Tài liệu Vai trò của ánh sáng trong sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái ở các cơ quan nuôi cấy của một số loài cây có giá trị kinh tế

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời sinh viên của chúng ta sẽ có những khoảng thời gian, những k ỷ niệm đáng nhớ. Đối với tôi những ngày thực tập và làm đề tài tốt nghiệp tại Viện sinh học Tây Nguyên thì không bao giờ quên được. Những ngày cuối cùng của thời sinh viên, tôi phải rời xa giảng đường, thầy cô và những người bạn thân thiết ở trường Đại học, tôi nghĩ m ình buồn lắm và gặp nhiều khó khăn khi ở một thành phố xa lạ. Nhưng khi đến với Viện sinh học Tây Nguyên tôi đã được sống trong một gia đình nhỏ có một người thầy đáng kính và những người bạn mới. Không khí ấm áp, đầy t ình thương mến của gia đình nhỏ này đã làm dịu bớt cái lạnh của đất trời Đà Lạt và cả cái lạnh trong lòng tôi. Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy, Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, người đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những định hướng, lòng say mê đối với lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật. Cảm ơn thầy đã dạy cho chúng em những b ài học quý báu về học vấn và kinh nghiệm cuộc sống. Những lời khuyên răng, dạy bảo của thầy đã giúp em nhận ra những khuyết điểm của mình để sửa chữa kịp thời ngày một tốt hơn, hoàn thiện hơn. Anh Nguyễn Bá Nam, một người thầy, một người anh trai đã hướng dẫn cho em những thao tác ban đầu, Đồ án tốt nghiệp 4 cho em những ý tưởng mới và tận tình giúp đỡ em vượt qua những khó khăn khi thực hiện đề t ài. Em rất trân trọng sự giúp đỡ của Ban l ãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học v à Môi trường - trường Đại học Nha trang, ban lãnh đạo Viện sinh học Tây Nguy ên cùng cán bộ, nhân viên Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài. Cảm ơn các anh chị: anh Tâm, anh Tùng, chị Phượng, anh Sơn, anh Tuấn, anh Công, anh Huy, chị Hằng và các bạn trường Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin: Thùy, Chiến, Nguyễn, Thu, Hương đã giúp đỡ tôi rất nhiều về mặt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến để đề tài của tôi được hoàn thiện. Cảm ơn tập thể lớp 47CNSH đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên và luôn quan tâm, động viên mình trong lúc làm đề tài. Cảm ơn bạn Thưởng đã luôn bên mình và giúp đỡ mình vượt qua nhiều khó khăn trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con nên người, cảm ơn chị hai rất yêu thương em, từ bỏ cả cơ hội làm giảng viên để em được thực hiện những mơ ước của mình. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc để con bước đi trong cuộc đời. Xin cảm ơn tất cả, dù đi đến đâu tôi cũng sẽ luôn nhớ về mọi người và sống xứng đáng với những t ình cảm của mọi người đã dành tặng. Đà Lạt, ngày 7 tháng 6 năm 2009 Nguyễn Thị Kim Loan Nguyễn Thị Kim Loan 4 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang 5 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DKT : Tối hoàn toàn DKS : Đèn neon LB : Đèn LED màu xanh LR : Đèn LED màu đỏ LR9B1 : 90% đỏ và 10% xanh LR8B2 : 80% đỏ và 20% xanh LR7B3 : 70% đỏ và 30% xanh PLB : Protocorm–like body PPFD : Cường dộ dòng photon quang hợp R:Fr : Tỉ lệ bức xạ đỏ: đỏ xa UV : Ultra violet (tia cực tím) BA : 6-Benzylaminopurine IAA : Acid indole-3-butyric Kin : Kinetin NAA : Acid -naphtaleneacetic TDZ : Thidiazuron 2i-P : Isopentenyladenines 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid MS : Murashige và Skoog, 1962 VW : Vacin – Went (1949) Nguyễn Thị Kim Loan 5 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tác động của ánh sáng lên thực vật Bảng 1.2. Tỉ lệ bức xạ R:Fr trong các loại môi tr ường khác nhau Bảng 1.3. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật Bảng 3.1. Số liệu thu được từ quá trình tái sinh chồi từ lá Torenia Bảng 3.2. Số liệu thu được trong quá trình nhân chồi từ lá Dâu tây Bảng 3.3. Số liệu thu được từ quá trình kéo dài chồi Dâu tây Bảng 3.4. Số liệu thu được từ thí nghiệm hình thành PLB từ phôi lan Hồ điệp Bảng 3.5. Số liệu thu được từ thí nghiệm tái sinh cây con của Địa lan Nguyễn Thị Kim Loan 6 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang 7 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây Dâu tây Hình 1.2. Sự đa dạng về màu sắc của hoa Torenia Hình 1.3. Hình thái cấu tạo hoa Địa lan Hình 1.4. Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của Địa lan Hình 1.5. Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của lan Hồ điệp Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái sinh chồi từ lá Dâu tây in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau Hình 3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nhau lên sự tái sinh chồi Torenia Hình 3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nh au lên sự tái sinh chồi Dâu tây Hình 3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác n hau lên sự kéo dài chồi Dâu tây Hình 3.4. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nhau lên sự hình thành PLB từ phôi lan Hồ điệp Hình 3.5. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nhau l ên sự tái sinh cây con từ PLB của Địa lan Nguyễn Thị Kim Loan 7 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 8 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục ................................ ................................ ................................ ................... i Danh mục chữ viết tắt................................ ................................ ............................ iv Danh mục hình ................................ ................................ ................................ ....... v Danh mục bảng ................................ ................................ ................................ ..... vi LỜI MỞ ĐẦU ................................ ................................ ................................ ...... vii 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................ ................................ .................. QUÁ TRÌNH PHÁT SINH C Ơ QUAN, PHÁT SINH H ÌNH THÁI VÀ QUANG PHÁT SINH HÌNH THÁI Ở THỰC VẬT ................................ .. 1 Sự phát sinh cơ quan và các y ếu tố ảnh hưởng................................ ............. 1 Phát sinh hình thái ................................ ................................ .......................... 3 Quang phát sinh hình thái ................................ ................................ ............. 5 TẦM QUAN TRỌNG CỦA ÁNH SÁNG L ÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO......................... 9 Ánh sáng với sự sống................................ ................................ ....................... 9 Vai trò của ánh sáng đối với thực vật ................................ ............................. 9 Những thành tựu đạt được trên thế giới khi sử dụng các nguồn sáng nhân tạo khác nhau trong nuôi cấy mô ................................ ....................20 MỘT SỐ NGUỒN SÁNG NHÂN TẠO Đ ƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT ................................ ................................ ...............23 Một số thiết bị tạo nguồn sáng nhân tạo hiện nay ................................ ...24 Nguyễn Thị Kim Loan 8 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 9 Một số nguồn sáng nhân tạo đ ược sử dụng cho nuôi cấy mô thực vật ...24 SƠ LƯỢC VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU................................ ...............28 Cây Dây tây (Fragaria vesca L.) ................................ ................................ ....28 Cây Torenia (Torenia spp.) ................................ ................................ ............32 Cây Địa lan (Cymbidium spp.) ................................ ................................ .......35 Cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis spp.) ................................ ............................. 39 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................ ................................ ..... ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ T ÀI................................ ....42 VẬT LIỆU ................................ ................................ ................................ ......42 Hệ thống nguồn chiếu sáng ................................ ................................ ............42 Đối tượng nghiên cứu................................ ................................ .....................42 Nguyên liệu thí nghiệm ................................ ................................ ..................43 Môi trường nuôi cấy................................ ................................ .......................43 Hấp khử trùng................................ ................................ ................................ 44 Điều kiện thí nghiệm ................................ ................................ ......................44 Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ................................ .....45 PHƯƠNG PHÁP ................................ ................................ ............................45 Bố trí thí nghiệm ................................ ................................ .......................45 Xử lý số liệu ................................ ................................ ............................... 49 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................ ................................ ........... THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự TÁI SINH CHỒI TỪ LÁ TORENIA................................ ................................ .....51 Nguyễn Thị Kim Loan 9 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 10 THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ LÁ V À SỰ KÉO DÀI CHỒI DÂU TÂY ................................ ..55 THÍ NGHIỆM 3: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự HÌNH THÀNH PLB TỪ PHÔI LAN HỒ ĐIỆP ................................ ..................62 THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN SỰ TÁI SINH CÂY CON TỪ PLB CỦA ĐỊA LAN ................................ ............................. 65 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................ ................................ ............71 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................ ................................ ..............73 PHỤ LỤC Nguyễn Thị Kim Loan 10 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang 11 Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Tiến trình phát triển của công nghệ sinh học của nuôi cấy mô thực vật trong bốn thập niên qua đã đạt được nhiều thành tựu nổi bật. Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây, rất nhiều ph òng thí nghiệm tư nhân, doanh nghiệp nhà nước cũng như các công ty nước ngoài đã đầu tư các cơ sở nhân giống với qui mô lớn. Những loài cây có giá trị kinh tế như lan Hồ điệp, Địa lan, Dâu tây… th ường được chú trọng trong vi nhân giống. Chất lượng các cây giống này phụ thuộc rất nhiều vào quá trình nuôi cấy in vitro. Hình thái và sinh lý của thực vật được nuôi cấy in vitro được điều hòa bởi các nhân tố vi môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng v à nguồn carbon. Ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong số đó, nó ảnh h ưởng đến toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật in vitro. Nhiều hệ thống đèn chiếu sáng đã được nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật như: đèn huỳnh quang, đèn halogen, đèn natri, đèn nóng sáng... G ần đây, đèn LED cũng đã được phát triển. Với các ưu điểm như tiêu thụ năng lượng thấp, tuổi thọ cao, có nhiều dải m àu, không phát ra tia UV, phát rất ít tia hồng ngoại, kích thước nhỏ dễ thay đổi trong thiết kế… đ èn LED có thể thay thế dần các nguồn chiếu sáng khác trong vi nhân giống. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề t ài “Vai trò của ánh sáng trong sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái ở các cơ quan nuôi cấy của một số loài cây có giá trị kinh tế”, nhằm tìm ra điều kiện chiếu sáng thích hợp cho từng giai đoạn phát triển của từng loại cây trồng (lan Hồ điệp, Địa lan, Dâu tây, Torenia). Hy vọng nghiên cứu này sẽ làm rõ thêm tác dụng của ánh sáng trong quá tr ình tái sinh, phát sinh hình thái, sinh tr ưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy in vitro. Nguyễn Thị Kim Loan 11 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 12 Phần 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nguyễn Thị Kim Loan 12 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 13 1.1. QUÁ TRÌNH PHÁT SINH CƠ QUAN, PHÁT SINH H ÌNH THÁI VÀ QUANG PHÁT SINH HÌNH THÁI Ở THỰC VẬT 1.1.1. Sự phát sinh cơ quan và các y ếu tố ảnh hưởng 1.1.1.1. Sự phát sinh cơ quan Mặc dù sự phát sinh cơ quan đã được ghi nhận từ rất lâu, nh ưng cho đến nay, cơ chế của nó vẫn chưa được hiểu biết thấu đáo. Rễ, chồi và hoa là những cơ quan có thể phát sinh từ nuôi cấy mô. Phôi không đ ược xem là một cơ quan do nó không có hệ thống mạch liền với cây mẹ. Skoog (1944) thấy rằng, thêm auxin vào môi trường giúp mô cấy tạo rễ, đồng thời ức chế tạo chồi; và ảnh hưởng ức chế này có thể được đảo ngược bằng cách thêm vào cả đường và phosphate hữu cơ. Nghiên cứu này của Skoog và cộng sự dẫn đến một giả thuyết rằng sự phát sinh c ơ quan được điều khiển bởi sự cân bằng giữa cytokinin và auxin. Cơ chế điều hòa phát sinh cơ quan có th ể được thấy rõ bằng cách nuôi cấy những lớp mỏng chỉ gồm vài lớp tế bào biểu bì và dưới biểu bì (Tran Thanh Van, 1980). Trong đó, ch ồi phát hoa, chồi sinh d ưỡng và rễ hình thành từ lớp cắt mỏng của một số loài khác nhau bằng cách điều khiển tỉ lệ auxin/cytokinin, nguồn cung cấp carbon và điều kiện môi trường. Rễ hình thành trong môi trường có NAA và Zeatin, còn sự hình thành chồi trong môi trường có Zeatin hoặc BA mà không có auxin. Ngoài tỉ lệ auxin/cytokinin, một số yếu tố khác cũng đ ược xác định là có ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan. Các chất có hoạt tính gibberellin th ường có khuynh hướng cản sự hình thành chồi và rễ, có thể do việc ức chế sự tổng hợp tinh bột. Ethylen được cho là có khả năng thúc đẩy sự phát sinh chồi. Đường thêm vào môi trường là nguồn cung cấp năng lượng hô hấp cho tế bào thông qua con đường thẩm thấu. Áp lực thẩm thấu nhẹ sẽ tạm thời tạo ra một số biến đổi sinh hóa, dẫn đến sự thay đổi tăng tr ưởng và phát sinh hình thái mô sẹo. 1.1.1.2. Sự phát sinh chồi bất định Nguyễn Thị Kim Loan 13 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 14 Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giống vô tính nhằm làm tăng số lượng cây con mong muốn. Các loại cây th ường được áp dụng phương pháp này để nhân giống như: Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium. Thật sự phương pháp tạo chồi bất định không được phổ biến như phương pháp nuôi cấy chồi bên vì số cây có khả năng tạo chồi bất định ít hơn. So với phương pháp nhân giống bằng cách cấy nốt đ ơn thân và phương pháp chồi bên thì phương pháp này có nhiều khả năng xảy ra đột biến. Có một số điểm giống nhau trong sự tạo chồi bất định và rễ bất định như: Các phần của cây non có khả năng tạo chồi dễ d àng hơn. Ví dụ trong nuôi cấy cây thuộc nhóm hạt trần, chồi bất định chỉ có thể tạo th ành từ phôi, cây con và các phần của cây con mà không xảy ra ở các mẫu cấy thu đ ược từ cây trưởng thành. Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ). Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi GA 3 và ABA. Trong nhiều trường hợp, ánh sáng kích thích sự tạo chồi. Cũng có tr ường hợp ngoại lệ là có một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: Chồi hoa của Freesia (Pierik, 1987), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik, 1987). Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các mẫu cấy lá của Pentunia hybryda tăng trưởng trong môi trường không có cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo nhiều chồi có trọng l ượng tươi lớn hơn được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nh ưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972) sự tạo chồi lại xảy ra ở nhiệt độ thấp. Pierik (1987) chứng minh rằng sự tạo chồi bất định của mẫu cấy tăng nhiều khi để cho lớp biểu bì dưới của phiến lá Kalanchoe farinacea tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy và rút ra kết luận rằng nếu đặt mẫu nằm trên môi trường thì sẽ tạo được nhiều chồi hơn là cây thẳng đứng. Nguyễn Thị Kim Loan 14 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 15 Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp. Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo chồi bất định như cây Cải luna lưỡng niên, rau Diếp xoăn, Cardamine pratensis (Pierik, 1987), Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972). Tuy nhiên, khi b ổ sung auxin hoặc cytokinin vào môi trường nuôi cấy thì những chất này cũng có tác dụng trên sự tạo chồi. Hầu hết các lo ài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953). Có một nhóm thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó l à trường hợp của Lilium (Van Aartijk, 1984). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với lượng auxin thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như: Thu hải đường (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965); cây Cải ốc biển (Horse radish) (Wurm, 1960); cây Mao địa hoàng (Dolfus và Nicolas – Prat, 1969); Atropobelladonna (Zenkteler, 1971) và cây Bông cải (Margara, 1969). Có thể kết luận rằng những cây n ày có nhu cầu về cytokinin và auxin cho sự tạo chồi bất định, nồng độ auxin thấp c òn cytokinin thì cao. BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạ o chồi ở nhiều loài thực vật và có thể sử dụng rộng rãi trên các loài hạt trần. Các loại cytokinin khác (Kin, 2i-P, BAP và Zeatin) cũng có thể được sử dụng nhưng ít hơn BA. Vitamin cũng có ảnh hưởng kích thích sự tạo chồi bất định ở hoa Anh thảo (Mayer, 1956; Stichel, 1959), cây Du (Jacquiot, 1951), cây Cải ốc biển (Wurm, 1960), Robinia (Seeliger, 1959). 1.1.2. Phát sinh hình thái Sự phát sinh hình thái là một quá trình sinh học do một cơ quan phát triển hình dạng của nó. Tuy nhiên, phát sinh hình thái là k ết quả của mối tương tác giữa những con đường hóa sinh và được xác định bằng cách cân bằng nhiều hệ thống. Sự khảo sát được thực hiện trên nhiễm sắc thể, chlotoplast hay mitochonria, sự thực hiện các thực nghiệm được xác định qua việc kết hợp hệ thống di truyền và những kích thích môi trường. Những hệ thống phát sinh h ình thái phụ thuộc vào loại hoạt Nguyễn Thị Kim Loan 15 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 16 động: phân chia và sinh trưởng tế bào, những hoạt động cảm ứng v à xác định (Bonner, 1965). Để đạt đến những vấn đề n ày, cần phải nghiên cứu biệt hóa chlotoplast qua kiểm soát nhân bào và plastome của nhân bào và qua thí nghiệm phát sinh hoa ở thể đột biến Arabidopsis. Quá trình phát sinh hình thái đã được nghiên cứu vào đầu thập niên 1900 với lý thuyết của Haberlandt là có thể tái sinh thành cây hoàn ch ỉnh từ tế bào sinh dưỡng (Haberlandt, 1902). Nhữ ng nghiên đầu tiên trên mô sẹo Thuốc lá của Miller và Skoog (Miller và Skoog, 1953; Miller và Skoog, 1957) cho th ấy auxin và cytokinin có thể dùng trong nuôi cấy phát sinh hình thái . Với những bước tiến về vi nhân giống và kỹ thuật di truyền, đã có hàng trăm loài thực vật được nuôi cấy thành công trên nhiều loại mô khác nhau và phát sinh hình thái (Bajaj, 1986). Có nhi ều loài thực vật khó nuôi cấy, không h ình thành rễ, chồi trong nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau. Việc phát triển các mô hình nuôi cấy