Tài liệu ứng dụng vi khuẩn loại bỏ nitơ và vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong xử lý nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) ở bình 10 lít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG VI KHUẨN LOẠI BỎ NITƠ VÀ VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS) Ở BÌNH 10 LÍT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: PGS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP NGUYỄN VĂN QUẮC MSSV: 3092433 LỚP: CNSH K35 Cần Thơ, Tháng 05/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Cao Ngọc Điệp Nguyễn Văn Quắc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô giảng dạy chương trình ñại học Công nghệ Sinh học khóa 35, trường Đại học Cần Thơ ñã nhiệt tình giảng dạy và truyền ñạt những kiến thức về lĩnh vực Công nghệ Sinh học trong suốt quá trình tôi theo học tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn PGs.Ts. Cao Ngọc Điệp ñã tận tình hướng dẫn gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài. Chân thành cảm ơn thầy Trần Vũ Phương - cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học khóa 35 ñã luôn quan tâm, ñộng viên và tạo ñiều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện ñề tài. Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Tiến Sĩ – học viên cao học K18 ngành công nghệ sinh học thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Xin cảm ơn các cán bộ của phòng thí nghiệm Vi sinh vật ñất - Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện hết sức thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm. Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 35 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cần Thơ, ngày 29 tháng 04 năm 2013 Nguyễn Văn Quắc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) có hàm lượng ammonium và lân hòa tan (orthophosphate) quá cao sẽ gây hiện tượng nở hoa do sự phát triển quá nhiều của các loài tảo. Tuy nhiên có nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ, chúng chuyển ammonium thành nitrite (NO2-), nitrate (NO3-), khí nitơ (N2); nhóm vi khuẩn chuyển hóa lân hòa tan thành lân khó tan (polyphosphate) giúp làm sạch môi trường ñược gọi là vi khuẩn tích lũy polyphosphate (poly_P). Thí nghiệm sử dụng phối hợp vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn Bacillus subtilis dòng DTT1 ñể xử lý ammonium và orthophosphate trong nước thải chăn nuôi heo (sau biogas). Kết quả cho thấy sử dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b kết hợp Bacillus subtilis dòng DTT1 có bổ sung nguồn cacbon acid acetic (1ml/l) kết hợp với giá thể và sục khí ñạt hiệu quả cao làm giảm ammonium với hiệu suất loại bỏ ammonium là 98,2% và hàm lượng khí ammoniac (NH3) thoát ra trong quá trình xử lý thấp sau 18 ngày tiến hành thí nghiệm trong bình nhựa 10 lít chứa 5 lít nước thải chăn nuôi heo (sau biogas). Tuy nhiên do quá trình sục khí liên tục làm cho các vi khuẩn tích lũy polyphosphate lại phân giải các lân khó tan (polyphosphate) mà chúng ñã tích lũy tạo ra orthophosphate làm cho hàm lượng lân hòa tan tăng lên. Hàm lượng phospho tổng, COD trong nước thải giảm mạnh so với nước thải ñầu vào nhưng vẫn còn cao, hàm lượng TKN, TSS ñạt tiêu chuẩn loại A theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải QCVN 40: 2011/BTNMT. Từ khóa: ammonium, glucose, nước rỉ rác, orthophosphate, acid acetic, vi khuẩn khử ñạm, vi khuẩn tích lũy poly_P. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................... CẢM TẠ............................................................................................................................ TÓM LƯỢC .....................................................................................................................i MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG.....................................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... viii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ..............................................................................................1 1.1 Đặt vấn ñề ..............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu ñề tài ......................................................................................................2 1.3 Nội dung nghiên cứu..............................................................................................2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.........................................................................3 2.1. Tổng quan về nước thải chăn nuôi heo .................................................................3 2.1.1. Đặc ñiểm nước thải chăn nuôi heo.................................................................3 2.1.2. Hiện trạng ô nhiễm môi trường do chăn nuôi heo .........................................4 2.2 Sơ lược về nitơ và phospho ...................................................................................5 2.2.1. Sơ lược về nitơ ...............................................................................................5 2.2.2 Sơ lược về phospho.........................................................................................6 2.3 Sơ lược về vi khuẩn khử ñạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate .......................7 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn khử ñạm Pseudomonas stutzeri .....................................7 2.3.2 Sơ lược về vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis ........................9 2.5 Cơ chế xử lý nitơ và phospho trong nước thải bằng vi sinh vật .........................10 2.5.1 Cơ chế xử lý hợp chất nitơ bằng vi sinh vật .................................................10 2.5.2 Cơ chế xử lý hợp chất phospho bằng vi sinh vật ..........................................12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT 2.6 Sơ lược về Biogas ................................................................................................13 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................16 3.1. Phương tiện .........................................................................................................16 3.1.1 Vật liệu ..........................................................................................................16 3.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị..................................................................................16 3.1.3 Hóa chất ........................................................................................................17 3.1.3.a Môi trường nuôi vi khuẩn khử ñạm........................................................17 3.1.3.b Môi trường nuôi vi khuẩn tích lũy polyphosphate .................................18 3.1.3.c Các hóa chất sử dụng ñể ño ñạm ............................................................19 3.1.3.d Các hóa chất sử dụng ñể ño lân ..............................................................19 3.2 Phương pháp thực hiện ........................................................................................19 3.2.1 Phương pháp nhân giống vi khuẩn................................................................19 3.2.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................20 3.2.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ..............................................................22 3.2.3.a Đo ñạm NH4+ .........................................................................................22 3.2.3.b Đo lân hòa tan P_PO43- ...........................................................................24 3.2.3.c Đo pH......................................................................................................25 3.2.3.d Xác ñịnh mật số vi khuẩn bằng phương pháp ñếm sống........................25 3.2.3.e Xác ñịnh tổng ñạm (TKN) và tổng lân (TP)...........................................27 3.2.3.f Đo chỉ số TSS ........................................................................................30 3.2.3.g Đo nhu cầu ôxy hoá học ........................................................................31 3.2.3.h Xác ñịnh hàm lượng Nitrate (NO3-) và Nitrite (NO2-) ...........................32 3.2.4 Đánh giá chất lượng nước thải .....................................................................35 3.2.5 Phân tích mẫu và xử lý số liệu .....................................................................36 3.3.Thời gian và ñịa ñiểm thực hiện ñề tài ................................................................36 3.3.1 Thời gian .......................................................................................................36 3.3.2 Địa ñiểm ........................................................................................................36 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................37 4.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng ammonium (NH4+) .................................................................................................37 4.1.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng ammonium (NH4+) theo thời gian. ........................................................37 4.1.2 Hiệu suất xử lí ammonium (NH4+) trong nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) theo thời gian ở các nghiệm thức........................................................39 4.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng NH3 thoát ra ở các nghiệm thức theo thời gian...................................................40 4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng phosphate (PO43-) theo thời gian ở các nghiệm thức ..........................................42 4.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến giá trị Ph theo thời gian ......................................................................................................43 4.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng nitơ tổng (TKN) ...................................................................................................45 4.6 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng phospho tổng (TP) ...............................................................................................47 4.7 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến nhu cầu oxi hóa học (COD)...............................................................................................49 4.8 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng Nitrite (NO2-) ......................................................................................................50 4.9 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng Nitrate (NO3-).......................................................................................................51 4.10 Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến tổng chất rắn lơ lửng (TSS). ...............................................................................................52 4.11 Ảnh hưởng của acid acetic, glucose và sục khí ñến mật số vi khuẩn................54 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................55 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT 5.1 Kết luận................................................................................................................55 5.2 Đề nghị.................................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................56 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Đặc ñiểm nước thải chăn nuôi heo ở hộ dân......................................................3 Bảng 2: Thành phần nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) ñầu vào .............................15 Bảng 3: Thành phần 1 lít môi trường nuôi vi khuẩn khử ñạm ......................................17 Bảng 4: Thành phần 1 lít môi trường lỏng nuôi vi khuẩn tích lũy polyphosphate .......18 Bảng 5. Nghiệm thức thí nghiệm ..................................................................................20 Bảng 6: Thành phần của dãy ñường chuẩn NH4+ ..........................................................23 Bảng 7: Thành phần của dãy ñường chuẩn P_P2O5 ......................................................25 Bảng 8: Đường chuẩn xác ñịnh nitrite bằng thuốc thử Sunfanilamide .........................34 Bảng 9. Giá trị giới hạn các thông số và nồng ñộ chất ô nhiễm theo QCVN 40:2011/BTNMT ................................................................................................35 Bảng 10: Hiệu suất xử lí ammonium (NH4+) trong nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) theo thời gian ở các nghiệm thức ....................................................39 Bảng 11: Mật số vi khuẩn ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn..............................54 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Chuỗi cấu trúc của polyphosphate......................................................................7 Hình 2. Tổ chức của các gen tham gia vào quá trình khử nitrate của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri ...........................................................................................8 Hình 3: Mô hình bố trí thí nghiệm xử lí nước thải chăn nuôi heo ở bình 10 lít ............21 Hình 4. Phương pháp ñếm sống và nhỏ giọt .................................................................26 Hình 5: Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng ammonium (NH4+) theo thời gian ............................................................37 Hình 6: Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng NH3 thoát ra theo thời gian ......................................................................41 Hình 7: Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến hàm lượng phosphate hòa tan (PO43-) theo thời gian ở các nghiệm thức...................42 Hình 8: Ảnh hưởng của vi khuẩn, glucose, acid acetic và sục khí ñến pH theo thời gian ở các nghiệm thức. ......................................................................43 Hình 9: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng nitơ tổng (TKN) .......................................................................................46 Hình 10: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sụt khí ñến hàm lượng phospho tổng (TP)..................................................................................47 Hình 11: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến nhu cầu oxi hóa học (COD).....................................................................................49 Hình 12: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến hàm lượng Nitrite (NO2-)..........................................................................................50 Hình 13: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sụt khí ñến hàm lượng Nitrate (NO3-) .........................................................................................51 Hình 14: Ảnh hưởng của vi khuẩn, acid acetic, glucose và sục khí ñến tổng chất rắn lơ lửng (TSS) ......................................................................................53 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ ñược viết tắt ATP Adenosine triphosphate ADP Adenosine diphosphate BOD Biochemical Oxygen Demand CFU Colony forming unit COD Chemical Oxygen Demand EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid MNP Most Probable Number OD Optical Density PAO Phosphorus acccumulating organism TKN Total Kjeldahl Nitrogen TP Total Phosphorus TSS Total Suspended Solids VSS Volatile suspended solid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn ñề Hiện nay, tốc ñộ ñô thị hóa nhanh cùng với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực chăn nuôi, các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, chế biến các sản phẩm sinh học…tạo ra số lượng lớn chất thải rắn, nước thải. Các chất thải, nước thải ñưa ra môi trường sẽ gây ảnh hưởng xấu ñến môi trường sống. Trong chất thải, nước thải có rất nhiều thành phần như polysaccharide, các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ, phospho,…trong ñó, nitơ và phospho ñã ñược nhận ra là phân tử cơ bản của sự sống, quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của tảo và các loại thực vật nước trên các dòng sông, các hồ và các vịnh nông gần bờ. Dòng thải xuất phát từ nước thải ñô thị và nước thải công nghiệp ñưa vào trong nguồn nước bề mặt làm tăng thêm quá trình phú dưỡng ở các hồ, ao…làm giảm lượng oxy trong nước ảnh hưởng xấu ñến ñời sống của ñộng vật nước, làm giảm giá trị sử dụng của nước (Oldham et al., 2002; Jiang et al., 2004). Nguồn nước thải chăn nuôi heo là một nguồn nước thải có chứa nhiều hợp chất hữu cơ, virus, vi trùng, trứng giun sán… Nguồn nước này có nguy cơ gây ô nhiễm các tầng nước mặt, nước ngầm và trở thành nguyên nhân trực tiếp phát sinh dịch bệnh cho ñàn gia súc. Đồng thời nó có thể lây lan một số bệnh cho con người và ảnh hưởng ñến môi trường xung quanh vì nước thải chăn nuôi còn chứa nhiều mầm bệnh như: Samonella, Leptospira, Clostridium tetani,…nếu không xử lý kịp thời. Bên cạnh ñó còn có nhiều loại khí ñược tạo ra bởi hoạt ñộng của vi sinh vật như NH3, CO2, CH4, H2S, . . .Các loại khí này có thể gây nhiễm ñộc không khí và nguồn nước ngầm ảnh hưởng ñến ñời sống con người và hệ sinh thái. Nhiều hộ chăn nuôi ñã ñầu tư xây dựng hầm khí sinh học biogas nhầm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước và tận dụng nguồn phân thải. Nhưng thực tế, sau quá trình phân hủy này các thành phần gây ô nhiễm môi trường vẫn còn ở mức cao. Với nồng ñộ chất dinh dưỡng và chất hữu cơ vượt mức cho phép, nước thải ñầu ra của hầm biogas (nước thải sau biogas) góp phần làm suy giảm môi trường của nguồn tiếp nhận, kích thích sự phát triển của rong rêu, tảo,... gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa (eutrophication) làm bẩn nguồn nước, gây thiếu hụt oxy hòa tan (DO) trong nước, khí Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT ammoniac cao còn ñộc ñối với thủy sinh, hàm lượng nitrate cao sẽ gây nguy hại ñối với môi trường và con người. Vì thế, việc tiếp tục xử lý nước thải sau biogas trước khi thải ra môi trường là rất cần thiết và cần phải xử lý ñồng thời nhiều tác nhân gây ô nhiễm, ñặc biệt là chất hữu cơ, nitơ và phospho. Vì vậy việc ứng dụng vi khuẩn loại bỏ ñạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphat ñể xử lý nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) là rất cần thiết. 1.2. Mục tiêu ñề tài Sử dụng vi khuẩn khử ñạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate ñể chuyển hóa amonium và orthophosphate trong xử lý nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) ở qui mô bình 10 lít 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác ñịnh nguồn dinh dưỡng thích hợp bổ sung vào nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) giúp vi khuẩn khử ñạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate có thể loại bỏ ammonium và orthophosphate ñạt hiệu quả cao. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về nước thải chăn nuôi heo 2.1.1. Đặc ñiểm nước thải chăn nuôi heo Nước thải chăn nuôi heo là hỗn hợp gồm: phân, nước tiểu và nước rửa chuồng… một loại nước thải rất ñặc trưng có màu ñen hoặc xanh ñen, ñục và có mùi hôi thối, ñặc biệt nó có khả năng gây ô nhiễm môi trường do có chứa hàm lượng cao các chất hữu cơ, cặn lơ lửng, N, P và vi sinh vật gây bệnh. Theo kết quả ñiều tra ñánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi (2006) tại các cơ sở chăn nuôi heo có quy mô tập trung thuộc Hà Nội, Hà Tây, Ninh Bình, Nam Định, Quảng Nam, Bình Dương, Đồng Nai cho thấy ñặc ñiểm của nước thải chăn nuôi heo như sau: - Hợp chất hữu cơ: chiếm 70–80% bao gồm cellulose, protit, acid amin, chất béo, hidrat carbon và các dẫn xuất của chúng, thức ăn thừa. Các chất vô cơ chiếm 20– 30% gồm cát, ñất, muối, urê, ammonium, muối chlorua, SO42-,… - N và P: khả năng hấp thụ N và P của các loài gia súc, gia cầm rất kém, nên khi ăn thức ăn có chứa N và P thì chúng sẽ bài tiết ra ngoài theo phân và nước tiểu. Trong nước thải chăn nuôi heo thường chứa hàm lượng N và P rất cao. Hàm lượng N-tổng = 200 – 350 mg/l trong ñó N-NH4 chiếm khoảng 80-90%; P_tổng = 60-100mg/l. - Các vi sinh vật gây bệnh: Nước thải chăn nuôi chứa nhiều loại vi trùng, virus và trứng ấu trùng giun sán gây bệnh. Bảng 1. Đặc ñiểm nước thải chăn nuôi heo ở hộ dân TT 1 2 3 4 5 6 7 Thông Đơn số vị BOD5 mg/L COD mg/L TSS mg/L VSS mg/L TKN mg/L T-P mg/L Fecal colifrom MPN/100mL Khoảng giá trị 873 – 1690 1794 – 3871 1528 – 4521 955 – 2753 421 – 778 131 – 512 4,3x106 110x106 TB ± s 1297 ± 201 3022 ± 597 2674 ± 712 1674 ± 485 608 ± 87 342 ± 92 QCVN24:2009/ BTNMT(cột B) 50 100 100 30 6 21,7x106 - (Nguồn: Nguyễn Thị Hồng và Phạm Khắc Liệu, 2012) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT 2.1.2. Hiện trạng ô nhiễm môi trường do chăn nuôi heo Trong những năm gần ñây, ngành chăn nuôi heo phát triển với tốc ñộ rất nhanh nhưng chủ yếu là tự phát và chưa ñáp ứng ñược các tiêu chuẩn kỹ thuật về chuồng trại và kỹ thuật chăn nuôi. Do ñó năng suất chăn nuôi thấp và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng. Ô nhiễm môi trường không những ảnh hưởng ñến sức khỏe vật nuôi, năng suất chăn nuôi mà còn ảnh hưởng rất lớn ñến sức khỏe con người và môi trường sống xung quanh. Mỗi năm ngành chăn nuôi gia súc gia cầm thải ra khoảng 75-85 triệu tấn phân, với phương thức sử dụng phân chuồng không qua xử lý ổn ñịnh và nước thải không qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng. Chất thải chăn nuôi tác ñộng ñến môi trường và sức khỏe con người trên nhiều khía cạnh: gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, môi trường khí, môi trường ñất và các sản phẩm nông nghiệp. Đây chính là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh về hô hấp, tiêu hoá, do trong chất thải chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, trứng giun. Tổ chức y tế thế giới (WHO) ñã cảnh báo: nếu không có biện pháp thu gom và xử lý chất thải chăn nuôi một cách thỏa ñáng sẽ ảnh hưởng rất lớn ñến sức khỏe con người, vật nuôi và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Đặc biệt là các virus biến thể từ các dịch bệnh như lở mồm long móng, dịch bệnh tai xanh ở lợn có thể lây lan nhanh chóng . Cho ñến nay, chưa có một báo cáo nào ñánh giá chi tiết và ñầy ñủ về ô nhiễm môi trường do ngành chăn nuôi gây ra. Theo báo cáo tổng kết hiện trạng môi trường chăn nuôi ở một số tỉnh của viện chăn nuôi năm 2006, hầu hết các hộ chăn nuôi ñều ñể nước thải chảy tự do ra môi trường xung quanh gây mùi hôi thối nồng nặc, ñặc biệt là vào những ngày oi bức. Nồng ñộ khí H2S và NH3 cao hơn mức cho phép khoảng 30-40 lần . Tổng số vi sinh vật và bào tử nấm cũng cao hơn mức cho phép rất nhiều lần. Ngoài ra nước thải chăn nuôi còn có chứa Coliform, E.coli, COD..., và trứng giun sán cao hơn rất nhiều lần so với tiêu chuẩn cho phép. Ô nhiễm môi trường khu vực trại chăn nuôi do sự phân huỷ các chất hữu cơ có mặt trong phân và nước thải của heo. Sau khi chất thải ra khỏi cơ thể của heo thì các chất khí ñã lập tức bay lên, khí thải chăn nuôi bao gồm hỗn hợp nhiều loại khí trong ñó có trên 40 loại gây mùi, chủ yếu là H2S và NH3. Trong ñiều kiện kỵ khí cộng với sự có mặt của vi khuẩn trong phân và nước thải xảy ra quá trình khử các ion sunphate (SO42- Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT ) thành sunphur (S2-). Trong ñiều kiện bình thường thì H2S là một trong những nguyên nhân gây ra các vấn ñề về màu và mùi. Nồng ñộ S2- tại hố thu nước thải chăn nuôi lợn có thể lên ñến 330mg/l cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn (theo TCVN 5945-2005 cột C nồng ñộ sunfur là 1,0mg/l). 2.2 Sơ lược về nitơ và phospho 2.2.1. Sơ lược về nitơ Nitơ là thành phần bắt buộc của các acid amin, protein, acid nucleic, các photpholipid, các hợp chất cao năng (ATP, ADP…), các coenzyme (NAD, FAD…), một số vitamin, diệp lục, một số hormon và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Đó là cơ sở phân tử của mọi cấu trúc và mọi chức năng của tế bào và cơ thể, ñảm bảo duy trì và phát triển sự sống. Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N2 và chiếm khoảng 79% thể tích không khí. Mặc dù sống trong "ñại dương Nitơ" nhưng thực vật nói chung không có khả năng ñồng hóa trực tiếp ñược. Trong môi trường sống, nitơ tồn tại dưới 2 dạng: - Đạm tự do trong khí quyển (N2). Dạng này cây không thể sử dụng ñược. - Dạng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ. + Hợp chất nitơ vô cơ trong các muối ammonium (NH4+), muối nitrate (NO3- ) + Nitơ hữu cơ của các protein ở dạng xác bã ñộng vật, thực vật chưa phân giải hoàn toàn, ở dưới dạng mùn protein. Tất cả các nitrate trong ñất, hay trong các nguồn nước như ao, hồ, ruộng...ñều ñược tạo thành do hoạt ñộng sống của vi khuẩn nitrite hóa và vi khuẩn nitrate hóa. Còn các vi khuẩn amon (ammonium) hóa cũng phát triển mạnh, chúng phân giải protein của các xác bã ñộng, thực vật và vi sinh vật, bổ sung lượng dự trữ amon cho ñất. Riêng nguồn nitơ phân tử của khí quyển (N2) chỉ có nhóm vi sinh vật ñất mới có khả năng ñồng hóa nguồn nitơ này. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT Ngoài ra nhờ các quá trình tổng hợp hóa học khi có sự phóng ñiện trong các cơn giông mà từ N2 có thể hình thành các dạng NO2-, NO3-, NH4+. Tuy nhiên nguồn này ít quan trọng vì chỉ cung cấp một lượng nhỏ. 2.2.2 Sơ lược về phospho Phospho là chất dinh dưỡng chủ yếu cần cho tất cả các tế bào sống, phospho cấu tạo nên adenosine triphosphate (ATP), acid nucleic (DNA và ARN), phospholipid, acid teichoic, acid teichuronic. ATP là phân tử giàu năng lượng, ñược dùng ñể vận chuyển năng lượng trong tế bào. Phospholipid là thành phần quan trọng trong cấu trúc của màng tế bào. Acid teichoic, acid teichuronic là thành phần quan trọng trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương. Phospho còn ñược dự trữ trong tế bào như là hạt nhỏ volutin hay polyphosphatex Phospho có thể chiếm từ 1 - 3% trọng lượng khô của vi khuẩn. Phospho có thể tồn tại ở dạng hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng vô cơ của phospho gồm orthophosphate và polyphosphate. + Orthophosphate có giá trị ñối với sự chuyển hóa sinh học mà không cần có thêm sự bẻ gãy, ñược coi như là chất dinh dưỡng phospho có giá trị cho vi khuẩn sử dụng trong các hệ thống xử lí nước thải và cho thực vật thủy sinh trong nước tự nhiên. Orthophosphate bao gồm PO43-, HPO42-, H2PO4- và H3PO4. Dạng orthophosphate phổ biến nhất trong các hệ thống xử lí nước thải là HPO42-, H2PO4-. Số lượng của mỗi dạng là tùy thuộc vào pH. Trong hầu hết các hệ thống xử lí nước thải, HPO42-, H2PO4- là dạng nổi trội ở giá trị pH lớn hơn 7. + Polyphosphate là phân tử phức hợp với hai hay nhiều nguyên tử phospho, nguyên tử oxi và có thể có nguyên tử hydro, polyphosphate ñược thể hiện bằng công thức hóa học của ion pyrophosphate (P2O73-), pyrophosphate là thành phần ñầu tiên trong chuỗi polyphosphate không phân nhánh ( P2O73-, P3O105-….). Polyphosphate trải qua sự thủy phân rất chậm và phóng thích orthophosphate, sự thủy phân có thể ñược thực hiện bằng phương pháp hóa học hoặc bằng sinh học nhờ vi khuẩn và tảo. Sự thủy phân của polyphosphate chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm thời gian và pH trong bình phản ứng hiếu khí, dạng chính của orthophosphate ñạt ñược từ sự thủy phân là tùy thuộc vào pH (Gerardi, 2006). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT Hình 1. Chuỗi cấu trúc của polyphosphate (Nguồn: www.dairyscience.info/industrial...sms.html, ngày 22/11/2012) + Nhờ vào tính ổn ñịnh của nước, Polyphosphate còn dễ dàng tách khoáng như là aluminum, calcium, và iron. Phosphate (Pi) có thể gắn với các hợp chất hữu cơ gọi là phospho hữu cơ. Những hợp chất phospho hữu cơ thì ít quan trọng trong nước thải chăn nuôi nhưng nó trở nên ñáng lo ngại trong nước thải công nghiệp và bùn, những dạng chất hữu cơ phổ biến của phospho gồm inositol phosphate, acids nucleic, phospholipid, và phytin. Phytin là acid hữu cơ tìm thấy ở bắp và ñậu nành rất khó phân hủy. Phospho tổng bao gồm phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Nguồn chủ yếu của phospho thải ra ñối với hệ thống xử lí nước thải ñô thị bao gồm nước thải của con người, thuốc tẩy rửa và nước thải công nghiệp. Orthophosphate chiếm từ 50 - 70% phospho tổng, trong khi polyphosphate và phospho hữu cơ chiếm từ 30 - 50% phospho tổng (Gerardi, 2006). 2.3 Sơ lược về vi khuẩn khử ñạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn khử ñạm Pseudomonas stutzeri Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Loài: Pseudomonas stutzeri (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_stutzeri, ngày 20/12/2012) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT Giống Pseudomonas là một trong những giống vi khuẩn ña dạng có vai trò ñặc biệt quan trọng trong các chu trình carbon và nitơ. Pseudomonas stutzeri là thành viên nổi bật của giống này. P. stutzeri ñầu tiên ñược phân lập bởi Burri và Stutzer (1895), có tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau ñó ñổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen. Van Niel và Allen (1952) mô tả vi khuẩn P. stutzeri có dạng hình que, khử ñược nitơ. Khuẩn lạc có dạng nhăn nheo, khô khan và bám chặt với nhau. P. stutzeri là vi khuẩn gram âm, hình que, có roi và di chuyển ñược, không tạo bào tử và là loài vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn P. stutzeri có giới hạn nhiệt ñộ rất rộng, từ 40C ñến 450C, tùy thuộc vào ñặc tính riêng của từng dòng (Lalucat et al., 2006). Khả năng khử nitrate của Pseudomonas stutzeri cơ bản dựa trên toàn bộ các gen mã hóa cho các enzyme dị hóa nitrat (dissimilatory reductase) chứa bên trong. Chúng bao gồm: gen nar (nitrate reductase), gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitric oxide reductase) và gen nos (nitrous oxide reductase) (Lalucat et al., 2006). Tổ chức của toàn bộ các gen này trong vi khuẩn Pseudomonas stutzeri ñược trình bày trong Hình 3. Hình 2. Tổ chức của các gen tham gia vào quá trình khử nitrate của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri ( Nguồn: Lalucat et al., 2006) Vi khuẩn P. stutzeri có khả năng loại trừ nitơ từ NO3- giải phóng N2, chúng có thể tăng trưởng trong ñường maltose và tinh bột (Bennasar et al, 1998). P. stutzeri ñược tìm thấy trong nước, ñất là loài có tính ña dạng sinh học cao, sống không kiên ñịnh và phân bố rộng rải khắp vùng ñịa lý (Zumft, W.G., 1997). P. stutzeri có khả năng khử nitơ theo nhiều con ñường khác nhau, khử nitrate thành N2 mà không có sự tích lũy nitrite, khử nitrate theo hai bước (khử NO3- thành NO2- và khử NO2- thành N2), khử nitrate với sự tích tụ nitrite ở nồng ñộ thấp (Su et al, 2001). Sự biến ñổi nitrite là một bước quan trọng trong chu trình nitrogen, trong ñó NO2 bị khử thành NO sau ñó thành N2. Hầu hết các enzyme khử nitơ của P. stutzeri ñược nghiên cứu bao quát. Enzyme khử nitrate và nitrite thể hiện khi nồng ñộ oxy hòa tan không vượt quá 5% và Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 2009 - 2013 Trường ĐHCT 2,5%, trong khi ñó enzyme khử nitrous oxide hiện diện khi nồng ñộ oxy không cao hơn 5% (Korner và Walter G. Zumft, 1989). Ở nồng ñộ oxy bão hòa các chất nhận ñiện tử có nguồn gốc nitơ không bị ảnh hưởng trên sự hiện diện enzyme khử nitơ của vi khuẩn P. stutzeri. Ở nồng ñộ oxy bão hòa 27%, nitrate kích thích sự thể hiện hầu hết các enzyme khử nitrate và thể hiện ñáng kể enzyme khử nitrite, nitrous oxide (Korner và Walter G. Zumft, 1989). 2.3.2 Sơ lược về vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus subtilis (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis, ngày 26/12/2012). Vi khuẩn Bacillus subtilis ban ñầu ñược ñặt tên là Vibrio subtilis bởi Ehrenberg vào năm 1835 và ñến năm 1872 ñược ñổi tên thành Bacillus subtilis bởi Ferdinand Cohn (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis, ngày 26/12/2012). Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hình que (dài 2 – 3 µm, rộng 0,7 0,8 µm), có khả năng sinh bào tử, hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, phân bố rộng khắp trong môi trường nhưng tập trung nhiều nhất trong ñất (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Một trong những ñặc ñiểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những ñiều kiện nhất ñịnh. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp ñiều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt ñộ không thích hợp,…) (Tô Minh Châu, 2000). Vi khuẩn Bacillus subtilis là loài hiếu khí ngoại trừ sự hiện diện của glucose và nitrate, một số tăng trưởng kỵ khí có thể xảy ra. Bacillus subtilis phát triển tối ưu trong khoảng nhiệt ñộ 25 – 350C. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học