Tài liệu Xác định kiểu gen virut viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử real time – pcr

Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR Phương Thị Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS.BS. Nguyễn Văn Tiến Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Trình bày đặc điểm sinh học virut viên gan C (HCV), genotype HCV, bệnh học viêm gan virut C và các kỹ thuật real-time PCR. Phân tích những mẫu huyết thanh và các bệnh nhân đã xác định anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/ 2011 đến tháng 01/2012. Đưa ra kết quả nghiên cứu: tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo giới tính; tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo mạn; mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type; xác định lại kiểu gen type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn NS5B. Keywords: Vi sinh vật học; Virus viêm gan C; Kiểu gen; Sinh học phân tử Content ĐẶT VẤN ĐỀ Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. 2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.1.1.Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1). Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng vỏ (Hình 1.2). Mà ng vỏ glycoprotein Core Mà ng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1.2. Cấu trúc của virut viêm gan C 1.1.2. Genome HCV Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]. 2 Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit. - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33. - Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70. Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm: - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23). - Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72). - Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27. - Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN- Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép. Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3). Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu FTemed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46]. Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein 3 Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3). Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]. 1.1.3. Vòng đời của virut viêm gan C Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in vitro để thể hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV. Nhưng vì hình thành hệ thống replicon đã như một cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV. Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trƣởng HCV [51] (1:Sự hấp phụ bề mặt tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận. 2: Xâm nhập nội tế bào. 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan. 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải phóng ARN (+). 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web màng. 6: Tập hợp và đóng gói. 7: Tạo virut hoàn chỉnh. 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan) 1.2. Genotype HCV 4 HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50]. Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được từ các bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm tại các vùng miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất là 06 nhóm gen chính bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39]. Khi tính toán mức trung bình trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen nhân và một số gen không có cấu trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn. Khả năng khác nhau của các chuỗi ở mức thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại đó chuỗi riêng lẻ và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng chuyển hóa[44,47]. Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước trên đoạn gen là có sự đồng nhất. Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự biến đổi của chuỗi trình tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng ý với ý kiến này cho rằng có khả năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có sự biến đổi codon thứ ba của gen lõi[42,44]. 5 Kiểu gen 1a được phân bố rộng rãi ở bắc Âu và Mỹ, các nước có nền công nghiệp hóa. Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thấy chủ yếu ở các nước vùng Địa Trung Hải và viễn Đông Kiểu gen 1b thường thường phân bố toàn thế giới Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu vực công nghiệp hóa ở Châu Âu Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung Đông Type 6a tìm thấy ở Việt Nam, các khu công nghiệp ở Hồng Kông và gần đây tìm thấy ở Autralia Type 5a thường tìm thấy duy nhất ở Nam Phi Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44]. Mỗi nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV đều có chứa một chuỗi các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đó, sự khác biệt của mỗi subtype vào khoảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con số này là >30%. Một số genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng hơn cả, điều này có thể là kết quả của quá trình truyền máu và dùng chung kim tiêm giữa những người sử dụng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớn là phân bố ở các nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp phổ biến nhất trong các thử nghiệm lâm sàng và thông tin mới nhất đã được thu thập trên các phản ứng với interferon (INF) và các phương pháp điều trị virus khác). Trong đó 1a phân bố toàn thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân bố địa trung hải và Trung Đông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung đông, type 5 ở Nam Phi, type 6 ở Hồng Kông và Việt Nam [42,44]. Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực châu Phi và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ thể. Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu 6 gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng sự có mặt của các kiểu gen này có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44]. Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia [42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á. Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với 54,9%)[2] Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV: +Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV mạn cao (>80%) + Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm + Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới) 1.3. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ thuật Realtime PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing). Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012. Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 7 Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai. 2.2. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA của các mẫu bệnh nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time Kĩ thuật tách chiết ARN Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh lượng HCV-RNA. Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen HCV Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng. Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa chọn. Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính 3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn 3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR 3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type 3.2.2. Tỉ lệ kiểu gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV Kiểu gen Type 1 Type 2 Type 3 Type 6 Không xác Tổng định đƣợc HCV Số mẫu 151 5 0 70 2 228 Tỉ lệ % 66.23% 2.19% 0% 30.7% 0.88% 100% Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type 1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu 8 với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu. Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3 Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50]. Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6. Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a) 23,9% và kiểu gen 2 là 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%)[ 50]. Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng 5’NC, cho thấy kết quả nghiên cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những người nhiễm HCV tại Việt Nam. Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV 9 Kiểu gen Type 1 Type 2 Type 3 Type 6 Không xác Tổng định đƣợc HCV Số mẫu 151 5 0 70 2 228 Tỉ lệ % 66.23% 2.19% 0% 30.7% 0.88% 100% Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type 1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu. Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3 Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50]. Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6. Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type 10 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a) 23,9% và kiểu gen 2 là 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%)[ 50]. Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng 5’NC, cho thấy kết quả nghiên cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những người nhiễm HCV tại Việt Nam. 3.2.3. Tỉ lệ kiểu gen lưu hành theo giới tính 3.2.4. Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi 3.3. Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phƣơng pháp giải tình tự gen (Sequencing) trên đoạn NS5B. Đối với hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6. Việc bố trí thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe 1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các genotype còn lại (Hình 3.6) HCV genotype 1 HCV genotype 3 HCV genotype2 HCV genotype 6 Chứng âm Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV 11 Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dò đặc trưng thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm (được thiết kế với các thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền. Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết quả cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7). Tín hiệ u mẫ u dò type 6 Tín hiệ u mẫ u dò type 1 Tín hiệ u mẫ u dò type 2 Tín hiệ u mẫ u dò type 3 Hình 3.7 Tín hiệu dƣơng tính genotype 1 và 6 Vậy tín hiệu mẫu dò giữa type 1 và type 6 là có sự tương đồng cao.Theo một số nhà nghiên cứu trên thế giới [18] chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ phân biệt các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’NC, cũng như là phân biệt được type 6 với subtype 1b. Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định là genotype l ta l ấy ngẫu nhiên 30 trường hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b được kết quả như bảng sau: Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b của HCV Kiểu gen Type 1 Type 1a Type 6 Type 1b Type 6k Type 6e Không Type 6f Type 6h xác định được Số mẫu Tổng 9 7 2 6 16 1 11 12 2 3 3 Tỉ lệ % 53.33 36.67 10.0 Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 và có 3 mẫu là không giải được trình tự gen, không chỉ xác định type mà giải trình tự gen còn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết thanh định type bằng phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát hiện genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype 1 còn phương pháp giải trình tự gen cho kết quả là type 6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng 3.7 ). Kết quả định type bằng kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với genotype1 ta đem giải trình tự được kết quả như hình dưới,kết quả giải trình tự gen là type 6h (Hình 3.8). 78 HCV GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCC TGACCGCTCGGGCTCGGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCT GAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCGGGAGAGTACCCATGGAGTGAGAA TGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCGGAGTGATT GAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTG CCTGGAGTATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGG GGGCATACATAATGATGTTCCCTAACCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGT CTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGAGTGAGGTAGTAATAT CTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b Trong 3 mẫu không giải trình tự gen được thì có 2 mẫu có ARN-HCV thấp nhất là 1,1x102 và 4,2x102 và có 1 mẫu là 5,8x103. Như vậy tuy giải trình tự gen có xác định kết quả chính xác đến subtype tránh được sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 nhưng nếu định lượng 13 ARN-HCV có số copies< 103 thì ta không định được type, điều này cũng được các nhà sản xuất bộ kit và hóa chất khuyến cáo. Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng 40,74%. Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù hợp với đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều trị của bệnh nhân,do các genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các genotype khác (Genotype 1 thường điều trị trong vòng 48 tuần còn các genotype khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Qua kết quả nghiên cứu định genotype HCV bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real-time PCR cho tỉ lệ genotype 1 là cao nhất chiếm 66,23%, tiếp đó là type 6 chiếm tỉ lệ 30,7%, type 2 có tỉ lệ thấp nhất là 2,19%, type 3 không có trong 228 trường hợp nghiên cứu 2. Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu đã xác định là genotype 1 bằng kỹ thuật Real-time PCR giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1trong đó có 9 mẫu là type 1a và 7 mẫu là type 1b , có 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 trong đó 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h . Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 40,74%, tuy nhiên khi nồng độ virut thấp không làm được giải trình tự gen. KIẾN NGHỊ: 1. Vẫn có thể dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type khi nồng độ virut thấp. 2. Khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp Real-time PCR và có kết quả định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing). References Tài liệu tiếng viêt: 14 1. Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV”, Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh. 3. Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus viêm gan C (HCV) sử dụng chỉ thị 5’ UTR trên bệnh nhân viêm gan virus ở Hà Nội”, Tạp chí y học Việt Nam, 7, pp.29-36. 4. Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm và nhiệt đới, NXB y học. Hà Nội. 5. Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 6. Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội. 7. Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE cơ bản, hiện đại và cập nhật, NXB Y học, Hà Nội. 8. Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội. 9. Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội. 10. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB y học, TP Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh 11. Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth H., Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T. (2007), “ CD81 expression is important the permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus infection”, Journal of Virology, 81, pp.5036-5045. 12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H. (2005), “Intra-host evolutionary dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of General Virology, 86, pp.2781-2786. 13.Alter M.J. (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J Gastroenterol, 13(17), pp.2436-2441. 14. Batey R.G. (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of hepatitis C”, World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176. 15. Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K., Toida T., Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F. (2003), “ Cellular Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate”, The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp. 41003-41012. 15 16. Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C., Rouille Y. (2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis”, Journal of Virology, 80(14), pp.6964-6972. 17. Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L. (2005), “ The hepatitis virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift, and others”, Seminars in liver disease 2005, 25(1), pp.105-117 18. Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D. (1992), “ The declining risk of posttransfusion hepatitis C virus in fection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373. 19. Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J. (2002), “ Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell line”, Insttutde Biologie delille/ Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex, France. 20. Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K. (2010), “ Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-loop-mediated isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology Research, 4(23), pp.25802586. 21. Friebe P., Bartenschlager R. (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’ nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”, Journal of Virology, 76(11), pp.5326-5338. 22. Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R. (2005), “ Kissing-loop interation in the 3’ end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication”, Journal of Virology, 79(1), pp.380-392. 23. Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K. (2011), “New treds of HCV infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined from firt-time volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52. 24. Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H. (1999), “ Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the amplicon HCV test”, Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630. 25. Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V. (2008), “ Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and seretion”, Journal of Virology, 82(5), pp.2120-2129. 16 26. Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn J.M., Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P. (2001), “ Hepatitis C virus genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of Clinical Microbiology, 39(5), pp.1771-1773. 27. Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J. (2007), “ Hepatitis C virus p7 protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a replication-competent genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142. 28. Helle F., Dubuisson J. (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand Molecular Life Sciences, 65, pp. 100-112. 29. Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M. (1999), “ A phylogenetically conserved stemloop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus is required for cap-independent viral translation”, Journal of Virology, 83(2), pp.1165-1174. 30. Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma M. (1994), “ Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b region sequences”, Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051. 31. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A. (2003), “ Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retro viral particles”, 1230 York Avenue, New York. 32. James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D., Kenrad E. (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373. 33. Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V. (2007), “ Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383. 34. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. (1996), “ Identification of a highly conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”, Journal of Virology, 70(6), pp. 3363-3371. 35. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D., Neri B.P., deArruda M. (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in the United States by Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of Clinical Microbiology, 35(12), pp.3156-3162. 17 36. Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia J. (1999), “ High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of hepatitis C virus RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332. 37. Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-louis S., Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R. (2004), “ Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the Caribbean island of martinique: evidence for a large radiation of HCV for a recent introduction from Europe of HCV-4”, Journal of Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791. 38. McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S., Medgyesi G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-rasheed A.M. (1994), “ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors : an international collaborative survey”, Journal of Clinical microbiology, 32(4), pp.884-892. 39. Moradpour D., Cerny A., Heim M..H., Blum H.E. (2003), “ Hepatitis C: an update”, Swiss Med Wkly, 131, pp.291-298. 40. Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B. (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of General Virology, 84, pp. 2333-2341. 41. Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong B., Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman P. (2009), “ Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology, 83(2), pp.1071-1082. 42. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S. (1993), “ Classification subtype by phylogenetic analysis of the NS-5 rigion”, Journal of General Virology, 74, pp. 2391-2399. 43. Simmonds P. (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on”, Journal of General Virology, 85, pp.3173-3188. 44. Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al. (2005), “ Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp. 962-973. 45. Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M. (2006), “ The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology, 80(23), pp.11579-11588. 46. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al. (2001), “ Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710-721. 47. Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D. (2008), “ Comparative analysis of nearly full-length hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break through during antiviral 18 therapy: clustered mutations in three functional genes, E2,NS2 and NS5a”, Journal of Virology, 82(19), pp.9417-9424. 48. You S., Rice C.M. (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing partners and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195. Trang web 49. http://www.drthuthuy.com 50. http://www.HepatologyTextbook.com 51. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 19