tái sinh thành công ở những loài thực vật khó tái sinh sẽ hữu ích trong việc nâng cao tầm hiểu biết của chúng ta về những c ơ chế cơ bản điều khiển phát sinh h ình thái. Hầu hết những tế bào thực vật đều có tính toàn thế, hay khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sự thể hiện đặc tính này có giới hạn một cách tương đối ở những tế bào, được xác định bởi Torrey (1966) nh ư là những vùng mô phân sinh. Đây là những vùng tế bào có đầy đủ khả năng phát sinh h ình thái: Có khả năng thích ứng với môi trường nuôi cấy trong biệt hóa chồi, rễ hay phôi. Như vậy, để tái sinh cây, mô nuôi cấy cần phải có những v ùng mô phân sinh hay có nh ững tế bào có khả năng chuyển hóa thành những vùng mô phân sinh. Vùng mô phân sinh được phát hiện trong khối mô sẹo khi nó đ ược phát sinh trực tiếp bằng cách phân b ào là những cụm nhỏ có cấu trúc chặt, có hai cực, tế b ào có màng mỏng với nhân điển hình, tế bào chất đậm đặc và có không bào nhỏ. Nhu mô đỉnh sinh trưởng và phôi chưa chín thuần thục có chứa nhiều tế bào với hình dạng tương tự và những loài này có khả năng phản ứng với môi tr ường nuôi cấy có hormone (Ballade, 1972; Bonnett và Torrey, 1966; Kato và Ozawa, 1979). Nguyễn Thị Kim Loan 16 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 17 Đã có nhiều nghiên cứu ở các mức độ khác nhau về sự điều khiển phát sinh hình thái từ phân tử, tế bào và trên cây hoàn chỉnh. Sung (1986) báo cáo tập trung vào việc xác định những chỉ thị phân tử của phát sinh h ình thái. Mục đích nghiên cứu là nhằm xác định những chỉ thị phân tử đặc biệt đáp ứng quá tr ình phát sinh hình thái. Albersheim (1986) cho rằng có khả năng đưa các gene điều khiển tái sinh trực tiếp vào vật liệu nuôi cấy. Ammirato (1986) tập trung nghi ên cứu cơ chế điều khiển của các hormone ảnh h ưởng đến phát sinh ở mức độ tế b ào. Brown (1986) đạt được những vấn đề nghiên cứu trên cây hoàn chỉnh, tác giả cho rằng quá tr ình tái sinh mang tính chất di truyền và con người có thể vận dụng những tính chất tự nhiên này. 1.1.3. Quang phát sinh hình thái Thực vật có thể bị tác động bởi ánh sáng trực tiếp, chất l ượng ánh sáng, cường độ ánh sáng và quang kỳ. Ánh sáng gây ra tính h ướng ánh sáng, quang phát sinh hình thái, sự phân hóa lục lạp và các phản ứng khác của thực vật nh ư sự ra hoa và sự nảy mầm. Quang phát sinh hình thái được định nghĩa là những thay đổi về hình dạng và chức năng của một cơ quan dưới đáp ứng những thay đổi trong môi tr ường chiếu sáng. Quang phát sinh hình thái (sinh tr ưởng dưới ánh sáng) bao gồm sự phân hóa các lục lạp được phân hóa, tích tụ các chất diệp lục (chlorophyll) v à phát triển lá. Phát sinh hình thái có thể được cảm ứng bởi ánh sáng đỏ, đỏ xa v à ánh sáng xanh. Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực vật thông qua các quang thụ quan của cây (Kendrick v à Kronenberg, 1994). Th ực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ thể (photore ceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái, đó là:  Phytochrome (520 nm; đ ỏ/đỏ xa).  Các thụ quan nhận ánh sáng xanh gồm cryptochrome (340 – 520 nm; ánh sáng xanh UV – A), phototropin. Nguyễn Thị Kim Loan 17 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 18  Thụ quan hấp thu tia cực tím UV – B (290 – 350 nm) và UV – A. 1.1.3.1. Phytochrome – thụ quan ánh sáng đỏ và đỏ xa ở thực vật Phytochrome là một homodimer, trong đó mỗi phân tử protein xác định có trọng lượng khoảng 125 kDa với 1 128 amino acid, nối với một phân tử hấp thu ánh sáng khác (rhodopsin). Ở thực vật có 5 phytochrome l à PhyA, PhyB, PhyC, PhyD và PhyE với chức năng riêng biệt khác nhau. Các phytochrome cũng hấp thu tốt nhất các phổ (bước sóng) khác nhau. Các phytochrome hiện diện trong hai dạng có thể chuyển đổi qua lại :  PR khi nó hấp thu ánh sáng đỏ (R; 660 nm).  PFR khi nó hấp thu ánh sáng đỏ xa (FR; 730 nm). Có các mối quan hệ sau:  PR hấp thu ánh sáng đỏ chuyển đổi th ành PFR.  