Tài liệu Xác định hàm lượng phthalate trong dầu ăn bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ gc msms

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- MAI THỊ NGỌC ANH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PHTHALATES TRONG DẦU ĂN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP NỐI HAI LẦN KHỐI PHỔ GC - MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 MỞ ĐẦU Phthalates (PAEs) là các este của axit phthalic, được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp polyme. Phthalates được đưa vào sản xuất công nghiệp từ những năm 1920 với tư cách là chất làm dẻo nhựa PVC và sản lượng DEHP - một phthalate phổ biến nhất - đã bùng nổ trong năm 1931. Kể từ đó, PAEs tồn tại trong nhiều vật dụng hằng ngày như đồ vật bằng nhựa, nylon, đồ chơi trẻ em, hóa mỹ phẩm, thiết bị y tế [7]. Trong năm 2010, sản lượng PAEs toàn cầu ước tính 4,9 triệu tấn. PAEs không bền và bị thôi nhiễm trong quá trình lão hóa của vật liệu do chúng không tạo liên kết cộng hóa trị với nền [34]. Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đường hô hấp do hít phải và qua đường tiêu hóa do ăn uống. PAEs hiện diện ở khắp nơi: nước mưa, nước mặt, đất, trầm tích, không khí, bụi trong nhà, thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm béo [15]. Mortensen và cộng sự (2005) tìm thấy sự có mặt của PAEs trong sữa mẹ và nước tiểu của trẻ sơ sinh [20]. Theo dữ liệu từ Scopus, chỉ với từ khóa ―phthalate‖ đã cho ra kết quả hơn 8000 tài liệu liên quan từ năm 2010 đến 2018, điều này cho thấy tầm quan trọng và sự quan tâm của các nhà khoa học đến nhóm chất đặc biệt này. PAEs không tích lũy sinh học, nhưng sản phẩm oxy hóa của chúng là mono este phthalate gây ra nhiều tác hại đối với cơ thể con người và môi trường [37]. Chúng bị nghi ngờ gây ung thư gan, thận, cơ quan sinh sản, gây dị dạng, quái thai, biến đổi nội tiết trong cơ thể, …[32, 34]. Mức độ phơi nhiễm phthalate ở trẻ sơ sinh cao hơn đáng kể so với người trưởng thành khi so sánh tương quan theo trọng lượng cơ thể. Nghiên cứu nước tiểu của trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi cho thấy 80% mẫu phân tích chứa 7/9 monophthalate (thường có mặt trong các loại kem dưỡng da, bột talc dùng cho trẻ sơ sinh) [26]. Năm 2009, Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ USEPA 2009 [3] đã thêm 8 loại phthalate vào danh sách hóa chất đáng lo ngại, riêng DEHP ở nhóm các chất có khả năng gây ung thư mức độ 2 [47]. Ngày càng nhiều các quốc gia trên thế giới đã ban hành luật cấm lưu hành vật liệu có chứa phthalate tùy mức độ. Luật Hóa chất (REACH) của Hội đồng Châu Âu đã đưa 03 phthalate bao gồm DEHP, DBP và BzBP vào mục 52, phụ lục XVII từ năm 2007 1 nhằm hạn chế sản xuất, buôn bán và sử dụng chúng. Danh sách các phthalate bị cấm không ngừng tăng lên theo các năm. Chỉ thị RoHS 2 EU/65/2011 ban hành năm 2016 đã nhắc lại luật hạn chế về hàm lượng của DEHP, BzBP, DBP và DiBP < 0,1% (công bố từ 2011) và sẽ bị cấm trong tất cả các thiết bị điện và điện tử tính từ ngày 22/7/2019. Theo dự báo của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam có mức tiêu thụ dầu thực vật tính đến năm 2020 là 18,5 - 20 kg/người/năm và sẽ tăng theo các năm do xu thế phát triển nhanh của kinh tế và nhu cầu xã hội. Nhập khẩu dầu thô và dầu tinh luyện tính đến 2011 là gần 800 nghìn tấn, trong đó dầu cọ, dầu đậu nành chiếm đa số (70%). Việc xác định đồng thời nhiều loại phthalate trong dầu thực vật tại Việt Nam gần như chưa có, các nghiên cứu hầu hết chỉ tập trung vào một số phthalate điển hình như DEHP, DEP, DBP. Nhận thấy sự cấp thiết của việc tìm hiểu PAEs, các nghiên cứu đã được phát triển và ứng dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau [1, 11, 27, 35, 38, 39]. Phương pháp phân tích sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS cho phép xác định trực tiếp các phthalate dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và tính ổn định nhiệt của từng phthalate, được coi là phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao. Độ chọn lọc cao của detector MS/MS cho phép giảm nhẹ việc chuẩn bị mẫu, phép tích phân peak dễ dàng và nhanh hơn, từ đó đơn giản hóa việc xử lý dữ liệu, loại bỏ nhiễu có trong chế độ SIM và Scan, tăng hiệu quả phân tích cho GC, đưa ra kết quả tin cậy hơn. Độ nhạy cao khiến MS/MS có thể phân tích được những mẫu mà GC - MS không làm được, nền mẫu phức tạp càng thể hiện tính năng vượt trội so với GC - MS, đồng thời cho phép phân tích lượng mẫu bơm ít hơn vào cột, chu kỳ phân tích nhanh hơn. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích này, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Xác định hàm lượng phthalates trong dầu ăn bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS‖. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về các phthalate 1.1.1. Cấu trúc, phân loại các phthalate Phthalates (este axit phthalic - PAEs) là các este của axit 1, 2 - benzen đicacboxylic. Công thức cấu tạo chung của các phthalate như sau: Hình 1. Cấu trúc hóa học chung của phthalate PAEs được điều chế dễ dàng thông qua phản ứng giữa phthalic anhydrit và ancol mạch thẳng hoặc mạch nhánh (từ metanol, ancol chứa một đến hai cacbon cho đến ancol chứa nhiều cacbon như tridexy ancol). Hai nhóm R và R’ có thể giống hoặc khác nhau tùy thuộc ancol tham gia phản ứng, từ đó dẫn đến tính chất vật lý, hóa học, hoạt tính sinh học của các phthalate có sự khác biệt [33, 49]. PAEs được chia thành thấp và cao tùy thuộc khối lượng phân tử. Phthalate cao bao gồm những phân tử có từ 7 - 13 nguyên tử cacbon ở R và R’, có độ bền cao, phổ biến là diisononyl phthalate (DiNP), diisodecyl phthalate (DiDP), dipropylheptyl phthalate (DPHP). Phthalate thấp bao gồm những phân tử có 3 - 6 nguyên tử cacbon ở R và R’, phổ biến nhất là di (2-etylhexyl) phthalate (DEHP) và dibutyl phthalate (DBP). 1.1.2. Tính chất lý hóa của các phthalate PAEs là những chất lỏng dạng dầu, thường không màu, không mùi, dễ bay hơi, ít tan trong nước và CCl4 nhưng tan tốt trong các dung môi: metanol, acetonitrin, hexan, dầu thực vật, chất béo. Chúng cũng có thể tan trong máu và những dịch cơ thể có chứa lipoprotein. Khi tham gia vào thành phần của vật liệu polyme, phthalate cho phép các phân tử polyvinyl dài có thể trượt trên mặt của các phân tử polyvinyl khác, làm thay đổi tính chất của vật liệu: tăng độ bền, độ linh động, chịu được một số tác động môi 3 trường. Bảng 1 chỉ ra một số PAEs điển hình với tên gọi, cấu tạo và tính chất vật lý của chúng. Bảng 1.Tên gọi, cấu tạo và tính chất của một số PAEs điển hình Tên gọi Dimetyl phthalate Dietyl phthalate Viết KLPT tắt (g/mol) DMP CTCT Nhiệt Độ tan hóa hơi trong (oC) nƣớc 284oC 194,18 4 mg/L (25oC) Số hiệu CAS 131-11-3 1080 DEP 295oC 222,24 mg/L 84-66-2 (25oC) Di - n propyl DPP 318oC 250,29 - 131-16-8 phthalate Di - n butyl 11,2 DBP 340oC 278,34 mg/L phthalate (20oC) Di - iso- 6,2 butyl DiBP 320oC 278,34 Dicyclo DCHP 330,42 222°C phthalate Butyl benzyl 84-69-5 (24oC) phthalate hexyl mg/L 84-74-2 4,0 (24oC) 84-61-7 2,69 BzBP 370oC 312,36 mg/L (25oC) phthalate 4 85-68-7 Di - n hexyl 0,05 DnHP 186oC 334,45 mg/L phthalate (25oC) Di (2 - 0,27 etylhexy) DEHP 285oC 390,56 mg/L phthalate (25oC) Di - n - 0,022 octyl 385oC DNOP 390,56 mg/L 84-75-3 117-81-7 117-84-0 (25oC) phthalate PAEs bị nung nóng hoặc cháy tạo thành anhydrit phthalic có mùi khó chịu và độc. PAEs có phản ứng với các chất oxi hóa mạnh, với axit, kiềm và các hợp chất nitrat. 1.1.3. Ứng dụng của các phthalate và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm. 1.1.3.1.Ứng dụng của các phthalate [3, 14, 54] PAEs được sử dụng trong nhiều loại sản phẩm: chất kiểm soát độ nhớt, chất tạo gel, tạo màng, chất ổn định, chất phân tán, bôi trơn, kết dính, chất nhũ hóa. PAEs là hợp chất phụ gia quan trọng trong công nghiệp, nông nghiệp, vật liệu xây dựng, sản phẩm chăm sóc cá nhân, thiết bị y tế, các chất tẩy rửa, chất hoạt động bề mặt, bao bì, dụng cụ chứa đựng, đồ chơi trẻ em, mô hình đất sét, sáp, sơn, mực in, chất phủ dược phẩm, thực phẩm, trong công nghiệp dệt may, công nghiệp hóa mỹ phẩm như nước hoa, các loại kem, sơn móng tay, xà phòng, keo xịt tóc. Ngoài ra, PAEs cũng được tìm thấy trong các thiết bị điện tử hiện đại và các ứng dụng y khoa như ống thông và thiết bị truyền máu. PAEs được sử dụng rộng rãi từ những năm 1930, nhất là