Tài liệu Xác định cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của việt nam phục vụ công tác chọn tạo giống​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT CẤN THỊ KHÁNH HUYỀN XÁC ĐỊNH GEN ỨNG VIÊN (CANDIDATE GENE) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ TRONG CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ ĐƢỢC GIẢI MÃ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2015 i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT CẤN THỊ KHÁNH HUYỀN XÁC ĐỊNH CANDIDATE GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ TRONG CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ ĐƢỢC GIẢI MÃ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Khuất Hữu Trung Hà Nội – Năm 2015 ii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, cô chú trong bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học, cũng như các thầy cô giáo của Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật đã trực tiếp giảng dạy, giúp em có những kiến thức vững vàng khi bước vào đời. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn sự chỉ bảo tận tình của thầy giáo TS. Khuất Hữu Trung đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt quá trình em làm luận văn tốt nghiệp này. Đề tài luận văn tốt nghiệp của em là: “Xác định cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ công tác chọn tạo giống”. Đây là đề tài có khối lượng công việc tương đối lớn, nhưng do thời gian thực hiện còn hạn chế nên không tránh khỏi thiếu sót. Vì vậy em rất mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và bạn bè để bản đồ án tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015 Sinh viên Cấn Thị Khánh Huyền iii LỜI CAM ĐOAN Luận văn này được thực hiện dưới sự hỗ trợ của Phòng Kỹ Thuật Di Truyền, viện Di Truyền Nông Nghiệp. Em xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Học viên Cấn Thị Khánh Huyền iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................... ii LỜI CAM ĐOAN .............................................................................. iii MỤC LỤC .......................................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................. viii DANH MỤC HÌNH ........................................................................... ix MỞ ĐẦU ..............................................................................................1 1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 3 2.1. Mục tiêu tổng quát ................................................................................ 3 2.2. Mục tiêu cụ thể ...................................................................................... 3 3. Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn............................................................. 3 3.1. Cơ sở khoa học ...................................................................................... 3 3.2. Cơ sở thực tiễn ...................................................................................... 4 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 4 4.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ......................................................... 4 4.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................5 1.1. Tổng quan về nghiên cứu bệnh bạc lá ở cây lúa .................................. 5 1.1.1. Bệnh Bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae. pv.oryzae) ........................... 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới. 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam . 9 1.2. Tổng quan về gen ứng viên (candidate gene) ..................................... 10 1.2.1. Candidate gene là gì? ....................................................................... 10 v 1.2.2. Các bước xác định candidate gene ................................................... 11 1.2.2.1. Chọn CG chức năng .................................................................. 11 1.2.2.2. Chọn CG vị trí ........................................................................... 11 1.2.2.3. Sàng lọc CG .............................................................................. 12 1.2.2.4. Xác nhận CG ............................................................................. 12 1.2.3. Tổng quan các phương pháp xác định candidate gene .................... 13 1.2.3.1. Phương pháp truyền thống ........................................................ 13 1.2.3.2. Phương pháp NBS-LRR (Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat)........................................................................................ 13 1.2.3.4. Ứng dụng candidate gene trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá ................................................................................................. 15 1.3. Tổng quan về thiết kế maker ................................................................ 