PFR hấp thu ánh sáng đỏ xa chuyển th ành PR.  Trong tối, PFR chuyển ngay thành PR. Ánh sáng mặt trời giàu tia đỏ (660 nm) hơn tia đỏ xa (730 nm), do vậy khi mặt trời lặn tất cả phytochrome ở dạng P FR, đây là dạng hoạt động mang tính sinh lý học, có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của các enzyme v à sự biểu hiện gene (Wang và cộng sự, 1991). Trong suốt ban đêm, P FR phần lớn chuyển thành P R và một phần bị phá hủy. Không thể tách riêng được hai dạng P R và PFR. Trong 100% ánh sáng đ ỏ có 85% P FR và 100% ánh sáng đỏ xa có 97% P R. Tỉ lệ cân bằng đỏ/đỏ xa được gọi là trạng thái quang cân bằng (photoationary). Chức năng của phytochrome Phytochrome có chức năng trong các đáp ứng ánh sáng v à quang kỳ của thực vật: phân hóa lục lạp từ proplastid, nảy mầm hạt, kéo d ài thân và ra hoa. Phytochrome là nhân tố trung gian trong sự đáp ứng ức chế kéo d ài trục hạ diệp của ánh sáng xanh. Nó có thể tham gia vào quá trình truyền tín hiệu của cry1. Tuy nhi ên Nguyễn Thị Kim Loan 18 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 19 sự ức chế kéo dài trục hạ diệp phụ thuộc cry1 có thể độc lập với phytochrome. Khi đó PhyA có thể hoạt động như một thụ quan của ánh sáng xanh, điều khiển quá trình mở rộng lá mầm dưới sự cảm ứng của ánh sáng xanh. Kiểm soát sự biểu hiện gene bởi ánh sáng Phytochrome kiểm soát sự phiên mã một số gene bao gồm tiểu ph ần nhỏ rubisco, protein gắn kết với chlorophyll a hay b v à enzyme ly giải phenylalanine ammonia. Dưới ánh sáng đỏ, tốc độ phiên mã của tiểu phần nhỏ rubisco có thể tăng lên 20 lần. 1.1.3.2. Các thụ quan ánh sáng xanh dương ở thực vật  Cryptochrome Cryptochrome hiện diện trong hầu hết các c ơ thể eukaryote bậc cao (thực vật, động vật và người) với sự đa dạng về số l ượng và kiểu loại. Ở thực vật nó hiện diện trong cây hai lá mầm, cây một lá mầm, dương xỉ, rêu và tảo. Cấu tạo và đặc tính của cryptochorme Hầu hết các cryptochorme thực vật l à các protein 70 – 80 kDa. Cryptochrome là một flavoprotein của nhân, khác với phytochrom e được chuyển đến nhân do áp lực của ánh sáng (Kircher và cộng sự, 1999), được xác định bởi phổ hoạt động của nó, là thụ quan ánh sáng xanh giống nh ư photoplyase, một enzyme có chức năng sửa chửa sai hỏng DNA dưới tác dụng ánh sáng (Gressel, 1979 ). Chức năng của crytochrome Cryptochrome không có hoạt tính sinh hóa, nhưng sự biểu hiện của gene crytochrome lại được điều hòa bởi ánh sáng bằng các cơ chế khác nhau từ sự phiên mã cho đến sự thoái hóa. Chức năng của cryptocchrome trong sự phát sinh hình thái thực vật chồng lấp với hầu hết các chức năng của phytochrome (nh ư ở Arabidopsis). Vai trò của cryptochrome ở Arabidopsis được thể hiện trong điều khiển phản v àng hóa, biểu Nguyễn Thị Kim Loan 19 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 20 hiện gene và ra hoa theo quang kỳ được biểu diễn bởi cả cry ptochrome và phytochrome, lần lượt đóng vai trò khởi đầu trong đáp ứng với ánh sáng xanh/UV – A và ánh sáng đỏ/đỏ xa.  Phototropin Cho đến nay, phototropin đã được xác định ở nhiều loài thực vật khác nhau, từ loài tảo xanh Chlamydomonas reinhardtii cho đến các loài thực vật bậc cao hơn (Briggs và cộng sự, 2001). Đặc điểm chung của phototropin Phototropin ban đầu được biết đến như một protein liên kết với màng sinh chất có trọng lượng 120 kDa, có thể cảm ứng quá tr ình phosphoryl hóa bởi ánh sáng xanh ở cây con Arabidopsis thaliana (Gällagher và cộng sự, 1988). Chức năng của phototropin Phototropin được xem là một họ quang thụ quan flavoprotein mới, điều khiển không chỉ sự quang hướng động ở thực vật, nó còn có vai trò quan trọng khác như: sự tích lũy lục lạp (Sakai và cộng sự, 2001), sự mở khí khẩu (Kinoshita và cộng sự, 2001) và ức chế nhanh việc khởi đầu sinh tr ưởng trục hạ diệp (Folta v à Spalding, 2001) ở cây Arabidopsis và chu trình sinh sản ở Chlamydomonas (Huang và Beck, 2003). 