di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), diisodecyl phthalate (DIDP), và diisononyl phthalate (DINP). DEHP là chất làm mềm dẻo được sử dụng trên toàn cầu trong PVC do chi phí thấp. Benzyl butyl phthalate (BBP) được sử dụng trong sản xuất PVC bọt, hay các phthalate với mạch ngắn được sử dụng làm dung môi trong nước hoa và thuốc trừ sâu. Hiện nay, trong ngành công nghiệp sản xuất nhựa, 5 tiêu biểu như trong polyvinyl clorua (PVC), polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl acetates (PVA) và polyethylene (PE), PAEs chiếm từ 10 - 60% trọng lượng. Các nhóm cacboxyl phân cực đóng góp tạo nên tính chất vật lý của phthalate, đặc biệt trong các PAEs có mạch cacbon (ở R và R’) ngắn, nhờ đó tạo nên tính dẻo của vật liệu polyme thông qua cơ chế tương tác lưỡng cực giữa các trung tâm phân cực của phthalate (nhóm C = O) và các vùng tích điện dương của của chuỗi vinyl (trong PVC, thường nằm trên nguyên tử cacbon của liên kết C - Cl. Để cho tương tác này được thiết lập, các polyme thường được nung nóng chảy trong sự có mặt của chất làm dẻo. Từ đó tạo ra một hỗn hợp đồng nhất giữa polyme và chất làm dẻo, và cho phép những tương tác phân cực này xảy ra. Trong khi các PAEs tương tác với các phân tử polyme qua những liên kết lưỡng cực lỏng lẻo, PAEs liên kết với nhau bằng những liên kết hydro và lực liên kết Van der Walls. Do không hình thành liên kết cộng hóa trị với vật liệu nền, PAEs có thể dễ dàng bị đào thải trong quá trình lão hóa của vật liệu và gây ra những tác hại lớn cho con người và môi trường khi phân tán vào nước, đất, bầu khí quyển. Các PAEs mạch ngắn, như dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP) và dibutyl phthalate (DBP) thường được sử dụng trong mỹ phẩm, các sản phẩm chăm sóc cá nhân, nhựa epoxy, và các este xenlulo để làm tăng độ kết dính của sản phẩm. Các PAEs mạch dài như butyl benzyl phthalate (BBP), dicyclo hexyl phthalate (DCHP), di - n - octyl phthalate (DnOP), di - n - nonyl phthalate (DnNP), di - iso - decyl phthalate (DiDP) và diethyl hexyl phthalate (DEHP) được sử dụng rộng rãi như một hoạt chất làm dẻo trong ngành công nghiệp polyme để cải thiện độ mềm dẻo của vật liệu polyme tùy thuộc vào yêu cầu của vật liệu. Bảng 2. Ứng dụng của các phthalate điển hình trong cuộc sống PAEs DMP Sử dụng Các sản phẩm Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da, Chủ yếu làm dung môi dầu gội, sáp nến. 6 Chủ yếu làm dung môi, chất DEP Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da, cố định hương trong nước sáp nến, dầu gội đầu, thuốc trừ sâu. hoa Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da, DnBP sáp nến, dầu gội đầu, chất kết dính, Chủ yếu làm dung môi sơn, sàn vinyl, keo dán, sản phẩm chăm sóc xe hơi. BzBP Bao bì, cuộn bọc thực phẩm, thắt lưng, Chất làm dẻo cho PVC và giấy dán tường, rèm cửa, vòi hoa sen, làm dung môi mô hình đồ chơi. Keo dán cao su, chất bịt kín, sản phẩm DiBP Chất làm dẻo cho PVC và chăm sóc xe hơi, mỹ phẩm, mực và cao su, làm dung môi và thuốc nhuộm, thuốc trừ sâu, vật liệu chất cố định màu, mùi. bao bì thực phẩm, đồ trang trí nội thất, sơn, quần áo. Sàn, nắp chai, băng tải, ống nước, đồ DnOP Chủ yếu được sử dụng như chơi, giày dép, quần áo, thiết bị y tế một chất làm dẻo cho PVC (ống nhựa và chai đựng dịch tiêm tĩnh mạch). Da bọc ô tô, thiết bị điện tử, hệ thống DEHP Chủ yếu được sử dụng như ống nước, gạch lát sàn, mô hình, đồ một chất làm dẻo cho PVC chơi, găng tay, ống hút uống, chất kết dính, mực. DiNP DiDP Sơn và sơn mài, bao bì thực phẩm, Chủ yếu được sử dụng như quần áo, giày dép, da làm nội thất xe một chất làm dẻo cho PVC hơi, ván sàn. Chủ yếu được sử dụng như Dây điện, da cho nội thất xe hơi, ván một chất làm dẻo cho PVC sàn, nhựa PVC. 7 Ngoài ra do tính chất không tan trong nước nên chúng còn được sử dụng làm chất tạo đục trong các sản phẩm nước như thạch rau câu, sữa, nước ngọt... điển hình như DEHP và DINP được sử dụng trong thực phẩm thay cho dầu cọ. Tuy nhiên, lượng phthalate có trong thực phẩm còn có một lượng nhỏ là do bị thôi nhiễm từ vỏ bao bì bằng nhựa. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, phthalate có mặt trong sơn móng tay, keo vuốt tóc, dầu gội, kem dưỡng da, thuốc nhuộm tóc, son môi, phấn... Những chất này được thêm vào để tạo độ tươi mới, tạo độ mịn, hấp dẫn, sáng bóng hơn, bền lâu hơn, bám dính hơn. Chất DEP còn được dùng như một chất định hương trong nước hoa, giúp nước hoa giữ mùi thơm được lâu hơn và mùi không bị biến đổi trong các điều kiện thời tiết khác nhau. Trong ngành sản xuất các loại dụng cụ, thiết bị y tế, các phthalate thường có trong những túi nhựa đựng máu, dây truyền nước và hóa chất, ống thông tiểu, ống súc dạ dày, ... DEP được dùng như một chất trị bệnh ghẻ vì có tính diệt khuẩn (hiện không còn sử dụng để điều trị nữa), làm chất hóa dẻo trong bao phim viên thuốc, nhưng lớp phim bao này thường rất mỏng cộng với việc sử dụng hàng ngày chỉ một lượng nhỏ nên coi như lượng vào cơ thể không đáng kể. 1.1.3.2. Nguồn gốc phát tán các phthalate vào thực phẩm Phthalates trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất và do thôi nhiễm. PAEs hay được thêm vào trong nhựa cũng sẽ có mặt một lượng nhỏ trong các mẫu thực phẩm như DBP, BBP, DINP, DNOP, DIDP,... khi dùng vỏ hộp nhựa đựng đồ ăn nóng và nhiều dầu mỡ, hoặc cho quay nóng trong lò vi sóng. Tsumura (2001) đã chỉ ra rằng hàm lượng DEHP tăng lên trong thịt gà từ 80 µg/kg trước khi nấu đến 13,100 µg/kg sau khi rán trong chảo được tráng Teflon, và còn cao tới 16,900 µg/kg sau khi đóng gói [58]. Làm nóng thực ăn trong các vỏ bọc trực tiếp của đồ ăn nhanh tạo điều kiện rất lớn cho sự thôi nhiễm PAEs từ vật liệu bọc thức ăn. Trong khi kiểm tra các bữa ăn được chuẩn bị tại 3 bệnh viện tại Nhật cũng cho thấy việc sử dụng găng tay cao su cũng đóng góp 600 µg PAEs mỗi ngày. Các bữa ăn ở bệnh viện đó chứa trung bình khoảng 160 µg DEHP; 12,5 µg DEHA; 4,7µg DINP và 3,4µg BBP một ngày. 8 PAEs có trong thực phẩm không chỉ do thôi nhiễm từ vật chứa hoặc tiếp xúc. Những sản phẩm giàu chất béo như bơ, phomai, mayonaise... đều được thêm một lượng nhỏ PAEs vào để làm chúng trông tươi ngon và mịn hơn. PAEs ít tan trong các dạng thức ăn ít béo, chứa nước mà tạo thành dạng nhũ tương giữa hai hay nhiều pha trong một dạng thức ăn. Vì vậy PAEs thường được thêm vào nước hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó. Thực tế mặc dù PAEs bị cấm sử dụng trong các trường hợp như vậy, tuy nhiên theo Cục quản lý Thực phẩm và Thuốc Đài Loan, vẫn có những cơ sở sản xuất sử dụng PAEs để làm chất tạo đục để giảm giá thành so với các sản phẩm tự nhiên như dầu cọ, gum arabic... và tạo độ ổn định trong sản phẩm. Chủ yếu phthalate được dùng trong trường hợp này là DEHP và DINP. Thường thì các nhà sản xuất nếu có dùng các phthalate này trong thực phẩm thì cũng khó có thể ghi nó lên thành phần của thực phẩm đó vì nhiều lý do. 1.1.4. Độc tính của các phthalate Có rất nhiều đồ dùng chứa PAEs, do vậy nguy cơ bị nhiễm PAEs vào cơ thể rất cao. Mỗi một nguồn nhiễm khác nhau sẽ khác nhau về lượng và về tác động đến cơ thể. Sự hấp thu phthalate qua da (từ không khí và các sản phẩm chăm sóc cá nhân) sẽ di chuyển trực tiếp vào các mô và các cơ quan bởi hệ thống mao mạch. PAEs cũng có thể xâm nhập vào cơ thể người thông qua ăn uống hoặc tiếp xúc trực tiếp. Qua các thử nghiệm lâm sàng, phơi nhiễm qua da bởi phthalate thường được xác định là sự hấp thụ từ pha khí lên bề mặt của cơ thể tiếp xúc. Mức độ ảnh hưởng của mỗi phthalate tới động vật phòng thí nghiệm và con người đều khác nhau, trong đó có sự khác biệt cả về liều lượng cũng như con đường xâm nhập vào cơ thể sinh vật. Chưa có nhiều thử nghiệm về tác hại của PAEs đối với cơ thể con người. Tuy nhiên đối với những nghiên cứu trên động vật (cụ thể là chuột ở cả hai giới tính) đã cho ta thấy những kết quả đáng ngại về PAEs. Bell và cộng sự đã chỉ ra độc tính của PAEs này trên những con chuột được tiêm vào một lượng nhất định và nhận thấy tác hại đến hệ sinh sản từ năm 1982 [2]. PAEs càng thấp thì càng độc hơn 9 so với PAEs cao (gốc ancol từ C6-C9). Khi tiêm vào tĩnh mạch chuột, PAEs tích tụ lại trong phổi, gan và lá lách với những lượng khác nhau và dần làm mất chức năng của các bộ phận đó. PAEs gây xáo trộn nội tiết do can thiệp vào hệ nội tiết trong cơ thể [6]. Tiếp xúc với PAEs lâu dài sẽ làm tăng tỷ lệ mắc các đột biến như hở hàm ếch, dị tật