Tài liệu Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn salmonella gây bệnh phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện hiệp hòa, tỉnh bắc giang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN Ở LỢN SAU CAI SỮA NUÔI TẠI HUYỆN HIỆP HÒA, TỈNH BẮC GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN Ở LỢN SAU CAI SỮA NUÔI TẠI HUYỆN HIỆP HÒA, TỈNH BẮC GIANG Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Xuân Bình THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do các nhân tôi trực tiếp thực hiện cùng với các đồng nghiệp tại Bộ môn Vệ sinh- Viện Thú y Quốc gia. Mẫu vật thu thập tại các trang trại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang; các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong Luận văn là trung thực, chính xác, chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác Tôi xin cam đoan mọi thông tin trích dẫn trong Luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ để hoàn thành Luận văn đều đã được cảm ơn. Thái Nguyên, ngày tháng 10 năm 2017 TÁC GIẢ ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập và thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và sự động viên khích lệ của gia đình. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Thầy giáo PGS. TS. Đặng Xuân Bình đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn tới các chủ trang trại trên địa bàn huyện Hiệp Hòa đã tạo điều kiện cho tôi lấy mẫu thực hiện đề tài. Xin trân trọng cảm ơn bộ môn Vệ sinh - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi trong quá trình xét nghiệm mẫu và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đinh, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt Luận văn này. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3 3.1 Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Cơ sở lý luận của đề tài .............................................................................. 4 1.1.1. Vi khuẩn Salmonella ............................................................................... 4 1.1.2. Khả năng xâm nhập của vi khuẩn Salmonella ...................................... 13 1.2. Bệnh Phó thương hàn ở lợn...................................................................... 14 1.2.1. Đặc điểm dịch tễ.................................................................................... 14 1.2.2. Mầm bệnh.............................................................................................. 14 1.2.3. Triệu chứng ........................................................................................... 15 1.2.4. Bệnh tích ............................................................................................... 16 1.3. Biện pháp phòng, trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn............................ 17 1.3.1. Phòng bệnh ............................................................................................ 17 1.3.2. Điều trị bệnh .......................................................................................... 17 1.4. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ............................................................................................................... 18 iv 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 18 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước....................................................... 20 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 23 2.1. Đối tượng, vật liệu.................................................................................... 23 2.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 23 2.1.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu............................................................. 23 2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 23 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 24 2.2.2. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017................... 24 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24 2.3.1. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản và lợn con ................ 24 2.3.2. Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa ................................ 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 24 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................ 24 2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn ........................................................................................................... 25 2.4.3. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella ..................... 25 2.4.4. Phương pháp giám định vi khuẩn Salmonella phân lập được .............. 27 2.4.5. Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR ............................................................... 27 2.4.6. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được ........ 29 2.4.7. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được ......................................................... 30 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 30 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 31 3.1. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản và lợn con ................... 31 3.1.1. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản .................................. 31 v 3.1.2. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ ............... 33 3.1.3. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa .................. 36 3.1.4. Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn con ............................................... 39 3.1.5. Biến động về số lượng vi khuẩn Salmonella thải trừ qua phân ở lợn con sau cai sữa .......................................................................................... 42 3.2. Kết quả xác định bệnh Phó thương hàn ở lợn con ................................... 44 3.2.1. Một số đặc điểm dịch tễ bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa ......... 44 3.2.2. Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy................................................................................................ 46 3.2.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được .................................................................................................. 48 3.2.4. Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được.................................. 49 3.2.5. Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được ................. 50 3.2.6. Xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được .... 52 3.2.7. Xác định tính kháng thuốc với một số loại kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được ......................................................... 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 58 1. Kết luận ....................................................................................................... 58 2. Đề nghị ........................................................................................................ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 62 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI .................................... 70 vi DANH MỤC VIẾT TẮT - : Đến % : Tỷ lệ phần tră m Cs : Cộng sự Nxb : Nhà xuất bản T : Thị trấn Thắng ĐT : Đức Thắng NS : Ngọc Sơn DT : Danh Thắng BL : Bắc Lý ĐL : Đông Lỗ LP : Lương Phong MT : Mai Trung S : Salmonella vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo địa điểm và cá thể .............. 31 Bảng 3.2. Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ ................................. 34 Bảng 3.3. Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa .................................... 37 Bảng 3.4. Thải trừ Salmonella ở lợn con trước và sau cai sữa ................................ 40 Bảng 3.5. Biến động số lượng vi khuẩn Salmonella thải trừ ở lợn con sau cai sữa ....... 43 Bảng 3.6. Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa ............................ 44 Bảng 3.7. Phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị Phó thương hàn ........................................................................................ 46 Bảng 3.8. Đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được ....... 48 Bảng 3.9. Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được .................................... 49 Bảng 3.10. Serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ bệnh phẩm lợn Phó thương hàn ........................................................................................ 50 Bảng 3.11. Tần xuất phát hiện gen mã hóa sản sinh yếu tố gây bệnh Stn, fimA, InvA của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa ................................................................................................ 52 Bảng 3.12. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được ........... 55 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm và phân .................................................................................. 26 Hình 2.2: Chu trình phản ứng PCR đối với Salmonella để tách ADN tổng số ....... 29 Hình 3.1: Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo cá thể............................... 32 Hình 3.2. Tỷ lệ thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ ......................... 35 Hình 3.3. Tỷ lệ Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa........................... 38 Hình 3.4: Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa......................... 45 Hình 3.5. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị Phó thương hàn ............................................................................. 47 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta đã và đang có những bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, đời sống kinh tế xã hội ngày càng được cải thiện. Đóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công đó phải kể đến các thành tựu của ngành nông nghiệp, trong đó có ngành chăn nuôi thú y mà đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD (2006) [40], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam. Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợn gây nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn tuy không xảy ra thành dịch lớn, nhưng với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ đều xuất hiện bệnh này. Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao, vấn đề an toàn thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella là một yêu cầu cấp thiết. Có rất nhiều tác giả đã công bố rằng sự nhiễm Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Arunava Das và cs, 2012 [33]; Cheng-Hsun Chiu và cs, 2004 [37]). Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ làm sự an toàn thịt lợn tăng lên. Mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất là xây dựng các đàn gia súc sạch Salmonella. Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn đã được rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như: Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [18]; Lê Văn Tạo và cs (1993) [23]; Trần Xuân Hạnh (1995) [14]; Cù Hữu Phú và cs (2000) [20]; Đỗ Trung Cứ (2004) [10]... 2 Mặc dù đã được nghiên cứu từ trên 100 năm nhưng đến nay, nhiễm khuẩn Salmonella ở động vật và người vẫn tiếp tục được nghiên cứu vì những vấn đề dịch tễ nghiêm trọng có tính chất toàn cầu, ước tính hằng năm trên thế gới có khoảng 155.000 người chết bởi Salmonellaosis và ngộ độc thực phẩm (Patchanee P. và cs, 2008 [55]; Evangelopoulou G. và cs, 2015 [44]). Có thể nhận thấy, Salmonella nhiễm trên lợn nói chung có liên quan đến hai vấn đề, thứ nhất là tác nhân gây bệnh cho lợn, và thứ hai là gây ngộ độc thực phẩm cho người (Lo Fo Wong, 2002 [53]). Ngoài ra, lợn còn được coi là yếu tố nguồn bệnh, mang trùng và bài xuất mầm bệnh Salmonella có độc lực, tạo nguy cơ cao gây bệnh cho gia súc, gia cầm; gây bệnh và gây ngộ độc thực phẩm cho con người (Patchanee P. và cs, 2008 [55]; Steven A. Carlson và cs, 2012 [61]). Đến tháng 12 năm 2016, huyện Hiệp Hòa, Bắc Giang có 97 trang trại và hơn 220 gia trại chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong đó, có 25 trang trại nuôi lợn nái ngoại sinh sản có quy mô từ 50 con trở lên; có trên 150 gia trại nuôi lợn thịt có quy mô từ 100 con trở lên. Cùng đó, trên địa bàn huyện đã xuất hiện nhiều hộ chăn nuôi gia cầm theo hướng chuyên trứng, thịt, con giống với quy mô hàng nghìn con. Việc nghiên cứu, xác định vi khuẩn Salmonella nhiễm trên lợn nái sinh sản, lợn con sau cai sữa (Lợn khỏe và lợn bị bệnh tiêu chảy) để bổ sung tư liệu khoa học về sự lưu hành của căn bệnh (etiology), từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới về chẩn đoán đề xuất biện pháp khống chế hiệu quả tình trạng mang và thải trừ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho vật nuôi và gây bệnh và gây ngộ độc thực phẩm cho người. Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định serotyp và các đặc tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang". 3 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ về hiện tượng mang trùng, thải trừ mầm bệnh và bệnh Phó thương hàn do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang. - Xác định yếu tố gây bệnh là độc tố do vi khuẩn Salmonella phân lập được. - Xác định đặc tính kháng thuốc của Salmonella phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ bệnh, tình hình mang trùng mầm bệnh và vai trò của vi khuẩn Salmonella trong bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang. - Cung cấp tư liệu khoa học về yếu tố gây bệnh là độc tố do vi khuẩn Salmonella phân lập được sản sinh. - Bổ sung tư liệu khoa học về đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella phân lập được. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả của đề tài có thể được áp dụng vào thực tiễn sản xuất, đồng thời khuyến cáo người chăn nuôi xây dựng kế hoạch phòng, trị bệnh Phó thương hàn do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, hạn chế thiệt hại, góp phần nâng cao năng suất, hiệu quả chăn nuôi. - Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được giúp cho các cơ sở chăn nuôi lợn tham khảo, xây dựng phác đồ điều trị phù hợp bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa; làm giảm tỷ lệ chết, hạn chế lợn còi cọc, giảm tiêu tốn thức ăn và chi phí thuốc thú y, góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở lý luận của đề tài 1.1.1. Vi khuẩn Salmonella 1.1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột). Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori đã được phân chia thành trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Salmonella được Salmon và Smith phân lập đầu tiên vào năm 1886 (Steven A. Carlson và cs, 2012 [61]), vi khuẩn cư trú trong đường ruột của cả động vật máu nóng và máu lạnh. Với số lượng hơn 2400 serotype khác nhau, Salmonella được xác định gây ra nhiều bệnh cho người và động vật. Mặc dù đã được nghiên cứu từ trên 100 năm nhưng đến nay, nhiễm khuẩn Salmonella ở động vật và người vẫn tiếp tục được nghiên cứu vì những vấn đề dịch tễ nghiêm trọng có tính chất toàn cầu, ước tính hằng năm trên thế giới có khoảng 155.000 người chết bởi Salmonellosis và ngộ độc thực phẩm (Patchanee P. và cs, 2008 [55]; Evangelopoulou G. và cs, 2015 [44]). Qua kiểm tra đặc tính sinh hoá của 31 chủng Salmonella đều lên men sinh hơi các đường glucose, mantol, sorbitol, dextrose, galactose, manitol, arabinose, ... nhưng không lên men đường lactose, sucrose. Tất cả các chủng Salmonella phân lập đều không sinh Indol, phản ứng oxidaza âm tính, catalaze dương tính, 100% số chủng có khả năng di động, 74,09% các chủng sinh H2S (Nguyễn Mạnh Phương và cs, 2012 [20]). 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, không hình thành nha bào và giáp mô. Đa số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S. gallinarum-pullorum không có lông). Vi khuẩn dễ nhuộm với thuốc nhuộm, bắt màu Gram âm đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]. 5 Hình ảnh vi khuẩn Salmonella Theo Lê Văn Tạo (1993) [23] thời gian gần đây nhờ kính hiển vi điện tử, bằng phương pháp nhuộm của Haschem (1972) người ta phát hiện trên bề mặt vi khuẩn Salmonella ngoài lông còn có các cấu trúc Fimbriae. Đây là một cấu trúc ngắn hơn lông vi khuẩn, thường có kết cấu hình xoắn, được mọc lên từ một hạt gốc nằm trên thành tế bào, có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 6.500 lần trở lên. Trên mỗi tế bào vi khuẩn có từ 2 - 400 Fimbriae, với hai chức năng là giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh và liên kết với nhau để trao đổi thông tin di truyền bằng hình thức tiếp hợp, di truyền ngang. 1.1.1.3. Phân loại Về phân loại khoa học (Đào Thị Thanh Thủy, 2012 [28]), Salmonella được xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Salmonella lignieres, 1900 Loài Salmonella bongori Loài Salmonella Enterica 1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy Salmonella là những vi khuẩn sống hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, phát triển trên các môi trường thông thường. Có rất nhiều loại môi trường dinh dưỡng 6 chọn lọc được dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng các loại như môi trường bồi dưỡng (tăng sinh) Buffered Pepton Water (BPW), môi trường tăng sinh chọn lọc đặc hiệu là Tetrathionate hay còn gọi là môi trường MuellerKauffmann và Rappaport Vassiliadis (RV). Các loại môi trường thạch dùng để nhận dạng các khuẩn lạc Salmonella cũng như kiểm tra một số đặc tính sinh hoá bao gồm Brilliant Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Xylose Lysine Tetrathionate 4 (XLT 4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV), Rambach, Kligler. Trên môi trường MacConkey (MacC) vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, không màu. Trên môi trường BSA Salmonella mọc những khuẩn lạc đặc trưng xung quanh màu nâu sẫm, giữa màu vàng đậm, gần đen, khuẩn lạc có màu ánh kim (Timoney và cs, 1988) [64]. Trên môi trường thạch thường vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, đường kính khoảng từ 1 - 1,5 mm, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ. Môi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, màu xám, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]. Trên môi trường XLD, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có kích thước trung bình màu đen. Trên môi trường Rambach, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng. Trên môi trường XLT4, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đen, bóng, hơi lồi giống như khuẩn lạc mọc trên môi trường XLD, tuy nhiên khả năng ức chế tạp khuẩn của XLT4 tốt hơn XLD. Đào Thị Thanh Thủy (2012) [30] cho biết: Salmonella sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Nhiệt độ thích hợp 370C (sống được ở nhiệt độ từ 7 - 450C), pH = 7,2 - 7,4 (tồn tại được ở pH = 5,0). - Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, trơn, tròn sáng, bóng, màu trắng đục. 7 - Môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron agar (TSI agar): Sinh H2S ở phần thạch nghiêng. - Môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc dạng S, màu trắng. - Chuyển hoá đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại đường và không đổi. Salmonella lên men sinh hơi sản sinh axit đường glucoza, mannoza, sorbitol, mannit. Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường lactoza và saccaroza. 1.1.1.5. Đặc tính sinh hóa Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008) [30] đặc tính chung của Salmonella là không lên men đường lactose. Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi. Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, levuloza, arabinoza. Một số loài như S. abortus equi, S. abortus bovis, S. abortus ovis, S. typhi, S. typhisuis, S. cholerae suis, S. gallinarum, S. enteritidis cũng lên men các đường nhưng không sinh hơi. Riêng S. pullorum không lên men mantoza, S. cholerae suis không men arabinoza. Tất cả các vi khuẩn Salmonella đều không lên men lactoza, saccaroza. Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác. Các chủng Salmonella sinh acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ trytophan. Chúng không sinh indol hoặc acetoin và phân giải urea. Phần lớn các chủng sinh hydrogen sulfide (H2S) và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine. Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate. Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm và nước (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [28]. 1.1.1.6. Sức đề kháng Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và máu lạnh (các loài cá, động vật thủy sản), trong môi trường tự nhiên, phân, đất, nước thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt xương, bột trứng, bột cá… tồn tại được 9 tháng hoặc lâu hơn. Salmonella sống trong thịt ướp muối 29% được 4 - 8 tháng ở nhiệt độ 6 - 12 0C (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [28]. 8 - Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1h, 700C trong 20 phút, sôi 1000C sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp Pasteur cũng diệt được vi khuẩn (Đào Thị Xuân, 2014) [31]. - Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nước trong và 9h ở nước đục. - Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axit phenic 5%, formol 0,5% diệt khuẩn sau 15 - 20 phút (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [30]. 