1.1.3.3. Các thụ quan tia cực tím (UV receptor) ở thực vật Tia cực tím làm tổn thương các tế bào thực vật, do vậy các tế bào tổng hợp các chất bảo vệ như flavonoid trong biểu bì và lớp siêu dính trong cutin. Những đáp ứng này được kích thích bởi tia UV – B, tia này không được nhận biết bởi một chromophore thật. Thay vào đó, tiểu phần D2 của quang hệ thống II (PSII) hấp thụ và bị phá hủy bởi UV – B, các chu trình này được cảm ứng bởi các sản phẩm thoái hóa. Chất bảo vệ flavonoid có màu vàng (flava Lat ), do đó hầu hết chúng hấp thu Nguyễn Thị Kim Loan 20 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Đồ án tốt nghiệp 21 ánh sáng (gồm cả tia xanh xa như UV). Flavonoid là ch ất chống oxy hóa (như vitamin A, C và E), thu gom các g ốc tự do. 1.2. TẦM QUAN TRỌNG CỦA ÁNH SÁNG L ÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT NUÔI CẤY 1.2.1. Ánh sáng với sự sống Từ xa xưa, ánh sáng đã có vai trò trung tâm trong nh ững vấn đề về vật chất và tinh thần của con người. Ánh sáng tương tác với những quá trình sinh học qua nhiều hình thức khác nhau, có thể chia th ành 3 phạm trù chính:  Thứ nhất, nó có thể gây hoại tử tế b ào hay cơ quan.  Thứ hai, ánh sáng là môi trường mà cơ quan sinh vật có thể nhận thông tin từ môi trường xung quanh; hơn nữa, ánh sáng là một nhân tố môi trường duy nhất điều khiển nhịp sinh học ở cả động vật v à thực vật.  Thứ ba, thực vật sử dụng ánh sáng trực tiếp cho sản xuất sinh khối. Như vậy, thông qua quá trình quang hợp, ánh sáng như là một nguồn khai sinh tất cả các dạng năng lượng sinh học (Hart, 1988). 1.2.2. Vai trò của ánh sáng đối với thực vật 1.2.2.1. Vai trò của ánh sáng trong quang hợp ở thực vật Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng là điều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra. Mọi sự sống tr ên trái đất không thể tách rời quá trình này. Thuật ngữ quang hợp chỉ rõ hai giai đoạn:  Quang (photo): Có nghĩa là ánh sáng, chỉ giai đoạn cần ánh sáng.  Hợp (synthesis): Có nghĩa l à đặc chung lại với nhau, chỉ sự tổng hợp đường (nhờ chu trình Calvin). Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùng năng lượng ánh sáng để tạo glucose v à phóng thích oxygen từ carbon dioxide và nước (plant phiology). Nguyễn Thị Kim Loan 21 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang 22 Đồ án tốt nghiệp Phương trình tổng quát của quang hợp ở thực vật được biểu diễn như sau: Ánh sáng, diệp lục 6 CO2 + 6 H2O C 6H12O6 + 6 O 2 Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ l à một phần nhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ. Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất. Những m àu này nằm trong vùng ánh sáng khả kiến có bước sóng trong khoảng từ 380 đến 750 nm. Khả năng kích thích các electron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùm sáng. Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu (Fried, 1995). 1.2.2.2. Ánh sáng với vai trò là một nhân tố môi trường Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo 2 cách hoàn toàn riêng biệt – như một nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin. Trong các nhân tố môi trường, ánh sáng đặc biệt ph ù hợp với vai trò thứ hai. Không giống các nhân tố như: trọng lực, nhiệt độ, nước, chất dinh dưỡng, gió, v.v… ánh sáng có thể truyền thông tin qua nhiều dạng khác nhau; trong đó, có t ối thiểu 4 đặc trưng: chất lượng, lượng, hướng và quang kỳ.  Chất lượng: Dạng năng lượng bức xạ, màu, quang phổ, thành phần bước sóng là tất cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánh sáng.  Lượng: Số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòng xác định rõ đặc trưng thứ hai này.  Hướng: Có sự đa dạng rất lớn giữa các môi tr ường sống khác nhau theo hướng chiếu sáng.  Quang kỳ: Mô tả sự khác nhau đều đặn do chu k ì ngày đêm và sự thay đổi độ dài ngày theo mùa. 1.2.2.3. Vai trò của các loại ánh sáng lên quá trình sinh trưởng và phát triển thực vật Nguyễn Thị Kim Loan 22 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang