Tài liệu Vsvh_ntphong

MỤC LỤC Tóm lược .................................................................................................... 2 Summary .................................................................................................... 3 Chương I: Mở đầu – Tổng quan về đề tài ................................................. 4 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................... 4 1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................... 4 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................... 5 1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................... 5 1.5. Những đóng góp của luận án .............................................................. 6 1.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học .................................................. 6 Chương II: Tổng quan tài liệu ................................................................... 7 2.1. Cố định đạm sinh học.......................................................................... 7 2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas ................................................ 7 2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas ............................................... 9 2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas ......................................... 10 2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa ......................................................... 10 Chương III: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu ........... 11 3.1. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 11 3.2. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................... 11 3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 12 Chương IV: Kết quả và thảo luận ............................................................. 13 4.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa .......................................................... 13 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm ............................................. 13 4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn ....................... 15 4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ..................... 17 4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ..... 21 Chương V: Kết luận và đề nghị ................................................................ 27 5.1. Kết luận .............................................................................................. 27 5.2. Đề nghị ............................................................................................... 27 Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án ............... 28 1 TÓM LƯỢC Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được như sau: Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất vùng rễ lúa của 13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco). Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 5 mg/l. Các dòng tổng hợp NH4+ cao được phân tích PCR-16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện Pseudomonas. Kết quả có 55/86 dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so với thang chuẩn. Tiếp tục phân tích PCR-nifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có đoạn gen nifH , đã phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với thang chuẩn. Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH để kiểm chứng lại khả năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính của nitrogenase thông qua phương pháp khử acetylene (ARA). Đánh giá hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch khoáng (không sử dụng đạm) trong 20 ngày. Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy cả 4 dòng này đều tương đồng di truyền 98-99% so với Pseudomonas stutzeri, 7 dòng này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia. Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố định đạm của 4 dòng vi khuẩn P. stutzeri PS1 (TG1), P. stutzeri PS4 (BT1), B. vietnamiensis BV3 (KG1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1). Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P. stutzeri PS4 và/ B. vietnamiensis BV3 đều cung cấp đến 50% đạm sinh học trong khi dòng P. stutzeri PS1 và/ B. vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa cao sản. Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa, đất vùng rễ, gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri 2 SUMMARY The aim of this study was isolation and selection Pseudomonas spp. strains with the high biological nitrogen fixation (BNF) ability to apply to high-yielding rice cultivated on the soil of the Mekong Delta. The results achieved as follows: One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples (rice rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta). All of them were able to synthesize NH4+, 86/150 isolates synthesized NH4+ higher than 5 mg/l. The effective isolates (high NH4+ biosynthesis) were analysed by PCR16S rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to identify Pseudomonas spp. The results showed that 55/86 isolates having band at 1500 bp in comparision to standard ladder; 32/55 isolates were determined nifH gene with PCR technique with specific primer PolF-115 and PolR-476 which had band at 361 bp in electrophoresis gel. Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through ARA method. Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s effectiveness on rice cultivated mineral solution free N in 20 days (invitro), the results showed that six isolates having high BNF ability manifested on height and dry weight of high-yielding rice. The results showed that four isolates were similarity of 98-99% with P. stutzeri. Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA from PCR-16S rRNA products, the results showed that all of them were 97100% similarity with species of the genus Burkholderia. The results of a field experiment showed that PS4 strain and/or BV3 strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen requirement for rice growth. Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia vietnamiensis, high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri, rhizosphere soil 3 CHƯƠNG I MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI Tính cấp thiết của đề tài Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha. Phân bón nói chung và phân đạm hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng. Để đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững. Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. Do đó, đề tài của nghiên cứu sinh được thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản. - Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng. 1.2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long dựa trên môi trường chuyên biệt, đồng 4 thời kiểm tra và nhận diện các dòng vi khuẩn bằng các phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử. - Xác định sự hiện diện gen nif và đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. đã phân lập được. - Chọn lọc các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. dựa trên cơ sở các thí nghiệm in-vitro và trong nhà lưới để tiến hành xác định hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn trên cây lúa cao sản trồng ở ngoài đồng. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm với cây lúa cao sản. Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. bản địa được phân lập từ đất vùng rễ lúa trồng ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu Long, có mang gen nif và có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản trồng ở trên đất phù sa Nông trường Sông Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 1.4.1. Thời gian nghiên cứu - Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 6919/QĐ-BGDĐT ngày 15/10/2008 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào tạo. - Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung là 4 năm (11/2008 – 11/2012), theo Quyết định giao đề tài và người hướng dẫn Nghiên cứu sinh số 468/QĐ-ĐHCT ngày 13/11/2008 của Hiệu Trưởng trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian nghiên cứu của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cương của đề tài: 11/2008 – 9/2011. 