xương và tăng tỉ lệ thai lưu ở vật thí nghiệm có thai [10, 12, 51]. Trẻ sơ sinh có nguy cơ phơi nhiễm PAEs ngay khi còn trong bụng mẹ [17] và đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của phthalate đối với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bao gồm hệ thần kinh và sinh sản [4, 30]. Các dẫn xuất phthalate được xác định là các xenoestrogen, do đó chúng sẽ là những chất làm rối loạn nội tiết (endocrine disruptors), cụ thể là làm rối loạn hệ thống hoóc môn giới tính và gây ra dậy thì trước tuổi ở cả bé gái lẫn trai [56]. Ở phụ nữ, nhiều nghiên cứu cho thấy các phthalates làm tăng nguy cơ lạc nội mạc tử cung (endometriosis) cũng như ung thư vú [21, 29, 31]. Trong một số nghiên cứu trước đây các nhà nghiên cứu đã chứng minh được rằng: DnBP, BBP, DEHP và DiNP có thể ảnh hưởng bất lợi đến hệ thống sinh sản nam giới [13, 48], DEP có thể gây tổn thương DNA trong nhân tinh trùng và các thông số tinh dịch của con người [9], DEHP có thể phá vỡ hệ thống nội tiết và gây ra sinh non ở người [8, 41], nồng độ cao của DEHP trong bụi nhà sẽ làm tăng tỷ lệ mắc bệnh hen suyễn và mức BBP cao làm tăng tỷ lệ viêm mũi và eczema ở trẻ em [5]. Tổ chức nghiên cứu về ung thư (IARC, 1982) đã công bố phthalate là một chất có thể gây ung thư cho con người như ung thư gan, tụy bởi khả năng kích hoạt, làm tăng chiều dài các chuỗi PPAR - α [18, 42]. Bảng 3. Các cấp độ rủi ro do phơi nhiễm PAEs theo thống kê của Heudorf [49] Mức độ PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD ngày) DEP Mỹ 7,00 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính 5,00 MRL tiếp xúc qua miệng mãn tính ATSDR 10 Mức độ PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD ngày) US-EPA 0,800 RfD phơi nhiễm mãn tính ATSDR 0,500 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính US-EPA 0,100 RfD phơi nhiễm mãn tính 0,060 TDI Mỹ DnBP Canada Health Canada Châu Âu CSTEE 0,100 TDI Mỹ US-EPA 0,200 RfD phơi nhiễm mãn tính Châu Âu CSTEE 0,200 TDI US-EPA 0,020 RfD phơi nhiễm mãn tính BBzP Mỹ 0,100 ATSDR Canada Health Canada MRL intermediate duration exposure 0,060 MRL phơi nhiễm mãn tính 0,044 TDI 0,050 TDI DEHP CSTEE 0,020 TDI với trẻ sơ sinh < 3 tháng và phụ nữ ở độ tuổi sinh sản Châu Âu ECB/EU 0,025 0,048 11 TDI với nhũ nhi 3 – 12 tháng TDI nói chung, trừ trẻ sơ sinh và nhũ nhi< 12 tháng, phụ nữ ở độ Mức độ PAEs Quốc gia Tổ chức (mg/kg/ MRL/TDI/RfD ngày) tuổi sinh sản Mỹ 3,00 MRL tiếp xúc qua miệng cấp tính 0,400 MRL nhiễm độc cấp tính ATSDR DnOP Châu Âu CSTEE 0,370 TDI DiNP Châu Âu CSTEE 0,150 TDI DiDP Châu Âu CSTEE 0,250 TDI Chú thích: ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry): Cơ quan đặc trách các chất độc hại và theo dõi bệnh tật, Bộ Y Tế Hoa Kỳ. CSTEE (Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment): Ủy ban khoa học về độc tính, độc tính sinh thái và môi trường. ECB (European Chemicals Bureau): Cục hóa chất châu Âu. EPA (Environmental Protection Agency): Cơ quan bảo vệ môi trường châu Âu. MRL (minimal risk level): cấp độ rủi ro nhỏ nhất; TDI (tolerable daily intake): mức dung nạp hàng ngày; RfD (reference dose): liều tham chiếu. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu và đối tƣợng nghiên cứu  Mục tiêu của bản luận văn này bao gồm các mục tiêu cụ thể sau: - Xây dụng quy trình phân tích đồng thời 10 phthalate trong mẫu dầu thực vật bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối 2 lần khối phổ. Nội dung bao gồm việc khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị GC - MS/MS, quy trình xử lý mẫu (dung môi, thời gian chiết, làm giàu mẫu) và thẩm định phương pháp (xác định đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng và độ chụm). - Áp dụng quy trình đã tối ưu để xác định các phthalates trong một số mẫu dầu thực vật bán trên thị trường ở Hà Nội. 12  Đối tượng được nghiên cứu trong bản luận văn này gồm có: - 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, DnHP, BzBP, DCHP, DEHP và DnOP. - 18 mẫu dầu thực vật, phân loại thành 3 nhóm: dầu tổng hợp, dầu đậu nành và dầu oliu. Các mẫu dầu tổng hợp và dầu đậu nành được đóng gói trong chai nhựa, mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh. 1.3. Các phƣơng pháp xác định phthalate Phương pháp phân tích PAEs trong thực phẩm gặp khó khăn do việc ô nhiễm PAEs có thể diễn ra ở khắp mọi nơi, ngay cả trong phòng thí nghiệm: dung môi, thuốc thử, dụng cụ nhựa, thủy tinh đều có chứa hoặc nhiễm PAEs. Hầu hết các loại thực phẩm đều tìm thấy lượng nhỏ PAEs. Do đó việc đánh giá mức độ ô nhiễm PAEs trong thực phẩm cần áp dụng biện pháp thích hợp để hạn chế tối đa nguồn ô nhiễm, đảm bảo chất lượng kết quả phân tích. Nhiều tài liệu cung cấp phương pháp đánh giá PAEs cụ thể đã được công bố [33]. Quá trình phân tích PAEs được chia làm hai bước: (1) xử lý mẫu thực phẩm và (2) phân tích PAEs trong mẫu. Các PAEs sẽ được chiết xuất khỏi mẫu thực phẩm sau đó được làm giàu trước khi đi vào hệ thiết bị phân tích. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị thí nghiệm được lựa chọn, sử dụng, bảo quản, làm sạch cẩn thận để giảm thiểu tối đa bị nhiễm PAEs từ bất kì nguồn nào khác có thể dẫn tới sai số thực nghiệm (kể cả những dụng cụ từ các khâu thu thập mẫu, xử lý đến các thiết bị phân tích). Phòng thí nghiệm phân tích PAEs cũng như các dụng cụ vật dụng trong phòng hay không khí, nhiệt độ phòng, cũng cần được kiểm soát nghiêm ngặt. Dụng cụ thí nghiệm cần được bảo quản trong bao bì (được làm bằng vật liệu không có chứa PAEs). Trước khi phân tích, các mẫu thường được chia thành các aliquots (tối đa 300 mL) đối với mẫu dạng lỏng. Mẫu dạng rắn được xay, nghiền đồng nhất, được bổ sung nước hoặc dung môi hữu cơ phân cực để PAEs di chuyển hết từ mẫu sang dung môi sau đó được chia nhỏ từ 0,1-10,0 g, tùy theo hàm lượng chất béo. 13 1.3.1. Xử lý mẫu trong phân tích PAEs Việc loại bỏ nền mẫu béo trước khi tiến hành phân tích PAEs là điều bắt buộc. Hầu hết các thí nghiệm đều sử dụng chiết lỏng - lỏng để phân tách PAEs ra khỏi nền mẫu do có ưu điểm đơn giản, chính xác, LOD nhỏ, độ thu hồi cao, tiết kiệm chi phí [25]. Dung môi chiết thường dùng là n - hexan, n - heptan, ACN, diclometan hoặc iso - octan, trong đó tối ưu nhất là n - hexan [27]. Trường hợp thực phẩm giàu chất béo dạng rắn thì dùng dung môi diclometan, hỗn hợp diclometan với cyclohexan, n - hexan, hỗn hợp n - hexan với aceton hoặc ACN để tăng độ chọn lọc từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN. Trước khi đưa vào hệ sắc ký để phân tích hàm lượng PAEs, mẫu phải được đồng nhất, loại nền và làm giàu. Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp chiết, lắc, trộn lẫn hay khuấy. Đối với mẫu rắn thường sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nước cất. Bước loại nền có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy PAEs. Nhiều nghiên cứu đã tách PAEs khỏi chất béo bằng cột chiết Biobeads SX3 hoặc PL - gel, rửa giải bằng hỗn hợp diclomethan cyclohexan [45, 53, 57]; hoặc dùng cột florisil, silica gel [52]. PAEs thường được chiết xuất từ nền mẫu lỏng như nước, đồ uống có cồn hoặc không cồn, dung môi chiết là clorofom, n - hexan, n - heptan hoặc iso - octan, sau đó thực hiện phân tích trực tiếp mà không cần xử lý làm sạch hay làm giàu. Hỗn hợp ACN hoặc ACN/H2O chủ yếu được sử dụng trong quá trình chiết xuất PAEs từ thức ăn rắn không béo. Trong trường hợp thực phẩm có chất béo, PAEs được chiết xuất cùng với chất béo trong diclo metan, hoặc trong hỗn hợp của n - hexan với aceton hoặc ACN để quá trình chiết xuất PAEs chọn lọc hơn. Chiết xuất có thể được thực hiện bằng cách lắc mẫu với dung môi chiết xuất hoặc hỗn hợp, hoặc bằng cách áp dụng siêu âm hoặc lò vi sóng. Việc chiết xuất làm sạch các mẫu thực phẩm lỏng không béo thường được thực hiện bởi quá trình chiết lỏng/lỏng (L/L). Phương pháp chiết này cũng có thể được áp dụng với việc làm sạch các mẫu thực phẩm rắn [16, 33, 58]. Trong trường hợp mẫu thực phẩm có chứa chất béo [33] có đề cập tới các phương pháp như sắc 14 ký gel thẩm thấu (GPC) làm một phương pháp được sử dụng rộng rãi. Quá trình được thực hiện trên cột silica, sử dụng Biobeads S-X3 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules,CA, USA) và diclometan/cyclohexan (1: 1 v/v) hoặc cyclohexan/ etyl axetat (tỷ lệ 1: 1 v/v) được sử dụng làm dung môi rửa giải. Các phương pháp chiết PAEs và các công trình liên quan trên các nền mẫu đa dạng được công bố từ những năm 2010, chủ yếu thực hiện trên các phương pháp như chiết pha rắn thông thường (SPE), chiết pha rắn phân tử đánh dấu (MISPE), chiết pha rắn từ tính (MSPE) chiếm hơn 60% các kĩ thuật chiết tách thường được sử dụng, theo sau đó là chiết lỏng lỏng (10%), QuEChERs (8%) và chiết pha rắn vi sóng (SPME, 7%). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách các phthalate ra khỏi nền mẫu dầu thực vật. Quy trình chiết tách sau khi tối ưu từng thông số được áp dụng vào xử lý các mẫu thực. 1.3.2. Phương pháp phân tích PAEs trên hệ sắc ký Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay nhờ độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó bay hơi, chất phân cực/ ít phân cực. Kỹ thuật phân tích này có ứng dụng rộng rãi trong xác định chất phụ gia, thuốc diệt cỏ, thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và môi trường như phương pháp sắc ký khí, sắc ký lỏng sử dụng các detector kết hợp khác nhau: detector UV, DAD, huỳnh quang, detector bắt điện tử. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. PAEs là este của axit phthalic với hai hoặc một rượu nào đó, do đó tính chất và cấu tạo của chúng có tính tương đồng cao. Vì là các este nên có thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích. Sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ khi phân tích PAEs cho hiệu quả cao. Ngoài ra có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định PAEs như detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID) tuy nhiên độ nhạy kém hơn. Sắc ký lỏng kết hợp sử dụng detector UV cũng có thể định lượng cũng như định tính được PAEs, tuy nhiên dùng HPLC - 15 UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải được kiểm chứng lại bằng một phương pháp mạnh hơn như ghép nối với MS. Sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS - Gas Chromatography Mass Spectometry) khi phân tích PAEs giúp đánh giá, phân tích định tính và định lượng tốt. 1.3.2.1 Các phương pháp sắc kí khí ghép nối detector khối phổ Phương pháp sắc ký khí phổ biến để xác định các phthalate là kết hợp với detector khối phổ hoặc hai lần khối phổ (GC - MS, GC - MS/MS). Các yếu tố cơ bản quyết định phép tách sắc ký PAEs bao gồm khí mang (loại khí mang, tốc độ khí mang), cột tách (thành phần pha tĩnh, độ phân cực pha tĩnh, bề dày lớp phim pha tĩnh, chiều dài cột tách) và chương trình nhiệt độ lò. Loại khí mang được sử dụng phổ biến nhất để tách PAEs là khí hiếm Heli, độ tinh khiết trên 99,99%, thường được duy trì ở chế độ đẳng dòng với tốc độ dòng từ 1,0 - 1,5 mL/phút. Bảng 4. Một số nghiên cứu PAEs bằng sắc ký khí ghép nối detector khối phổ TLTK Nền mẫu Cavalier Dầu oliu Đối tượng, phương pháp phân tích, tách chiết - e 2008 [46] Phân tích 6 PAEs: DMP, DEP, DBP, BzBP, DEHP và DnOP. - Làm sạch mẫu bằng sắc ký thẩm thấu gel (GPC) với pha động là cyclohexan: diclometan tỉ lệ 7: 3 (v/v) để loại bỏ các hợp chất cao phân tử có trong dầu oliu. Ba chế độ chạy (EI - MS/MS, CI - MS/MS và EI - SIM) đã được kiểm tra đối chiếu lẫn nhau. Kết quả cho thấy chế độ EI - MS/MS cung cấp dữ liệu tốt nhất. Đặc biệt, so sánh với phương pháp SIM phổ biến hơn đã chứng minh khả năng của detector MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc đều tăng. Kết hợp kỹ thuật GPC với detector MS/MS cho độ thu hồi từ 71,7% đến 112,2%; RSD < 9% cho thấy tính hiệu quả của phương pháp khi xác 16 định hàm lượng phthalates trong nền mẫu phức tạp. Barp, một số - Luigi mẫu dầu Mondell thực 09 loại PAEs được nghiên cứu là DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, BBP, DCHP, DEHP và DiNP + DiDP. vật - Hệ thiết bị sắc ký khí ghép nối detector khối phổ ba o - Viện đựng cực (GC - MS QQQ). Cột SLB 5ms N28465 - U (10m Hóa trong chai x 0,1mm x 0,1 µm), nhiệt độ lò 900C trong 5 phút, tăng phân lọ nhiệt 300C/phút đến 3100C. Nhiệt độ bơm 2800C, khí bằng tích (ĐH nhôm, mang He với tốc độ dòng 50mL/giây, detector MS ba Messin, thủy tinh cực. LOD 0,015 - 0,144ppm, LOQ 0,035 - 0,2ppm. Kết Italy) và nhựa quả cho thấy hàm lượng 7/9 loại PAEs trong mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh ở dưới giới hạn định [1] lượng (tuy nhiên lượng DiNP + DiDP lại cao