Tài liệu Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen nphs2 với chỉ số protein creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại bệnh viện nhi trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI an dP ha rm ac y, VN U KHOA Y DƯỢC ed ici ne ĐÀM VĂN QUÝ XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA ht @ Sc ho ol of M ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 CỦA GEN NPHS2 VỚI CHỈ SỐ PROTEIN/CREATININ NIỆU Ở BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Co py rig KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2019 y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Ph arm ac ĐÀM VĂN QUÝ ea nd XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA ho ol of M ed ici n ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 CỦA GEN NPHS2 VỚI CHỈ SỐ PROTEIN/CREATININ NIỆU Ở BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA t@ Khóa: QH 2013.Y 2. ThS. BS. Vũ Vân Nga Co py rig h Người hướng dẫn: 1. TS. Vũ Thị Thơm HÀ NỘI - 2019 y, VN U LỜI CẢM ƠN arm ac Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này. nd Ph Tôi xin chân thành cảm ơn ThS.Bs. Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. ed ici n ea Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. of M Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Co py rig h t@ Sc ho ol Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Đàm Văn Quý y, VN U DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Base pair (Cặp bazơ nitơ) DNA Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) FSGS Focal segmental glomerulosclerosis (Xơ hóa cầu thận khu trú từng phần) HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát MCD Minimal Change Disease (Tổn thương tối thiểu) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) NC Nhạy cảm KTM Kháng thuốc muộn KTS Kháng thuốc sớm of ho ol Kilobase (= 1000 bp) OD t@ PCR rig h SNP py VPF Optical Density (Mật độ quang) Sc Kb Co M ed ici n ea nd Ph arm ac bp Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) Vascular permeability factor (Yếu tố thấm mạch máu) y, VN U DANH MỤC CÁC BẢNG 19 Bảng 3.1 Giới tính ở các nhóm bệnh nhân 23 arm ac Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 23 Bảng 3.3 Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân 24 Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs3738423 (C>T) của exon 2 ở ba nhóm bệnh nhân 31 nd Ph Bảng 3.2 Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại 32 Bảng 3.6 Tuổi khởi phát theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 32 Bảng 3.7 Protein máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 33 Bảng 3.8 Albumin máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 34 Bảng 3.9 Protein niệu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 35 Bảng 3.10 Protein/creatinin niệu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 36 Bảng 3.11 Chỉ số protein máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2 38 ho ol of M ed ici n ea Bảng 3.5 Phân bố giới theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Sc Bảng 3.12 Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2 40 Bảng 3.14 Chỉ số protein/creatinin niệu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2 41 rig h t@ Bảng 3.13 Chỉ số protein niệu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2 py Co 39 y, VN U DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Tế bào podocyte bình thường và bệnh lý arm ac Hình 1.2 Gen NPHS2 trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 25.2 Hình 1.3 Cấu trúc màng lọc cầu thận Hình 1.4 Một số đột biến trên gen NPHS2 Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph Hình 3.1 Kết quả giải trình tự đa hình thái đơn rs3738423 (C>T) 5 11 12 13 30 Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân mắc HCTH theo giới y, VN U DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ 25 Biểu đồ 3.3 Giá trị trung bình albumin máu của các nhóm bệnh nhân tại các thời điểm 26 Ph arm ac Biểu đồ 3.2 Giá trị trung bình protein máu của các nhóm bệnh nhân tại các thời điểm nd Biểu đồ 3.4 Giá trị trung bình protein niệu của các nhóm bệnh nhân tại các thời điểm py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea Biểu đồ 3.5 Giá trị trung bình protein/creatinin niệu của các nhóm bệnh nhân tại các thời điểm Co 22 27 28 y, VN U Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1 Hội chứng thận hư tiên phát .......................................................... 3 1.1.1 Khái niệm .......................................................................................................3 arm ac 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ ............................................................................................3 1.1.3 Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP .....................................................................4 1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTHTP và HCTHTP kháng corticosteroid ............7 Ph 1.1.5 Điều trị HCTHTP ...........................................................................................8 Đa hình di truyền NPHS2 ............................................................ 11 ea 1.2 nd 1.1.6 Vai trò của chỉ số Protein/Creatinin niệu trong chẩn đoán và theo dõi điều trị HCTHTP ...............................................................................................................10 ici n 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò gen NPHS2 ..............................................................11 1.2.2 Đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 .....................................................13 ed CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15 Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 15 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................. 16 2.4 Xử lý số liệu ............................................................................... 21 2.5 Đạo đức nghiên cứu .................................................................... 21 ho ol of M 2.1 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................22 Đặc điểm chung .......................................................................... 22 Sc 3.1 t@ 3.1.1 Giới ..............................................................................................................22 3.1.2 Tuổi ..............................................................................................................23 Kết quả cận lâm sàng .................................................................. 25 rig h 3.2 3.2.1 Chỉ số protein máu .......................................................................................25 py 3.2.2 Chỉ số albumin máu .....................................................................................26 Co 3.2.3 Chỉ số protein niệu .......................................................................................27 3.2.4 Chỉ số protein/creatinin niệu .......................................................................28 Kết quả tần số phân bố alen và tỷ lệ kiểu gen ............................... 