1.4.2. Địa điểm nghiên cứu - Các ruộng lúa được thu mẫu đất vùng rễ ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu Long. - Các phòng thí nghiệm Sinh học tế bào, Vi sinh vật đất, Sinh học phân tử, Chuyên sâu và Nhà lưới thuộc một số Khoa, Viện của trường Đại Học Cần Thơ. 5 - Ruộng lúa của ông Đào Văn Sơn, nông dân ở ấp 3, xã Thới Hưng (Nông trường Sông Hậu), huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ. Những đóng góp của luận án - Phân lập được 150 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long. Tất cả 150 dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp NH4+, góp phần tìm ra nguồn vi sinh vật cố định đạm sinh học cung cấp cho cây lúa cao sản. - Xác định được sự hiện diện của gen nifH ở 32 dòng vi khuẩn, trong đó có 11 dòng vi khuẩn triển vọng được giải trình tự DNA, gồm có 4 dòng vi khuẩn được xác định tương đồng 98-99% với Pseudomonas stutzeri, 5 dòng vi khuẩn được xác định tương đồng 98-100% với Burkholderia vietnamiensis và 2 dòng được xác định tương đồng 97% với Burkholderia kururiensis, trong đó có 1 dòng còn tương đồng 97% với Burkholderia brasilense.. - Có 4/6 dòng vi khuẩn triển vọng trong chậu được thí nghiệm chủng cho cây lúa cao sản. Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P. stutzeri PS4 (TG1) và/ B. vietnamiensis BV3 (KG1) đều có khả năng cung cấp đến 50%N trong khi dòng P. stutzeri PS1 (BT1) và/ B. vietnamiensis BV5 (CT1) đảm bảo được 25% nhu cầu đạm cho sự phát triển của cây lúa cao sản. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học - Đồng bằng sông Cửu Long hiện đang trồng nhiều giống lúa cao sản và những nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có sự hiện diện của Pseudomonas spp. ở vùng rễ của nhiều loại cây trồng trong đó có cây lúa cao sản. Vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas spp. đang được quan tâm, đặc biệt là tìm hiểu về khả năng cố định đạm với sự hiện diện của gen nifH ở các dòng vi khuẩn này. - Giá thành phân hóa học trên thị trường hiện đang tăng cao là gánh nặng cho nông dân, đồng thời việc sử dụng nhiều phân hóa học sẽ dẫn đến ô nhiễm môi trường, không đảm bảo sự phát triển bền vững, ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế xã hội. Do đó, nghiên cứu và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu, dễ nhân nuôi với giá thành rẻ bón cho cây lúa cao sản là hướng nghiên cứu cần thiết. 6 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cố định đạm sinh học 2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học Cố định đạm sinh học là quá trình khử N2 thành NH3 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase. Sau đó, NH3 có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành các acid amin và protein. Vi khuẩn cố định đạm có thể cộng sinh hoặc sống tự do nhưng cũng có thể nội sinh (Mattos et al., 2008). 2.1.2. Chu trình nitơ Chu trình nitơ là quá trình biến đổi của nitơ trong sinh quyển, trong đó nitơ xuất hiện dưới nhiều dạng tự do hay kết hợp (nitơ phân tử trong khí quyển, các nitrit, nitrat, amoni, protein, acid amin...). 2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ở vùng rễ lúa và những cây thuộc họ hòa bản đã giúp cây trồng phát triển tốt cũng như hạn chế đến mức thấp nhất lượng đạm hóa học trong nền sản xuất nông nghiệp (Kannaiyan, 1999). Hình 2.1. Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây 2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 2.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas Vi khuẩn Pseudomonas thường là vi khuẩn Gram âm, hình que. Có chiên mao ở cực nên có khả năng lội tốt trong nước, không có khả năng tạo 7 bào tử. Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi như trong đất, trong nước, thực vật, động vật, một số làm hư thực phẩm. Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có ôxi. Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 – 37oc. Hình 2.2. Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử (http:www.texbookofbacteriology.net/Pseudomonas.ect.html, ngày 19-92009) 2.2.2. Phân loại Pseudomonas Giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas có hơn 140 loài, hầu hết thuộc nhóm hoại sinh (Iglewski và Woods, 1983). Yabuuchi et al. (1992) lần đầu tiên đã tìm ra giống Burkholderia dựa vào việc phân tích di truyền rRNA nhóm II, trên cơ sở phân loại lại 2 loài Pseudomonas pickettii và Pseudomonas solanacearum được chuyển đổi từ giống Ralstonia. Việc phân loại lại một số loài Pseudomonas và đã đặt lại tên những loài này là Burkholderia (Yabuuchi et al., 1995). 2.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm Vi khuẩn Pseudomonas sp. phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều chủng loài (Rangarajan et al., 2001; 2002). Một số loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định từ lâu (Krotzky và Werner, 1987; Chan et al., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Vermeiren, 1999). Ngoài ra, Burkholderia vietnamiensis đã được xác định là loài có khả năng cố định đạm cho cây trồng nhờ hệ thống gen nif có khả năng tổng hợp enzyme nitrogennase (Menard et al., 2007). 8 2.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas Sử dụng môi trường đặc chủng Pseudomonas Isolation Agar 46,4g/l (Difco). Đồng thời, bằng kỹ thuật di truyền phân tích trình tự rRNA ribô thể - Kỹ thuật PCR-16S-rRNA gen, Mirza et al. (2006) đã xây dựng được cây di truyền của các nhóm loài Pseudomonas. 2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 2.3.1. Enzyme nitrogenase Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố định N2, khử N2 thành NH3. Enzyme nitrogenase được điều khiển tổng hợp bởi một hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. 2.3.2. Bộ gen (genome) của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase Genome và hệ thống gen nif của Pseudomonas Thông tin di truyền chuyên biệt về sự cố định đạm đã được xác định trong bộ genome của Pseudomonas stutzeri A1501. Đó là “vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) có kích thước 49kb, gồm 59 gen có liên quan. Thứ tự của các gen nif trong cấu trúc của “vùng cố định đạm” ở Pseudomonas stutzeri A1501 được khởi đầu là vùng PST1301, vùng giữa lần lượt bao gồm các gen nifQ – nifB – nifA – nifL - nifY2 – nifHDKTY – nifENX – nifUSV – nifWZM – nifF và vùng PST1360 ở đầu còn lại (Klipp et al., 2004) Sự điều khiển tổng hợp enzyme nitrogenase Theo nghiên cứu của Yan et al. (2008), hệ thống của gen nif ở Pseudomonas stutzeri A1501 là một hệ thống hoàn chỉnh gồm các loại gen nif quy định tổng hợp các thành phần cấu tạo nên phức nitrogenase. Hình 2.3. “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas stutzeri A1501 (Yan et al., 2008) 9 2.3.3. Cơ chế cố định đạm Trong thành phần cấu tạo nitrogenase, số nguyên tử Fe và nguyên tử S có thể không ổn định với acid. Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng vận chuyển e–, trong đó e– của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Mo-Fe. 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác cho tổng hợp glutamin từ NH3. Nếu trong hệ thống có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì ức chế sự tổng hợp nitrogenase (Van và Sloger, 1981). Phức hệ enzyme nitrogenase không bền khi có mặt oxy. Vi khuẩn tự do cố định đạm chỉ thể hiện hoạt tính ở điều kiện yếm khí nhờ sử dụng điện tử xuất hiện trong quá trình tổng hợp ATP để ngăn ngừa oxy xâm nhập. 2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn có khả năng cố định đạm cho cây lúa giúp tăng năng suất cây trồng từ 15-54% (Favilli et al., 1987; Omar et al., 1989). Ở Hy Lạp (mùa hè 1990) đã sử dụng phân đạm sinh học làm cho năng suất lúa tăng 15%-20%, sản lượng của bắp, lúa mì, lúa mạch tăng 3%-54% so với những vụ đối chứng không bón phân. Với những nghiên cứu chủng vi khuẩn cố định đạm trên lúa mì ở Mexico làm cho năng suất tăng từ 23%-63% và 24%-43% (Okon và Labandera-Gonzalez, 1994). 2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa Cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đều sử dụng đạm dưới hai dạng chủ yếu là ammonium (NH4+) và nitrat (NO3-) nhưng phổ biến là dạng ammonium (NH4+) (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Tùy theo giai đoạn sinh trưởng của cây lúa mà cây có nhu cầu đạm khác nhau. Ở các giai đoạn tăng trưởng thì đạm giúp cây tăng trưởng về chiều cao, tạo chồi, đẻ nhánh, tăng số lá trên cây và tăng diện tích lá. Trong cây lúa, đạm được tích lũy chủ yếu trong thân, lá và khi lúa trổ sẽ có khoảng 48 – 71% đạm được đưa lên bông. Trong giai đoạn sinh sản, đạm có vai trò trong việc tạo mầm hoa, tăng số hạt trên gié, tăng số gié trên bông và còn giúp tăng số chồi hữu hiệu. Nếu thiếu đạm, cây sẽ thành lập bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ hoặc hạt bị thoái hóa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). 10 CHƯƠNG III NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu “Phân lập và xác định vi khuẩn Pseudomonas spp. có mang gen nif cố định đạm hiện diện trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long và chọn lọc các dòng Pseudomonas spp. có độ hữu hiệu cao trên lúa cao sản”, các vấn đề đã được xây dựng cho quá trình thực hiện đề tài bao gồm những nội dung nghiên cứu như sau: - Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất quanh vùng rễ lúa bằng môi trường nuôi cấy đặc hiệu và nhận diện chúng bằng cặp mồi chuyên biệt dựa theo PCR-16S-rRNA. - Đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn để làm cơ sở chọn lọc các dòng vi khuẩn hữu hiệu, đồng thời xác định gen nif của các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. đã phân lập được. - Chọn lọc các dòng vi khuẩn hữu hiệu dựa trên các kết quả thí nghiệm về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và nhà lưới, tiến hành kiểm tra và đánh giá hiệu quả cố định đạm các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. trên cây lúa cao sản trồng ngoài đồng. 3.2. Phương tiện nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu Mẫu đất vùng rễ lúa được thu ở 13 tỉnh, thành thuộc đồng bằng sông Cửu Long và giống lúa OM2517. 3.2.2 Dụng cụ và thiết bị: ở phòng thí nghiệm vi sinh vật đất và sinh học phân tử 3.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Pseudomonas Isolation Agar 46.4g/l (Difco) (Mirza et al., 2006); Môi trường Burk lỏng không đạm (Park et al., 2005) Hóa chất trích DNA: Môi trường LB (Bennasar et al., 1998) Các hóa chất trong phản ứng PCR - Primer FGPS4-281bis Primer FGPS1509’-153 (Mirza et al., 2006) 11 - Cặp mồi xác định gen nifH là của Pseudomonas: PolF và PolR (Mirza et al., 2006) - Thiết kế cặp mồi nhận diện đoạn gen nifH của Pseudomonas stutzeri A1501 Hóa chất dùng để điện di sản phẩm PCR 3.3. Phương pháp nghiên cứu Thu mẫu đất vùng rễ lúa Thu mẫu đất vùng rễ lúa ở 13 tỉnh và thành phố thuộc đồng bằng sông Cửu Long, (thu 10 mẫu đất ở 10 ruộng lúa khác nhau ở mỗi tỉnh hoặc thành phố). Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa: Trải mẫu; Làm thuần, quan sát, mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn; Trữ mẫu ròng Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm; Đo hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside; Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA) Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992); Khuếch đại DNA với các cặp mồi nhận diện đoạn 16S rDNA, đoạn gen nifH của Pseudomonas và Pseudomonas stutzeri A1501; Điện di các sản phẩm PCR; Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR ; Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản: Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm với việc sử dụng dung dịch khoáng dành cho cây lúa (Kronzucker et al., 1999); Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản trồng trong chậu ở nhà lưới; Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng Thống kê, xử ký và phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft office Excel 2003 và Minitab để