nhất); DMP, DPP và BBP có nhiều nhất trong mẫu dầu hướng dương đựng trong chai nhựa; còn hỗn hợp dầu thực vật đựng trong chai nhựa có hàm lượng DEP và DEHP cao nhất. Tiêu Đồ chuẩn trẻ em CPSC - chơi - Đưa ra tiêu chuẩn xác định một số PAEs trong đồ chơi trẻ em. - Hệ thiết bị GC - MS. PAEs được chiết ra khỏi đối - tượng bằng dung môi THF và n - hexan. Với điều kiện C1001 - chạy GC - MS trên cột DB - 5MS 30 m × 0,25 mm ID 09.3 của × 0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy Hiệp hội liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ tiêu 2900C, áp suất 35 psi, từ 2 - 5 phút giữ ở 500 C, sau đó dùng an tăng 300C/phút tới 2800C, sau đó tăng 150C/phút tới toàn 3100C, giữ trong 4 phút. Thu được thời gian lưu của Hoa Kỳ các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 5,0 - 9,5 CH phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5 10,8 phút và của DNOP (m/z=279), DINP (m/z=293) 17 và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8. Có phân tích mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phương pháp. Hao- 15 loại - 07 phthalate (DEHP, DOP, DEP, DPP, DBP, BBP) và Yu- mẫu mỹ 04 paraben (Metyl paraben, Etyl paraben, Propyl Shen và phẩm cộng sự như: [55] paraben và butyl paraben). gel - Sử dụng cả hai phương pháp là sắc ký khí ghép nối dưỡng detector khối phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC tóc, kem ghép nối detector DAD. Sau khi đã được làm sạch với dưỡng da, cột chiết pha rắn C18, độ thu hồi 85-108%, RSD 4,2 - sữa 8,8%. Điều kiện tối ưu khi sử dụng GC - MS: mảnh cơ dưỡng bản m/z = 149 để định lượng các phthalate, còn m/z = thể,... 121 để định lượng các paraben. Thiết bị Agilent 6890N, bơm mẫu tự động ghép với detector MS, cột HP - 5MS 30 m × 0,25 ID × 0,25 µm, cột mao quản 5% diphenyl, 95% dimetyl polysiloxane, khí mang He. Chạy với gradient nhiệt: 1000C giữ trong 0,5 phút tăng từ từ 50C mỗi phút cho đến 2200C, tăng tiếp 100C một tới 2750C, giữ 5 phút. Tốc độ khí mang ở 1,0 ml/min. Tiêm mẫu ở 2500C. Khoảng tuyến tính của các chất phân tích nằm từ 0,54-100 mg/l. Các điều kiện khác như đồng nhất mẫu, lắc, rung ... đều được tối ưu. Zheng X Một số - Xác định 23 PAEs. và cộng mẫu thực - Chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí ghép nối detector sự [43] phẩm khối phổ. Các mẫu được chiết bằng n - hexan hoặc giàu chất acetonitril, làm sạch bằng cột chiết pha rắn ProElut béo PSA. Việc xác định và định lượng PAEs được thực hiện bằng chế độ chạy SIM trong GC - MS. Khoảng tuyến tính của PAEs từ 0,05 - 5,0 mg/L với hệ số tương quan R2 = 0,989 - 0,999(6). Giới hạn phát hiện PAEs 18 trong khoảng 0,005 - 0,05 mg/kg (S/N = 3) và giới hạn định lượng dao động từ 0,02 - 0,2 mg/kg (S/N = 10). Hiệu suất thu hồi (n = 10) từ 77 - 112% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 4,1% cho thấy tính phù hợp của phương pháp để định tính và định lượng 23 PAEs trong nền mẫu thực phẩm. Phương pháp sắc ký khí có ưu điểm là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detetor ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một lợi điểm quan trọng khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng được chúng. Chính vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để xác định phthalate trong dầu thực vật. Quá trình phân tích trên thiết bị GC - MS/MS được chia thành hai giai đoạn: - Giai đoạn tách các chất xảy ra trên cột sắc ký khí: Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (He) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi detector (detector). - Giai đoạn nhận biết, đo lường xảy ra trên detector khối phổ và bộ phận xử lý số liệu. Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào các nguồn ion của máy khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (CI, PI, EI, FI, FD,…), sau đó các ion được ghi nhận bởi bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện. Ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn chỉnh. Chế độ ion hóa - phân tách trong sắc ký khí có cơ chế là bớt hay thêm một electron, một proton, thêm hay bớt ái lực điện tử âm hay dương và tạo nhóm cũng như hướng tới tạo thành các ion khác. Ion hóa một phân tử là một quá trình tiêu hao năng 19