29 y, VN U 3.3 3.3.1 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen ............................................................................29 3.3.2 Liên quan đến giới tính ................................................................................32 3.3.3 Liên quan đến tuổi khởi phát .......................................................................32 arm ac 3.3.4 Liên quan đến protein máu ..........................................................................33 3.3.5 Liên quan đến albumin máu .........................................................................34 3.3.6 Liên quan đến protein niệu ..........................................................................35 3.3.7 Liên quan đến protein/cretinin niệu .............................................................36 Ph Mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa 37 nd 3.4 3.4.1 Chỉ số protein máu .......................................................................................38 ea 3.4.2 Chỉ số albumin máu .....................................................................................39 ici n 3.4.3 Chỉ số protein niệu .......................................................................................40 3.4.4 Chỉ số protein/cretinin niệu .........................................................................41 ed KẾT LUẬN ..............................................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig h t@ Sc ho ol of PHỤ LỤC M KIẾN NGHỊ .............................................................................................................44 y, VN U ĐẶT VẤN ĐỀ ea nd Ph arm ac Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là hội chứng về cầu thận mạn tính thường gặp ở trẻ em, đặc trưng bởi sự thoát protein ra nước tiểu do tổn thương tại cầu thận. Bệnh kéo dài nhiều tháng với những đợt triệu chứng bột phát và thuyên giảm xen kẽ. Tỷ lệ mắc HCTHTP có sự khác nhau tùy chủng tộc, vùng địa lý trên thế giới nhưng tỷ lệ trung bình là từ 2 đến 16,9/100.000 trẻ em [16]. Khó khăn lớn nhất trong điều trị hội chứng thận hư (HCTH) là tình trạng kháng thuốc corticosteroid, mặc dù chiếm tỷ lệ 10-15% hay 20% nhưng gần một nửa số bệnh nhân kháng thuốc có thể tiến triển tới suy thận giai đoạn cuối trong vòng 10 năm, ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và cuộc sống [40, 5]. ho ol of M ed ici n Trong chẩn đoán và theo dõi hội chứng thận hư thì các xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu đóng vai trò vô cùng quan trọng. Bên cạnh biểu hiện lâm sàng như phù, đái máu … thì những nhà lâm sàng luôn quan tâm đến các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu 24 giờ … Và đặc biệt là chỉ số protein/creatinin niệu với sự chính xác, thuận tiện và tin cậy trong việc đánh giá protein niệu 24 giờ, giúp cho việc chẩn đoán sớm hội chứng thận hư và theo dõi điều trị bệnh khi việc thu thập nước tiểu 24 giờ gặp khó khăn [10, 2]. Co py rig h t@ Sc Sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử hiện đại đã mở ra bước ngoặt mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh tật nói chung và các bệnh về cầu thận nói riêng. Các nhà khoa học đã phát hiện ra podocin, một protein đảm nhiệm vai trò chính trong chức năng lọc của cầu thận. Podocin được mã hóa bởi gen NPHS2 gồm 8 exon nằm trên nhiễm sắc thể số 1 ở người (1q25-31) [20]. Đột biến gen NPHS2 có thể dẫn đến sai lệch cấu trúc podocin, ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu thận, là một trong những yếu tố dẫn đến HCTH. Và đặc biệt đa hình rs3738423 (tên khác là S96S hay 288C>T) là 1 SNP (single nucleotide polymorphism) ở vị trí nucleotide 16170 của exon 2 gen