16 1.3.1. Thiết kế mồi chung (degenerateprimer) ........................................... 16 1.3.2. Thiết kế marker dựa trên BlastDigester ........................................... 17 1.4. Tổng quan về chọn tạo giống nhờ ứng dụng của chỉ thị phân tử ..... 23 1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng .. 23 1.4.1.1. Ứng dụng MAS trong các chương trình chọn giống[4]............ 23 1.4.1.2. Ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)[4] ................................................................................. 25 1.4.2. Ứng dụng chị thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá .... 27 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 33 2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................... 33 2.1.2. Hoá chất........................................................................................ 34 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 35 2.2.1. Phương pháp xác định candidate gene ............................................. 35 2.2.2 Phương pháp thiết kế các marker ...................................................... 35 vi 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu để lai tạo nguồn vật liệu mang candidate gen ..................................................................................................... 38 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu để kiểm tra sự có mặt các candidate gen kháng bạc lá ....................................................................................... 39 2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số ........................................................... 39 2.2.4.2. Kỹ thuật PCR ............................................................................ 39 2.2.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................... 40 2.2.4.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide .................................................................................. 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................42 3.1. Kết quả xác định gen ứng viên (candidate gene) kháng bạc lá........ 42 3.1.1. Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên (candidate gene) xa5 ........................................................................................... 42 3.1.2. Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng candidate gen xa5 kháng bạc lá.................................................................................................. 47 3.2. Thiết kế marker xác định gen ứng viên kháng bạc lá xa5 ............... 51 3.3 Kết quả lai tạo nguồn vật liệu mang candidate gene xa5 kháng bạc lá .............................................................................................................. 56 3.3.1 Đặc điểm nông sinh học của các dòng bố và mẹ .............................. 56 3.3.2. Kết quả lai tạo F1 vụ 1 (Xuân 2014)................................................ 57 3.3.3 Kết quả lai tạo BC1F1 vụ 2 (mùa 2014) ........................................... 61 3.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của các candidate gene kháng bạc lá ở thế hệ con lai (BC1F1). ....................................................................... 63 3.4.1. Cặp lai An dân 11 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2.................................... 63 3.4.2. Cặp lai DT39- Quế Lâm x OM6377 ............................................... 64 3.4.3. Cặp lai Q1-8-1 x Chấn thơm ............................................................ 64 vii 3.4.4. Cặp lai OM6976 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2...................................... 65 3.4.5. Cặp lai Thủ đô 1 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2...................................... 66 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................68 4.1. Kết luận .................................................................................................. 68 4.2. Đề nghị .................................................................................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................70 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng1.1: Các giống lúa mang gen kháng bạc lá được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thương mại hóa ở Châu Á ........................................ 8 Bảng 1.2: Mã suy biến trong thiết kế mồi chung ................................................. 16 Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa bản địa đã được giải mã genome ................. 33 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 34 Bảng 2.3. Điều kiện phản ứng PCR ..................................................................... 40 Bảng 3.1. Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) gen/candidate gen xa5 .......................................................................................... 42 Bảng 3.2. Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/candidate gen xa5 .................. 45 Bảng 3.3. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các candidate gen xa5 ở các giống lúa đã giải mã ....................................................................................... 47 Bảng 3.4. Đặc điểm nông sinh học của dòng bố .................................................. 56 Bảng 3.5. Đặc điểm nông sinh học của dòng mẹ ................................................. 57 Bảng 3.6. Các tổ hợp lai tạo dòng F1 ................................................................... 58 Bảng 3.7. Các tổ hơp lai tạo dòng BC1F1 ........................................................... 61 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra candidate gen xa5 .................................................... 66 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các bước tạo marker CAPS với BlastDigester. ................................... 19 Hình 2.1. Thiết kế mồi PCR trong một khu vực được lựa chọn .......................... 37 Hình 2.2. Kết quả phân tích PCR được liệt kê trong Vector NTI Explorer......... 37 Hình 3.1. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng bạc lá xa5 của một số giống lúa bản địa (đoạn mất 35nu) ............................................. 50 Hình 3.2. Sơ đồ thiết kế mồi xa5_add35.............................................................. 54 Hình 3.3. Kết quả kiểm tra PCR đối với mồi xa5add35F/xa5add35R nhận biết gen xa5 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam .................................................... 55 Hình 3.4. Ruộng gieo mạ và ruộng cấy các nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ lai tạo F1 .......................................................................................................................... 59 Hình 3.5. Ghép cặp cho các tổ hợp lai ................................................................. 60 Hình 3.6. Bao cách ly sau khi khử nhị ................................................................ 60 Hình 3.7. Hạt lai sau khi thụ phấn 7 ngày ............................................................ 60 Hình 3.8. Cặp lai Q1-8-1x Chấn Thơm và An Dân x CNBN2 thế hệ BC1F1.... 62 Hình 3.9. Hạt lai BC1F1(D8 x OM6876) sau khi thu hoạch ............................... 62 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai An dân 11 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ..................................... 63 Hình 3.11. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai OM6377 x DT39- Quế Lâm với cặp mồi xa5add35 ........................................... 64 Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai Q1-8-1 x Chấn thơm với cặp mồi xa5add35 ........................................................ 65 x Hình 3.13. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai OM6976 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ................................. 65 Hình 3.14. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai Thủ đô 1 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ................................. 66 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa khác nhau trên thế giới. Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Để phòng trừ, người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng bệnh, trong đó chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được nông sản sạch. Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau đó phải xác định chính xác được số và thành phần các chủng hiện có ở mỗi vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống. Hiện người ta đã xác định được gần 40 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định như ở Philippin có 6 chủng, Ấn độ 9 chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây nhiễm các dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng[6]. Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, kháng mạnh và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo có một số nhược điểm như phụ thuộc vào môi trường, tốn thời gian, nhiều khi kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử DNA. Trên thế giới có khá nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên 1 công bố đã xác định được trình tự DNA của genom vi khuẩn Xoo, vòng genom dài 4,9 triệu bp, trong đó đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng dễ biến động, đây có thể là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau[18]. Cùng với phân tích toàn bộ hệ gen (genome-wide scanning), candidate gene (CG) là một cách tiếp cận khác để phân tích tỉ mỉ các tính trạng phức tạp và tính trạng số lượng. Mỗi cách tiếp cận có những thuận lợi và bất lợi riêng. Phân tích toàn bộ gen thường tiến hành mà không có bất kỳ giả định liên quan đến tầm quan trọng của tính năng chức năng cụ thể của các đặc điểm điều tra, nhưng tốn kém và cần có nguồn nhân lực chuyên sâu. Trong khi đó, cách tiếp cận bằng candidate gene đã được chứng minh là cực kỳ hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc di truyền của các tính trạng phức tạp, phương pháp này hiệu quả và kinh tế hơn nhiều so với phương pháp phát hiện gen trực tiếp. Nghiên cứu candidate gene, các gen có vai trò trong con đường sinh tổng hợp của tính trạng, có thể phát hiện ra một sự liên kết cung cấp thông tin về chức năng của nó theo con đường đó. Tương tự, nếu thất bại trong việc tìm kiếm liên kết với tính trạng quan tâm cũng cung cấp bằng chứng chống lại biến thể về chức năng trong con đường đó. Cách tiếp cận bằng candidate gene đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu bệnh di truyền, nghiên cứu di truyền liên kết. Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi chọn đề tài “Xác định cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ công tác chọn tạo giống” nhằm sử dụng kỹ thuật toán tin, sinh tin và các marker phân tử để nhanh chóng tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một số giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá và trực tiếp phục vụ sản xuất. 2 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Sử dụng tin sinh học khai thác được dữ liệu genome lúa bản địa của Việt Nam, xác định được các gen ứng viên (candidate gen) kháng bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định 1-2 gen ứng viên (trình tự, vị trí, bản đồ vật lí) đối với tính trạng kháng bệnh bạc lá có trong tập đoàn các giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã; - Thiết kế bộ chỉ thị phân tử mới (PCR based: các marker chức năng, các marker đặc hiệu SSR, SSLP, SNP/CAPs/dCAPs...) liên kết với candidate gen kháng bệnh bạc lá 3. Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn 3.1. Cơ sở khoa học Sử dụng các kỹ thuật toán tin, sinh tin và các marker phân tử để tạo cơ sở cho việc tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một số giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa kháng bạc lá trong sản xuất. Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa kháng bạc lá có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa kháng bạc lá ở mức phân tử. 3 3.2. Cơ sở thực tiễn Nghiên cứu để xác định các gen ứng viên kháng bạc lá góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao lại có khả năng kháng bệnh bạc lá, phù hợp với điều kiện canh tác lúa và cơ cấu sản xuất lúa ở các vùng khác nhau của Việt Nam. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu Tập đoàn giống lúa kháng bạc lá bản địa của Việt Nam đã giải mã và 5 tổ hợp lai: DT39 X An dân 11 X OM6377 CNBN2 OM6976 X CNBN2 Q1-8-1 X Thủ Đô 1 X Chấn Thơm CNBN2 4.1. Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu về lĩnh vực Tin - Sinh học, phân tích genome, các thí nghiệm về Sinh học phân tử, thiết kế marker được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nghiên cứu bệnh bạc lá ở cây lúa 1.1.1. Bệnh Bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae. pv.oryzae) Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất. Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên và thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn này cuối cùng đã được Ezuka (1974) xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên. Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ, Philippin, Indonexia, Trung Quốc . Bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân[13]. Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh. Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá. Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra. Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ cây lúa trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa[5]. 5 Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô. Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm điển hình sau đây: - Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá. - Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám. - Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng. Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện bên ngoài, nhất là ở mạ, do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý[1]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới Có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tạo giống lúa kháng bạc lá như: Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống và chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các dòng đẳng gen (Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai quy tụ (pyramiding) nhiều gen kháng hoặc nhiều QTL từ nhiều nguồn bố mẹ vào trong một giống. Cho đến nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện các 6 gen kháng về cả định lượng và định tính đã đặt nền tảng cho những nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh. Đối với bệnh bạc lá, các gen xa4, xa5, Xa7 và Xa21 được các chuyên gia lưu tâm nhất vì các gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng. Tại Ấn Độ, việc quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một tổ hợp gen đã được thực hiện và tạo ra được các dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu tốt để chuyển tổ hợp gen này vào các giống lúa thương mại tăng tính kháng bạc lá của các giống, dòng NH56 mang 4 gen (Xa4, xa5, Xa7 và Xa21)[24]. Trong chương trình lúa lai tại Trung Quốc, việc quy tụ các gen kháng bệnh vào các dòng phục hồi để tăng tính kháng của lúa lai cũng được quan tâm đặc biệt; các gen Xa7, Xa21 đã được quy tụ vào giống lúa Minhhue 63[29]. Trong các chương trình chọn giống sử dụng phương pháp lai trở lại, MAS giúp đẩy nhanh việc tích hợp các gen mong muốn. Chen và cs (2000, 2001) đã áp dụng MAS để cải thiện được tính kháng bệnh bạc lá của hai dòng phục hồi ưu việt là “6078” và “Minghui 63” nhờ quy tụ gen kháng Xa21 từ “IRBB21” vào 2 dòng phục hồi này. Các con lai có bố mẹ là các dòng phục hồi đã được cải tiến này có năng suất cải thiện đáng kể trong điều kiện dịch bệnh[11],[12]. Các gen xa5, Xa13 và Xa21 kháng mạnh với các chủng nấm bệnh bạc lá ở Ấn Độ đã được lai quy tụ vào giống lúa Indica (PR106) nhờ sự hỗ trợ của MAS (Singh và cs., 2001). Năm 2002, Indonesia đã thương mại hóa hai giống lúa Angke và Conde, là hai giống lúa có mang tổ hợp gen Xa4+xa5 và Xa4+Xa7 [8]. Các nhà chọn tạo giống Philippin cũng đã thành công khi tích hợp tổ hợp gen Xa4+xa5+Xa21 (có nguồn gốc từ giống NSIC Rc142 và NSIC Rc154) vào giống IR64 nhờ sự hỗ trợ của MAS[27]. Ở Trung Quốc, dòng lúa bất dục đực nhạy cảm với ánh sáng - 3418s[19], dòng duy trì R8006 và R1176[9],[10], và dòng Kang 4183[20] mang gen Xa21, có khả năng kháng bạc lá cao đã được phát 7 triển. Các gen Xa13 và Xa21 đã được tích hợp vào giống Pusa Basmati 1 nhờ sự hỗ trợ của MAS [16]. Cũng với giống lúa Pusa Basmati 1, ba gen xa5, Xa13 và Xa21 đã được tích hợp vào giống này và tạo ra giống Pusa Basmati 1 cải tiến. Đây là giống lúa đầu tiên được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của MAS đã được thương mại ở Ấn Độ vào năm 2007 [14]. Song song với những nỗ lực này, các nhà chọn tạo giống của Cục Nghiên cứu lúa gạo (DRR)cũng đã tích hợp 3 ba gen kháng bạc lá này (xa5, Xa13 và Xa21) vào giống lúa ưu tú SambaMahsuri nhờ sự hỗ trợ chỉ thị phân tử [26]. Pandey và cs (2013) đã cải tiến hai giống Basmati mẫn cảm với bệnh bạc lá (Taraori Basmati và Basmati 386) nhờ tích hợp hai gen Xa13 và Xa21 sử dụng kỹ thuật lai trở lại với sự hỗ trợ của marker (MABC) kết hợp với lựa chọn kiểu hình[23]. Bảng1.1: Các giống lúa mang gen kháng bạc lá đƣợc chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thƣơng mại hóa ở Châu Á Giống thƣơng mại Angke Giống gốc Tổ hợp gen Năm Quốc gia thƣơng mại IR64 Indonesia 2002 Xa4/xa5 Cơ quan nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu lúa Indonesia và Conde IR64 Indonesia 2002 Xa4/Xa7 NSICRc142 IR64 Xa4/Xa21 Philipin 2006 PSB Rc14 Xa4/Xa21 Philipin 2007 Zhong9A/R8006 Xa4/Xa21 Trung 2004 (Tubigan 7) NSIC Rc154 (Tubigan 11) 1 Guodao Quốc 8 Trung tâm Công nghệ Sinh học Viện nghiên cứu Nông nghiệp và lúa Philippin Phát triển nguồn Viện nghiên cứu gen Indonesia lúa Philippin (ICRR/ICABIOG Viện RAD) nghiên cứu Guodao 1 Guodao 1 Zhong8A/R8006 NeixiangIIA/R800 Xa4/Xa21 Xa4/Xa21 Sambha Mahsuri Xa21, Mahsuri cải xa5, tiến Sambha Xa13 Xa21, Mahsuri cải Pusa Basmati-1 tiến Quốc Trung 2004 lúa Quốc gia Trung Quốc 2006 (CNRRI) 2007 Ủy ban Chuyển Quốc 6 Sambha Trung Ấn Độ giao Giống Trung Ấn Độ xa5, 2007 ương Ấn Độ (CVRC) Xa13 Với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, nhiều giống lúa cải tiến mang nhiều gen kháng bệnh nói chung và bạc lá nói riêng đã và đang được chọn tạo. Tính đến nay, khu vực Châu Á đã có hơn 10 giống lúa kháng bệnh bạc lá đã được phát triển và thương mại hóa. Các giống này đều được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) [28]. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam Trước đây ở Việt Nam, các nhà chọn tạo giống thường sử dụng phương pháp nhân giống truyền thống để tạo ra các giống lúa kháng bạc lá. Tuy nhiên phương pháp này thường tốn thời gian và không phân biệt được kiểu gen dị hợp tử. Gần đây, với sự phát triển nhanh chóng cũng như là đặc điểm ưu việt của các chỉ thị phân tử, các nhà nghiên cứu của Việt Nam đã bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống. Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Thị Lang (2004) đã sử dụng các chỉ thị STS (RG556, RG136, pTA248), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164, RM190) để phát hiện các gen Xa21, xa5, xa13 trên các giống lúa địa phương và bố mẹ lai [22]. Lã Vinh Hoa đã sử dụng các chỉ thị Npb 181, P3 và RG 556 để phát hiện ra 9