nên không dùng để điều trị lâu dài các bệnh có viêm gây đau. Tuy vậy, paracetamol có thể dùng để điều trị đau do thoái hóa khớp, một bệnh ít viêm. Paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase (COX) toàn thân, chỉ tác động đến COX của hệ thần kinh trung ương [3]. 1.2.2.2. Tác dụng không mong muốn Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin : Trên hệ tiêu hóa: Thuốc NSAID với mức độ khác nhau ức chế COX làm giảm tổng hợp prostaglandin, tạo điều kiện cho acid hydrocloric và pepsin của dịch vị gây tổn thương cho niêm mạc khi hàng rào bảo vệ bị suy yếu có thể dẫn đến viêm thực quản, loét dạ dày tá tràng, chảy máu đường tiêu hoá tiềm tàng. Bên cạnh đó các NSAID hầu hết có bản chất acid nên trực tiếp phá hủy các tế bào biểu mô đường tiêu hóa gây loét, chảy máu và có thể gây thủng ổ loét. Trên hệ huyết học: Hội chứng xuất huyết, làm kéo dài thời gian chảy máu, có thể gây ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu. Trên hệ tiết niệu : Làm giảm lưu lượng máu nuôi thận, giảm mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, hoại tử nhú thận, suy thận cấp và tăng kali máu. Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, làm tăng thời gian mang thai ở 3 tháng cuối, và có thể ảnh hưởng đến tuần hoàn và hô hấp của thai nhi. Ức chế co bóp tử cung, do đố gây trì hoãn sự chuyển dạ, tăng nguy cơ chảy máu ở cả mẹ và thai nhi. Các tác dụng phụ khác: Tăng huyết áp, phù. Khi dùng liều cao, kéo dài, gây ù tai, chóng mặt, giảm đời sống hồng cầu Ngoài ra thuốc có thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien). Thuốc còn có thể gây rối loạn chức năng gan, rối loạn về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào 8 (mất bạch cầu hạt), thậm chí có thể gây suy tủy. Trên hệ tim mạch: Các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc NSAID truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim Đối với paracetamol: Paracetamol là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin. Ở liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng acid–base, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như khi dùng salicylate. Paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase (COX) toàn thân, chỉ tác động đến COX của hệ thần kinh trung ương. Tuy nhiên khi dùng quá liều paracetamol có thể gặp phản ứng dị ứng như ban đỏ hoặc mày đay, trầm trọng hơn là phản ứng độc với gan do chính chất chuyển hóa của paracetamol là N-acetylbenzoquinonimin gây ra [3]. 1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật đã được phát triển từ lâu, cho phép tách được hỗn hợp nhiều cấu tử với lượng phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh (có thể phân tích hàng loạt mẫu). Chính vì vậy mà hiện nay TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ khác nhau. TLC là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [1]. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd. Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2-3 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha. Pha động 9 di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng có vị trí khác nhau trên bản mỏng [1]Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf . Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động[1],[8]. Rf = dR /dM dR :Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm). dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm). Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1. TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát), thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn, phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [1]. 1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(HPTLC) Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một công cụ tiên tiến hơn của sắc ký lớp mỏng (TLC). HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra. Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy scan và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng[27]. Một vài ưu điểm của phương pháp HPTLC so với phương pháp TLC được thể hiện qua bảng 1.1 10 Bảng 1. 1 So sánh giữa HPTLC và TLC [33] Thông số HPTLC TLC Kỹ thuật Tự động/ Bán tự động Thủ công Kích thước hạt pha tĩnh 5 – 6 µm 10 – 12 µm Độ dày lớp hạt pha tĩnh 100 µm 250 µm Hiệu lực tách Cao Thấp hơn Thời gian phân tích Nhanh Chậm hơn Thể tích tiêm mẫu nhỏ nhất 0,1 µl 1,0 µl Pha tĩnh Thường là silica gel và Như nhau trung bình nhôm oxyd, Quét phổ Sử dụng quét phổ Không UV/VIS toàn bộ sắc ký đồ để định tính và định lượng Giới hạn phát hiện 100 – 500 pg 1 – 5 ng Thời gian bão hòa 3-20 phút 20-200 phút Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản mỏng này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm so với khoảng 250µm của bản mỏng TLC) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn ( kích thước hạt nhỏ và đồng đều như hạt pha tĩnh C8 hay C18 của HPLC). Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC [27]. 11