thống kê, phân tích số liệu thu được từ các kết quả thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Blast N có trong ngân hàng dữ liệu NCBI để so sánh tương đồng di truyền giữa các dòng vi khuẩn. Dùng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự DNA giữa các dòng vi khuẩn và sử dụng phần mềm Mega 5.0 để xây dựng cây phả hệ. 12 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa Mẫu đất vùng rễ lúa được thu nhiều đợt ở 13 tỉnh, thành thuộc đồng bằng sông Cửu Long, mỗi tỉnh, thành thu 10 mẫu đất ở 10 ruộng lúa khác nhau. Kết quả thu được 130 mẫu đất vùng rễ lúa ở 130 ruộng lúa phân bố đều trong mỗi điểm. 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm 4.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập Có tất cả 150 dòng vi khuẩn được phân lập trong đất vùng rễ lúa trên môi trường đặc hiệu Pseudomonas Isolation Agar (Difco) (Bảng 4.1). Từ một mẫu đất có thể phân lập được từ 1 đến 2 dòng vi khuẩn dựa vào màu sắc và hình dạng của khuẩn lạc. Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long STT Tỉnh/Thành phố Số lượng Số dòng Ký hiệu mẫu đất vi khuẩn dòng vi khuẩn 1 Vĩnh Long 10 18 VL1 – VL18 2 Trà Vinh 10 10 TV1 – TV10 3 Bến Tre 10 10 BT1 – BT10 4 Tiền Giang 10 12 TG1 – TG12 5 Long An 10 11 LA1 – LA11 6 Sóc trăng 10 12 ST1 – ST12 7 Bạc Liêu 10 10 BL1 – BL10 8 Cà Mau 10 9 CM1 – CM9 9 Cần Thơ 10 10 CT1 – CT10 10 Đồng Tháp 10 9 ĐT1 – ĐT9 11 An Giang 10 12 AG1 – AG12 12 Kiên Giang 10 17 KG1 – KG17 13 Hậu Giang 10 10 HG1 – HG10 Tổng cộng 130 150 4.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 24 - 48 giờ. Đa số các dòng vi khuẩn phân 13 lập được có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên; một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa răng cưa; kích thước khuẩn lạc từ 0,51,5 mm. Về tế bào vi khuẩn, đa số chúng có dạng hình que ngắn (dài 1,5 – 2,4 μm), một số rất ít có hình que dài (dài 2,5 – 3,4 μm) (Bảng 4.2). Bảng 4.2. Tỉ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn Đặc điểm Các loại Tỉ lệ Số lượng (%) khuẩn lạc Bao nhày Có 20 13,3 Không có 130 86,7 Trắng đục 80 53,3 Trắng trong 28 18,7 Màu sắc Vàng nhạt 24 16,0 Vàng đậm 17 11,3 Xanh nhạt 1 0,7 Nguyên 147 98 Dạng bìa Răng cưa 3 2 Độ nổi Mô 142 94,7 Lài 8 5,3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn Hình dạng Que ngắn 145 96,7 Que dài 5 3,3 Khả năng Có 150 100 chuyển động * Một số hình dạng khuẩn lạc Hình 4.1. Hình ảnh một số khuẩn lạc (Theo thứ tự từ trái qua phải là các dòng vi khuẩn TG7, BL4 và LA7) 14 Những đặc điểm nổi bật về đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn có chiên mao ở một cực phù hợp với những đặc điểm của nhóm vi khuẩn Pseudomonas theo mô tả của Sikorski et al., (1999) và Lalucat et al., (2006). Hình 4.2. Dòng VL2 được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 ở độ phóng đại 10000 lần Chiên mao 4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn 4.3.1. Khả năng tổng hợp NH4+ Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+, trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ tốt (trung bình từ 5 mg/l trở lên), 18/150 dòng có khả năng tổng hợp lượng NH4+ trung bình trên 10mg/l. Đặc biệt, có 4 dòng có khả năng tổng hợp hàm lượng NH4+ trung bình rất cao (trên 27mg/l) như 3 dòng từ Kiên Giang là KG8 (62,09 mg/l), KG1 (42,52 ml/l), KG14 (29,37 mg/l) và 1 dòng ở Cần Thơ là CT1 (27,12 mg/l). Bảng 4.3. Bảng tổng hợp sự phát triển và khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm Vi khuẩn phát triển trong môi trường Burk lỏng không đạm Mật số Số dòng (+) <107 tế 88 bào/ml (58,7%) (++), (+++) 62 ≥107 tế (41,3%) bào/ml Tổng cộng 150 Số dòng vi khuẩn tương ứng với mức tổng hợp NH4+ Mức <5 mg/l Có 49 dòng Có 15 dòng Có 64 dòng (42,7%) 15 Mức >5 mg/l Có 39 dòng (có 5 dòng >10 mg/l và không có dòng >25 mg/l) Có 47 dòng (có 13 dòng >10 mg/l và 4 dòng >25 mg/l) Có 86 dòng (57,3%) (có 18 dòng >10 mg/l và 4 dòng >25 mg/l) Qua kết quả về sự phát triển của các dòng vi khuẩn trong môi tường Burk lỏng không đạm và khả năng tổng hợp NH4+, có thể kết luận: (1) Hầu hết những dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường Burk lỏng không đạm đều có khả năng tổng hợp NH4+; (2) Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ cao thường phát triển tốt trong môi trường Burk lỏng không đạm, nhưng cũng có những dòng phát triển tốt trong môi trường Burk lỏng không đạm nhưng khả năng tổng hợp NH4+ cao không ổn định; (3) Có một số ít dòng vi khuẩn phát triển phát triển không cao (<107 tế bào/ml) trong môi trường Burk lỏng không đạm sau 2 ngày nuôi cấy nhưng lại có khả năng tổng hợp NH4+ hữu hiệu; (4) Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 25 mg/l đều là những dòng phát triển nhanh mật số trong 2 ngày nuôi cấy (++ và +++) trong môi trường Burk lỏng không đạm. 4.3.2. Hoạt tính nitrogenase Kết quả bảng 4.4 cũng cho thấy 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao nhất (TV5 và VL8) thì cũng có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất sau 2 ngày nuôi cấy (TV5: 43,78 mg NH4+/l; VL8: 37,86 mg NH4+/l). Bảng 4.4. Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) (đợt 1) Hàm lượng NH4+ và nitrogenase sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường Burk lỏng không đạm Các dòng vi khuẩn Hàm lượng NH4+ Hàm lượng nitrogenase (mg/l) (mM) LA4 6,32 e 0,236 bc LA9 17,40 cd 0,238 ab TG1 12,63 d 0,237 b TG8 6,42 e 0,219 e BT1 15,28 cd 0,237 b BT2 3,41 e 0,195 f TV5 43,78 a 0,239 a VL2 5,97 e 0,226 d VL3 20,59 c 0,236 bc VL8 37,86 b 0,239 a Đối chứng 0,02 f 0,001 g Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau ở từng cột thì không khác biệt nhau ở mức độ ý nghĩa 1% 16 Xét sự tương quan của dòng vi khuẩn CM1 có hoạt tính nitrogenase thấp nhất với khả năng tổng hợp NH4+ ở ngày thứ hai thì dòng vi khuẩn này là 1 trong 5 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ thấp nhất (HG4, CM1, ST7, BL5 và ĐT9). Kết quả bảng 4.5 cũng cho thấy trong 9 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao (AG9, KG8, KG14, HG4, KG1, ST7, BL5, ĐT9 và CT1) chỉ có 5 dòng có khả năng tổng hợp NH4+ cao (KG1, AG9, KG8, KG14 và CT1). Bảng 4.5. Hàm lượng NH4+ (mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 2) Hàm lượng NH4+ và nitrogenase sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường Burk lỏng không đạm Các dòng vi Hàm lượng NH4+ Hàm lượng nitrogenase khuẩn (mg/l) (mM) ĐT9 6,34 d 0,237 ab AG9 37,86 a 0,239 a KG1 41,19 a 0,238 a KG8 29,68 b 0,239 a KG14 26,59 bc 0,239 a HG4 8,94 d 0,239 a ST7 8,40 d 0,238 a BL5 7,93 d 0,238 a CM1 8,94 d 0,234 b CT1 19,80 c 0,237 ab Đối chứng 0,02 e 0,001 c Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau ở từng cột thì không khác biệt nhau ở mức độ ý nghĩa 1% Tóm lại, từ kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy cả 20 dòng vi khuẩn tổng hợp NH4+ cao đều có khả năng khử acetylen theo phương pháp ARA, cho thấy 20/20 dòng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tính nitrogenase. Điều này cũng phù hợp với kết quả tổng hợp NH4+ cao của 20 dòng vi khuẩn trên. Vi khuẩn cố định đạm là những dòng vi khuẩn có gen nifH quy định tổng hợp nitrogenase và hoạt tính của enzyme này. Tuy nhiên, sự cố định đạm sinh học có hiệu quả hay không còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả những yếu tố di truyền bên trong tế bào (hệ thống gen nif và các gen hỗ trợ) (Xie, 2006; Lalucat et al., 2006; Yan et al., 2008) và các yếu tố môi trường (Van và Sloger, 1981). 4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 4.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 17 Chọn 86 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ cao (>5 mg/l) khuếch đại đoạn 1500 bp của vùng 16S rDNA của Pseudomonas. Kết quả điện di được thể hiện trên gel agarose 1%, có 55/86 dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500bp so với thang chuẩn. Vậy có 55/86 dòng phân lập thuộc nhóm Pseudomonas qua sự thể hiện băng ở vị trí 1500 bp. (Hình 4.3). M LA1 LA2 LA9 TG1 TG8 TG9 TG12 BT1 BT2 BT10 TV2 TV4 TV5 TV10 VL2 1500bp 1000bp 500bp Hình 4.3. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn Pseudomonas với cặp mồi FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 (M: thang chuẩn 100bp plus) Khuếch đại đoạn từ 115 đến 476 của gen nifH ở Pseudomonas bằng cặp mồi đặc chủng PolF-115 và PolR-476. Kết quả đại diện ở hình 4.4 cho thấy 32 dòng có băng ở vị trí khoảng 360 bp theo thang chuẩn, tương ứng với đoạn gen nifH thuộc nhóm Pseudomonas, phù hợp với kết quả nghiên cứu mà Mirza et al. (2006) và Poly et al. (2001) đã báo cáo. Kết quả trên đã chứng minh rằng 32 dòng vi khuẩn có băng ở 360 bp đều thuộc nhóm Pseudomonas có mang gen nifH. M LA9 TG1 BT1 VL2 ĐT9 AG9 KG1 KG14 ST7 CM1 CT1 500bp Hình 4.4. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn với cặp mồi PolF và PolR xác định đoạn gen nifH ỏ vi trí 115-476 (Thang chuẩn 100bp) Sau đó, tiếp tục chọn 11 dòng vi khuẩn (bao gồm 6 dòng hiệu quả với cây lúa trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định đạm cao) để khuếch đại đoạn ở vị trí 5-580 của gen nifH ở Pseudomonas stutzeri A1501 bằng cặp mồi đặc chủng PST3422-5 và PST3422-580. Kết quả hình 4.7 cho thấy 4 dòng TG1, BT1, BT2 và AG9 có băng tương ứng ở 18 vị trí 575 bp so với thang chuẩn và tương đồng với băng của dòng đối chứng Pseudomonas stutzeri A1501. 1 2 3 4 5 6 1000 bp 575 bp 500 bp Hình 4.5. Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 5 dòng P. stutzeri A1501, TG1, AG9, BT2 và BT1 Ghi chú: 1: dòng P. stutzeri A1501; 2: dòng TG1; 3: dòng AG9; 4: dòng BT2; 5: dòng BT1; 6: thang chuẩn 100 bp plus 4.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI Sản phẩm PCR (với cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580) của 4 dòng vi khuẩn TG1, BT1, BT2 và AG9 cùng với dòng đối chứng Pseudomonas stutzeri A1501 được sử dụng để giải trình tự DNA và sử dụng phần mềm Blast N để so sánh với trình tự DNA của các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy dòng TG1 và BT1 tương đồng di truyền 98%, dòng AG9 và BT2 tương đồng di truyền 99% so với Pseudomonas stutzeri A1501 (CP000304.1) và Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (CP002881.1) có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Vì vậy, đề nghị đặt tên cho 4 dòng vi khuẩn này như sau: Dòng TG1: Pseudomonas stutzeri PS1; Dòng AG9: Pseudomonas stutzeri PS2 Dòng BT2: Pseudomonas stutzeri PS3; Dòng BT1: Pseudomonas stutzeri PS4 Ngoài ra, dòng đối chứng P. stutzeri A1501 được ký hiệu là PS5 So sánh trình tự DNA cũng cho thấy trong số 575 base nucleotide của gen nifH của 5 dòng P. stutzeri, hai dòng PS1 (TG1) và PS3 (BT2) chỉ khác nhau ở 3 vị trí nên có tương quan di truyền gần nhau và hình thành một nhánh. Trong khi đó, PS4 (BT1) chỉ khác PS2 (AG9) và PS5 19 (Pseudomonas stutzeri A1501) ở 8 vị trí nên cũng có tương quan di truyền gần nhau và cùng chung trong một nhánh của cây phả hệ (hình 4.6). 73 PS2_DH2c PS5_A1501 PS4_N2c_CAM PS1_18f PS3_17i 88 0.001 Hình 4.6. Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ về mặt di truyền giữa 4 dòng vi khuẩn với dòng chuẩn P. stutzeri A1501 Tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR từ cặp mồi FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để giải trình tự DNA của 7 dòng vi khuẩn có triển vọng và so sánh với các dòng vi khuẩn có trong GenBank. Kết quả cho thấy cả 7 dòng vi khuẩn này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia, trong đó có dòng VL2, VL8, CT1, KG1 và KG14 tương đồng di truyền 98-100% với Burkholderia vietnamiensis, dòng CM1 và KG8 tương đồng di truyền 97% với Burkholderia kururiensis. Ngoài ra, dòng KG8 còn tương đồng di truyền 97% với Burkholderia brasilensis. Căn cứ vào sự tương đồng di truyền, đề nghị đặt tên cho các dòng vi khuẩn như sau: - Dòng vi khuẩn VL2: Burkholderia vietnamiensis BV1 Dòng vi khuẩn VL8: Burkholderia vietnamiensis BV2 Dòng vi khuẩn KG1: Burkholderia vietnamiensis BV3 Dòng KG14: Burkholderia vietnamiensis BV4 Dòng vi khuẩn CT1: Burkholderia vietnamiensis BV5 Dòng vi khuẩn KG8: Burkholderia kururiensis BK1 Dòng vi khuẩn CM1: Burkholderia kururiensis BK2 20