NPHS2, có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP kháng corticosteroid [20]. Qua nghiên cứu trên 97 bệnh nhi mắc HCTHTP, Junli và cộng sự đã thấy rằng rs3738423 dường như có tác dụng bảo vệ 1 y, VN U những bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng tác dụng này không thấy ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia [32]. arm ac Với mong muốn góp phần cho việc khám và theo dõi điều trị bệnh nhân hiệu quả hơn, đặc biệt là những bệnh nhân trong nhóm kháng thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein/creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại Bệnh viện Nhi Trung Ương” Ph Mục tiêu: Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd - Xác định được tỉ lệ đa hình thái đơn rs3738423 của gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP - Xác định được mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với chỉ số protein/creatinine niệu ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP 2 y, VN U CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng thận hư tiên phát 1.1.1 Khái niệm nd Ph arm ac Hội chứng thận hư là một hội chứng xuất hiện khi có tổn thương cấu trúc hoặc chức năng của cầu thận, đặc trưng bởi các triệu chứng phù, protein niệu tăng cao, protein máu giảm và lipid máu cao. Hội chứng này có nhiều nguyên nhân, có thể do các bệnh lý ngoài thận (như tiểu đường, lupus …) ảnh hưởng đến cầu thận và các cơ quan khác trong cơ thể được gọi là HCTH thứ phát; nhưng thường gặp là do tổn thương khu trú tại thận gọi là HTTHTP [26]. ici n ea Hội chứng thận hư nguyên phát là bệnh về cầu thận mạn tính thường gặp nhất ở trẻ em, nguyên nhân bắt đầu từ thận và thường được chẩn đoán loại trừ khi không tìm thấy nguyên nhân nào ngoài thận. Bệnh kéo dài nhiều tháng, nhiều năm với những đợt triệu chứng bột phát xen lẫn thời kì thuyên giảm. ho ol of M ed Hội chứng thận hư kháng corticosteroid được định nghĩa là không có sự thuyên giảm về kết quả điều trị sau khi áp dụng phác đồ chuẩn sử dụng corticosteroid. Mặc dù chỉ chiếm tỷ lệ khoảng 20% số bệnh nhân mắc HCTHTP, nhưng HCTH kháng corticosteroid lại rất khó điều trị và có tới 36-50% số bệnh nhân này sẽ tiến tới suy thận trong vòng 10 năm [40]. 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ t@ Sc Hội chứng thận hư tiên phát ở bệnh nhân nhi có tỷ lệ mắc khác nhau tùy thuộc vào giới, tuổi, chủng tộc, cơ địa của từng trẻ. Tại Việt Nam, HCTHTP hay gặp ở lứa tuổi 8,7 ± 3,5 tuổi, và tỉ lệ bé trai bị bệnh nhiều hơn bé gái là 2/1 [3]. Co py rig h Năm 2016, theo nghiên cứu tại Canada trong vòng 20 năm từ năm 1993 đến năm 2014 cho thấy tỉ lệ mắc giữa bé trai và bé gái là xấp xỉ 2:1, tỉ lệ mắc mới hàng năm của người gốc châu Âu là 2,4, của người gốc Nam Á là 15,83, của người gốc Đông/Đông Nam Á là 1,81 (tính trên 100.000 trẻ em độ tuổi từ 1 đến 18 tuổi) [16]. 3 ici n ea nd Ph arm ac y, VN U Hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid luôn được các nhà làm lâm sàng quan tâm bởi vì việc điều trị thường kéo dài, khó khăn và để lại nhiều biến chứng nguy hiểm. Tỷ lệ kháng corticosteroid cũng khác nhau theo các vùng địa lý, thời gian. Tỷ lệ kháng corticosteroid ở một số nước châu Á như Ấn Độ và Pakistan là khoảng 30% [17, 41]. Năm 2012, nghiên cứu tại Ba Lan chỉ ra tỉ lệ kháng corticosteroid trên 178 bệnh nhi mắc HCTH tăng từ 15,8% lên tới 31,4% trong hai giai đoạn 1986-1995 và 1996-2005 [15]. Một nghiên cứu khác ở Nam Phi đưa ra tỷ lệ kháng thuốc là 27,3% [17]. Tại Việt Nam, tỷ lệ kháng thuốc ở trẻ mắc hội chứng thận hư cũng khác nhau trong từng thời gian, từng nghiên cứu. Theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng, tỷ lệ HCTH kháng thuốc là 12,4% [8], nghiên cứu của Dương Thị Thúy Nga là 20% [5], trong khi đó nghiên cứu của Phạm Văn Đếm và các cộng sự thống kê có 258 trẻ kháng thuốc trong tổng số 458 trẻ mắc HCTH điều trị nội trú tại khoa Thận- Lọc máu bệnh viện Nhi Trung Ương chiếm tới 56,3 % [1]. ed 1.1.3 Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP ho ol of M Hội chứng thận hư tiên phát xuất hiện khi có sự tăng tính thấm của màng lọc cầu thận đối với các protein, nhất là các phân tử albumin. Khi điện di protein niệu ở bệnh nhân có hội chứng thận hư, các nhà khoa học thấy có gần 70% là albumin, do đó người ta gọi là protein niệu chọn lọc [11]. Albumin trong huyết thanh mang điện tích âm, bình thường rất khó lọt qua được màng lọc cầu thận, vì bị lớp điện tích âm của bề mặt màng lọc cầu thận ngăn cản. Co py rig h t@ Sc Màng lọc cầu thận là một hàng rào có cấu trúc hình tổ ong và có cấu tạo gồm ba lớp. Lớp thứ nhất là lớp nội mô mao mạch cầu thận, ở đây có những lỗ lọc đường kính 500-1000 Å. Lớp thứ hai là màng đáy gồm 3 lớp dày khoảng 3200 Å và tích điện âm. Lớp thứ ba là hàng tế bào podocyte (lớp tế bào biểu mô của bao Bowman) [21]. Bình thường, hàng rào này lọc các chất từ huyết tương, tạo ra “nước tiểu đầu” có thành phần giống huyết thanh, chỉ thiếu protein. Màng lọc cầu thận là màng có tính thấm chọn lọc cao, dựa vào kích thước, điện tích và hình dạng của phân tử đó. Các phân tử không mang điện và bán kính nhỏ hơn 70 Å sẽ dễ 4 arm ac y, VN U dàng đi qua màng lọc. Những phân tử có bán kính lớn hơn 4,0nm và tích điện âm sẽ khó qua được hàng rào này để vào nước tiểu đầu [43]. Chính vì vậy, khi màng lọc cầu thận bị thương tổn làm mở rộng lỗ lọc hoặc màng lọc cầu thận mất điện tích âm ở màng đáy thì những cấu trúc protein nhỏ và mang điện tích âm có thể dễ dàng đi qua. Cho đến nay đã có nhiều giả thuyết được đưa ra về vấn đề này và còn nhiều tranh cãi. Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã phát hiện ra mối liên quan giữa tế bào podocyte và hội chứng thận hư. Podocyte là tế bào gồm thân và nhiều chân bao quanh các mao mạch cầu thận, các chân xen kẽ với nhau tạo ra các kẽ lọc với đường kính khoảng 70-75 Å hay còn gọi là cấu trúc khe lọc “slit diaphragm”. Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra một số protein liên kết với nhau tạo thành các phức hợp, cấu thành và gắn kết khe lọc slit diaphragm với các sợi actin nội bào. Các protein đó là nephrin, podocin, FAT1, FAT2, CD2AP … Chúng có liên quan trực tiếp đến chức năng lọc cầu thận, khi các gen mã hóa các protein đó bị đột biến hoặc mất chức năng thì có thể dẫn tới protein niệu [12]. Do khả năng phân chia và tái tạo có hạn, nên những tổn thương ở tế bào podocyte rất khó hồi phục. Khi số lượng tế bào podocyte bị tổn thương trên 20% thì cầu thận dễ tiến triển tới xơ hóa và mất chức năng thận [55]. Hình 1.1. Tế bào podocyte bình thường và bệnh lý A: Podocyte bình thường với nhiều chân giả; B: Podocyte bệnh lý ở bệnh nhân HCTH dẹt và ít chân giả [51]. 5 ea nd Ph arm ac y, VN U Cũng có quan điểm cho rằng hội chứng thận hư là bệnh rối loạn miễn dịch tế bào, do lắng đọng các phức hợp miễn dịch ở cầu thận gây hủy hoại lớp điện tích âm của màng lọc cầu thận, làm cầu thận để lọt dễ dàng các phân tử mang điện tích âm như albumin. Quan điểm này được đưa ra khi một số tác giả thấy rằng HCTH xuất hiện sau khi bệnh nhân tiếp xúc với các chất gây dị ứng [54]. Điều này càng được củng cố khi mà corticosteroid là thuốc chính trong điều trị HCTHTP. Hơn nữa, có bằng chứng cho thấy u lympho Hodgkin và u lympho tế bào T khác có thể gây nên hội chứng thận hư và sau khi dùng hóa trị liệu thì bệnh đã thuyên giảm [13]. Gần đây, protein CD80 (B70-1), một chất cần cho sự kích hoạt tế bào T đã được tìm thấy ở các tế bào podocyte bất thường lại càng củng cố cho quan điểm này. Và đây cũng là một mục tiêu để nghiên cứu thuốc đích cho các bệnh nhân mắc HCTH [45]. Sc ho ol of M ed ici n Bên cạnh đó, các yếu tố tăng tính thấm trong huyết tương cũng có thể là nguyên nhân gây ra HCTH, điều này đã được chứng minh khi có sự tái phát protein niệu ở những bệnh nhân xơ hóa cầu thận cục bộ từng phần (FSGS) sau khi được ghép thận [52]. Một nghiên cứu khác cho thấy huyết thanh ở bệnh nhân có xơ hóa cầu thận cục bộ từng phần cũng gây protein niệu ở chuột và có sự tăng tính thấm đối với albumin ở màng lọc cầu thận [48]. Nhiều yếu tố gây tăng tính thấm trong huyết tương đã được tìm ra, trong đó đáng chú ý là yếu tố thấm mạch máu (VPF) và haemopxin [14]. Haemopexin được cho là làm thay đổi tế bào chất tế bào podocyte, do đó làm tăng sự khuếch tán albumin trên màng lọc cầu thận [36]. Các nhà nghiên cứu đã tìm ra chất này ở trẻ em mắc HCTHTP và biến mất khi các triệu chứng đã thuyên giảm [14]. Co py rig h t@ Phần lớn các trường hợp bệnh nhân HCTHTP kháng corticosteroid đều không tìm thấy nguyên nhân. Tuy vậy, các nhà khoa học đã tìm được bằng chứng cho rằng 1/4 đến 1/3 các trường hợp bệnh nhân kháng corticosteroid hoặc HCTH bẩm sinh là do các gen mã hóa cho các protein làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào podocyte [33]. Trên thế giới cũng ghi nhận các trường hợp bệnh nhân mắc HCTHTP ban đầu thì đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó thì 6 y, VN U không, vấn đề này đang được nhiều nhà nghiên cứu tìm câu trả lời. Và nghiên cứu này của chúng tôi cũng được thực hiện với mục đích đó. 1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTHTP và HCTHTP kháng corticosteroid arm ac KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) đã đưa ra một số phân loại và định nghĩa về HCTHTP ở trẻ em để áp dụng trong lâm sàng năm 2012 [27, 28]: Ph Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTH: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol; Albumin máu ≤ 25 gam/lít; Protein máu ≤ 56 gam/lít. ea nd • HCTHTP đạt thuyên giảm khi có Protein niệu/ Creatinine niệu < 20 mg/mmol, hoặc Protein niệu < 10 mg/kg/24 giờ, hoặc que thử nước tiểu âm tính hoặc vết trong 3 ngày liên tiếp. M ed ici n • Thuyên giảm hoàn toàn (HCTH nhạy cảm corticosteroid): Sau 4 tuần điều trị prednisone (hoặc prednisolon) liều 2 mg/kg/24 giờ bệnh nhân hết phù, protein niệu âm tính hoặc Protein niệu/Creatinin niệu < 20 mg/mmol hoặc Protein niệu < 1+ qua tổng phân tích nước tiểu. ho ol of • Thuyên giảm một phần: Sau 4 tuần điều trị prednisone (hoặc prednisolon) liều 2 mg/ kg/ 24 giờ giảm 50% protein niệu hoặc hơn so với ban đầu và protein/creatinin niệu nằm trong khoảng từ 20 đến 200 mg/mmol. Sc • Không thuyên giảm: Sau 4 tuần điều trị prednisone (hoặc prednisolon) liều 2mg/kg/24giờ không giảm được 50% protein niệu so với ban đầu hoặc protein/creatinin niệu dai dẳng > 200 mg/mmol. Co py rig h t@ • Chẩn đoán HCTHTP kháng corticosteroid theo một trong ba tiêu chuẩn sau: - Không thuyên giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục. - Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằngprednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều 1,5mg/kg/ 48 giờ. 7 y, VN U - Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 3 liều truyền Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73 m2 cơ thể/48 giờ. • Tiêu chuẩn kháng thuốc sớm : Kháng thuốc corticosteroid ngay trong liệu trình đầu tiên arm ac • Tiêu chuẩn kháng thuốc muộn : Có đáp ứng corticosteroid trong đợt đầu tiên hoặc nhiều đợt sau đó, nhưng kháng thuốc steroid trong các đợt tái phát. Ph • HCTH phụ thuộc steroid: Bệnh nhân nhạy cảm steroid trong đợt điều trị tấn công nhưng có ≥ 2 lần tái phát trong đợt giảm liều steroid. ea nd • HCTH tái phát: Bệnh nhân đã đạt được thuyên giảm hoàn toàn nhưng sau đó protein/creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol hoặc ≥ 3+ protein que thử x 3 ngày. ici n • HCTH tái phát thưa (tái phát không thường xuyên): Tái phát 1 lần trong vòng 6 tháng sau đáp ứng lần đầu hoặc 1 đến 3 lần tái phát trong bất kỳ chu kỳ 12 tháng nào. ed • HCTH tái phát dày (tái phát thường xuyên): Tái phát  2 lần trong 6 tháng M sau đáp ứng lần đầu hoặc  4 lần tái phát trong bất kỳ chu kỳ 12 tháng nào. of • HCTHTP đơn thuần: Bệnh nhân chỉ có HCTH không đái máu, không suy thận, không tăng huyết áp. Sc ho ol • HCTHTP không đơn thuần: Bệnh nhân có HCTH kết hợp hoặc đái máu hoặc suy thận hoặc tăng huyết áp. t@ 1.1.5 Điều trị HCTHTP Co py rig h Các bằng chứng về rối loạn miễn dịch tế bào trong việc tham gia vào cơ chế bệnh sinh của HCTHTP chính là cơ sở để các tổ chức y tế đưa ra khuyến cáo việc sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác để điều trị bệnh này [37]. Thể nhạy cảm corticosteroid: Bắt đầu điều trị bằng liều tấn công với Prednisolon 2 mg/kg/24 giờ nhưng không quá 60 mg/24 giờ uống 1 lần vào 8 giờ 8 y, VN U sáng, sau ăn, trong 4 tuần. Sau liều tấn công, bệnh thuyên giảm thì dùng liều duy trì 1,5 mg/kg/24 giờ trong 8 tuần, uống vào buổi sáng. Giảm liều: cứ 2 tuần giảm liều 1 lần, mỗi lần giảm 0,5 mg/kg. Sau đó dùng liều củng cố: 0,5 mg/kg/ cách ngày. Tổng thời gian điều trị là 4,5 tháng. ea nd Ph arm ac Thể kháng corticosteroid: Dùng Prednisone liều 1 mg/kg/ cách ngày và thêm các thuốc ức chế miễn dịch khác. Cyclosporin là thuốc được ưu tiên nhất, liều 5 mg/kg/ngày. Luôn giữ nồng độ thuốc từ 100-150 ng/l, kiểm tra chức năng thận đều đặn, có thể dùng lâu dài từ 1-2 năm. Sau 3 tháng không thuyên giảm, chuyển thuốc ức chế miễn dịch khác như Mycophenolate mofetil. Nếu 3 tháng điều trị bằng Mycophenolate mofetil vẫn không thuyên giảm thì dùng phối hợp Mycophenolate mofetil và Cyclosporin. Nếu vẫn không đáp ứng thì dừng tất cả các thuốc và điều trị triệu chứng, bảo vệ thận. Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n Khoảng 80-90% trẻ mắc HCTHTP đáp ứng điều trị với corticosteroid [5], điều này giúp giảm tỷ lệ tử vong ở trẻ mắc HCTHTP xuống còn 3% [35]. Tuy nhiên việc sử dụng corticosteroid kéo dài để điều trị bệnh cũng gây ra rất nhiều biến chứng nghiêm trọng như: béo phì, chậm phát triển chiều cao, đái tháo đường, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, kích thích dạ dày, rối loạn hành vi hay cáu giận [30]. Đối với các trường hợp mắc HCTH kháng thuốc thì việc sử dụng corticosteroid kéo dài không những không có kết quả mà còn khiến bệnh nhân chịu nhiều tác dụng phụ của thuốc. Gần đây, với sự phát triển vượt bậc trong lĩnh vực sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng có mối liên quan giữa đa hình di truyền với HCTH kháng thuốc. Sự liên quan này biểu hiện rất đa dạng ở các chủng tộc người, ở các vùng địa lý khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này, tiếp cận HCTHTP theo hướng di truyền sinh học phân tử nhằm tối ưu hóa điều trị, giảm thiểu tối đa các tác dụng phụ và chi phí mà các bệnh nhi phải gánh chịu. 9 y, VN U 1.1.6 Vai trò của chỉ số Protein/Creatinin niệu trong chẩn đoán và theo dõi điều trị HCTHTP arm ac Hội chứng thận