1.1.1.7. Đặc điểm dịch tễ học của Salmonella Salmonella phân tán, lây lan nhanh, rộng rãi hơn ta tưởng. Chỉ cần 1 con trong đàn bị ỉa chảy do Salmonella gây ra thì 24 giờ sau đó cả đàn đã bị lây nhiễm mầm bệnh. Trong quá trình xảy ra dịch bệnh, vi khuẩn Salmonella cũng được tìm thấy ở khắp mọi nơi như chuồng trại, rác rưởi, thức ăn, nước uống. Nguồn cảm nhiễm chính là tất cả lợn trưởng thành mang trùng. Vi khuẩn Salmonella sống hoại sinh trong cơ thể lợn khỏe từ 25 - 50% lợn khỏe mang trùng. Lợn khỏi bệnh là vật mang trùng và bài tiết vi trùng ra ngoài theo phân. Cũng như hầu hết các loài vi khuẩn khác, Salmonella không gây bệnh một cách đơn độc, mà bệnh xảy ra thường là kết quả của sự hội tụ nhiều yếu tố (Phan Thanh Phượng, 1988) [21]. Lợn con trước cai sữa bệnh ít xảy ra, bởi chúng được bảo hộ qua sữa đầu. Song nguy cơ xảy ra bệnh tăng dần theo lứa tuổi, đặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ động chưa thể bù đắp kịp thời để thay thế miễn dịch thụ động. Khi xuất lợn đi có nghĩa xuất theo mầm bệnh. Ở lợn mắc bệnh Phó thương hàn thể cấp tính gây nhiễm trùng huyết, rối loạn sinh sản là do S. choleraesuis var kunzendorf gây ra. Thể bệnh này có thể lưu hành ở trang trại từ đời này sang đời khác theo phương thức “truyền dọc” từ mẹ sang con. Thể bệnh viêm ruột, ỉa chảy mãn tính ở lợn chủ yếu là do S. typhimurium gây ra. Song loài vi khuẩn này lại lây truyền theo phương thức “truyền ngang” từ lợn này sang lợn khác trong đàn. Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại 1 tuần; trong nước đá có thể sống 2 - 3 tháng. Trong xác động vật chết chôn ở bùn, cát có thể sống 2 - 3 tháng. Trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) Salmonella có thể sống được 4 - 8 tháng ở nhiệt độ từ 8 - 120C (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]. Theo các tác giả Phan Thanh Phượng (1988) [21]; Nguyễn Như Thanh (2001) [26] khi nghiên cứu về đường nhiễm Salmonella đều cho rằng: vi khuẩn 9 Salmonella theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá và có thể do tiếp xúc. Bình thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh. Chỉ khi nào sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu và nội tạng gây bệnh. Bệnh Phó thương hàn chỉ gây thành dịch địa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu đàn, tình hình vệ sinh thú y, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và đặc điểm dịch tễ học của cơ sở đó. 1.1.1.8. Cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella hết sức phức tạp, gồm rất nhiều loại. Theo Phạm Hồng Sơn (2002) [22] Salmonella có hơn 67 loại kháng nguyên O (có nhiều tài liệu công bố hơn 80 loại), 94 loại kháng nguyên H pha 1, hơn 11 kháng nguyên H pha 2, kháng nguyên K là kháng nguyên Vi. Những năm gần đây, người ta phát hiện thêm kháng nguyên Pili của Salmonella, yếu tố giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biếu mô. Có tới 80% type Salmonella sản sinh kháng nguyên Pili, trong đó có S. typhimurium. Cần phân biệt 4 loại kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella là: Kháng nguyên O (O-Antigen): kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H-Antigen): kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K-Antigen): kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên F (Fimbriae Antigen): kháng nguyên Pili. Trong đó kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán là kháng nguyên thân (O - Antigen) và kháng nguyên lông (H - Antigen). a) Kháng nguyên O Kháng nguyên O - Lypopolysacharide (LPS) là một thành phần cơ bản tạo nên màng ngoài của thành phần tế bào vi khuẩn. LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipid A. O –Specific Core (vùng ưa nước) (vùng lõi) Vùng lipit A Kháng nguyên - O là loại kháng nguyên chịu nhiệt, có thể chịu được 100oC trong nhiều giờ, chịu được cồn và HCl ở nồng độ 1N trong 20 giờ.. 10 Kháng nguyên - O không phải là độc tố nhưng là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của cơ thể, chống lại hiện tượng thực bào. b) Kháng nguyên H Kháng nguyên - H của Salmonella bản chất là một protein nằm trong phần lông của vi khuẩn. Kháng nguyên - H không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng nguyên - O; bị phá huỷ ở 600C trong 1 giờ, dễ bị phá hủy bởi cồn và axit yếu. Kháng nguyên - H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng có ý nghĩa trong việc phân loại, định danh vi khuẩn. Không quyết định yếu tố độc lực, không có vai trò bám dính, nhưng có tác dụng bảo vệ vi khuẩn đường ruột tránh sự tiêu diệt của đại thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào gan, thận và ngay cả trong đại thực bào. c) Kháng nguyên vỏ (KN - K) Kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S. typhi, S. paratyphi, S.dublin có thể chứa Vi - Antigen giống như K - Antigen của E.coli. Có 3 loại kháng nguyên K là: kháng nguyên 5 (KN - 5), kháng nguyên Vi (KN - Vi), kháng nguyên M (KN - M). Đây là các kháng nguyên vỏ (capsular) được phân thành nhiều nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột, được biểu thị bằng các chữ cái A, B, L... nhờ các đặc điểm sinh hoá khác nhau (Chữ K bắt nguồn từ chữ Kapsel trong tiếng Đức). d) Kháng nguyên pili (KN - Pili) - Fimbriae antigen Kháng nguyên Pili của vi khuẩn Salmonella nằm trong cấu trúc Fimbriae nên còn gọi là kháng nguyên - F. Nó có chức năng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột. Theo Lê Văn Tạo (1993) [23] kháng nguyên Fimbriae của Salmonella thuộc type I (CFA/I) có khả năng ngưng kết hồng cầu gà, chuột lang. Kháng nguyên - Pili bản chất là protein, thành phần và trật tự các amino axit của mỗi kháng nguyên đều có những điểm khác biệt. Đến nay, một số nhóm kháng nguyên pili của Salmonella đã phát hiện gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật là Colonization Factor Antigen (CFA) I và II (Trần Quang Diên, 2002 [12]).