hư tiên phát là một rối loạn do tổn thương tại cầu thận, làm một lượng lớn protein trong máu thoát ra nước tiểu ( protein niệu >50mg/kg/24h). Chính vì vậy việc định lượng protein niệu 24h là một trong những xét nghiệm bắt buộc để chẩn đoán xác định và cũng là xét nghiệm thường xuyên để theo dõi tiến triển, kết quả điều trị của các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư [27]. ea nd Ph Thu thập nước tiểu 24 giờ [4]: Khi trẻ ngủ dậy khoảng 8h sáng, cho trẻ đi tiểu (bỏ bãi nước tiểu này, không hứng vào bô). Sau đó trong ngày, khi nào trẻ đi tiểu thì hứng vào bô, cho đến bãi nước tiểu cuối cùng vào 8h sáng ngày hôm sau. Đánh giá: thiểu niệu khi số lượng nước tiểu 0,5-1 ml/ kg/ giờ; Vô niệu khi số lượng nước tiểu < 0,5 ml/ kg/ giờ; Đa niệu khi số lượng nước tiểu > 4ml/ kg/ giờ. Sc ho ol of M ed ici n Tuy nhiên việc lấy mẫu nước tiểu 24h ở trẻ nhỏ, nhất là ở trẻ gái hay với những gia đình kém hợp tác gặp khá nhiều khó khăn. Xuất phát từ vấn đề này, định lượng chỉ số protein/creatinin niệu trong mẫu nước tiểu bất kì được đưa ra như là một phương pháp thay thế hợp lý. Thay vì phải tốn công sức, thời gian lấy mẫu nước tiểu 24h, bệnh nhân chỉ cần lấy một mẫu nước tiểu ngẫu nhiên bất kì thời điểm nào. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như Việt Nam đã cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa protein niệu 24h và tỷ số protein/creatinin niệu ở tất cả các mức độ [10, 18, 2]. Và KDIGO đã công nhận chỉ số protein/creatinin niệu là một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để chẩn đoán hội chứng thận hư [27]. Co py rig h t@ Như vậy, chỉ số protein/creatinin niệu có thể dùng để chẩn đoán sớm hội chứng thận hư ở trẻ nhỏ khi trẻ mới nhập viện chưa có kết quả xét nghiệm nước tiểu 24h, cũng như để tiện theo dõi tiến triển của bệnh thay thế cho việc lấy mẫu nước tiểu 24h gặp nhiều khó khăn. Nhận thấy những ưu điểm đó, nghiên cứu này của chúng tôi tập trung vào phân tích mối liên quan xung quanh chỉ số protein/creatinin niệu, nhằm tối ưu hóa công việc chẩn đoán và theo dõi điều trị của bệnh nhân. 10 y, VN U 1.2 Đa hình di truyền NPHS2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò gen NPHS2 ea nd Ph arm ac Năm 2000, Boute và cộng sự đã xác định được vị trí gen NPHS2 ở người (MIM # 604766, GenBank NM 014625.2). Gen dài khoảng 25 Kb, có 8 exon, nằm trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31). [20]. ( Hình 1.2) ed ici n Hình 1.2. Gen NPHS2 trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 25.2 . ( Nguồn: Genome Decoration Page/ NCBI) t@ Sc ho ol of M Gen NPHS2 mã hóa cho podocin, một protein được tạo thành từ 383 acid amin với trọng lượng phân tử là 42 kD. Podocin là protein gắn màng, cấu trúc hình kẹp tóc, có cả hai đầu N- và C- đều nằm trong tế bào chất [49]. Podocin được tìm thấy chủ yếu ở thận, là cơ quan có nhiệm vụ lọc các chất thải từ máu và loại bỏ chúng qua nước tiểu. Cụ thể, podocin được tìm thấy trong các tế bào gọi là podocyte, tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở khu vực slit diagram để có thể dễ dàng tương tác với các protein khác như CD2AP hay nephrin [25]. Co py rig h Podocyte là các tế bào biểu mô có chân hình các tua nhỏ, tạo thành các khe lọc nhỏ (slit diagram) có đường kính khoảng 70- 75 A0. Đây là hàng rào cuối cùng, là 1 trong 3 lớp cấu thành nên màng lọc cầu thận cùng với lớp tế bào nội mô mao mạch và màng đáy [29]. Trong những năm gần đây, các đột biến di truyền gây bệnh ở tế bào podocyte ngày càng được quan tâm và chứng minh là nguyên nhân hàng đầu, liên quan chặt chẽ đến hội chứng thận hư kháng corticosteroid. 11