Tài liệu Ứng dụng phương pháp phân tích dna góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi dalbergia của việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT DƢƠNG VĂN TĂNG ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài : ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM Học viên: Dƣơng Văn Tăng Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Phòng Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Lời cảm ơn Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Phòng, Phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học. Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn những chia sẻ, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp của TS. Nguyễn Minh Tâm, Ths. Trần Thị Việt Thanh và CN. Vũ Thị Thu Hiền cùng toàn thể cán bộ phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu và sự hỗ trợ kỹ thuật của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học trong việc xác định trình tự DNA. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010 Học viên Dƣơng Văn Tăng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010 Học viên Dƣơng Văn Tăng MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia)............ 3 1.1.1. Vị trí phân loại ....................................................................................................... 3 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý.................. 4 1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth .................................................................................. 5 1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre ....................................................................... 6 1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain ..................................................................... 7 1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain ................................................................................ 7 1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz ................................................................................ 8 1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật ................................................... 9 1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) ...................................... 9 1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh ............................................................................ 10 1.2.3. Phƣơng pháp hoá học ........................................................................................... 10 1.2.4. Phƣơng pháp phân loại học phân tử ..................................................................... 11 1.3. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật ............................. 13 1.3.1. Cấu trúc hệ gene lục lạp ....................................................................................... 13 1.3.2. Vùng ITS nhân ..................................................................................................... 15 1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử .......................................... 16 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 20 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................................ 23 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số .................................... 23 2.2.2. Thiết kế cặp mồi ................................................................................................... 23 2.2.3. Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR .......................................................... 23 2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................... 24 2.2.5. Giải trình tự DNA ................................................................................................ 24 2.2.6. Phân tích số liệu ................................................................................................... 24 Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 25 3.1. Kết quả tách chiết DNA .......................................................................................... 25 3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp ............ 26 3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4 ..................................... 26 3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH ................................... 27 3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK ................................. 28 3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL .................................... 29 3.3. Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu .............................................................. 30 3.3.1. Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân ............................................................... 30 3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH ................................................................ 33 3.3.3. Kết quả giải mã trình tự gen matK ....................................................................... 35 3.3.4. Kết quả giải mã trình tự gen trnL ......................................................................... 38 3.4. Kết quả thống kê đặc điểm DNA của bộ số liệu trình tự giữa 5 loài ...................... 40 3.4.1. Các vị trí nucleotide mang thông tin tiến hoá (parsimony) ................................. 40 3.4.2. So sánh sự biến đổi nucleotide giữa 4 vùng gen nghiên cứu của 5 loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia ........................................................................................................ 43 3.4.3. Khoảng cách di truyền giữa 5 loài nghiên cứu .................................................... 44 3.4.4. Cây phát sinh chủng loại ...................................................................................... 48 3.5. Xác định nguồn gốc loài ......................................................................................... 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 57 Kết luận .......................................................................................................................... 57 Kiến nghị ........................................................................................................................ 58 PHỤ LỤC.......................................................................................................................67 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Đa hình chiều dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) Barcode Mã vạch bp Cặp bazơ (base pair) BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam CITES Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species) cpDNA Axít Deoxyribonucleotide lục lạp (Choloroplast Deoxyribo Nucleotide Acid) cpSSR Các trình tự lặp lại đơn giản của lục lạp (Chloroplast Simple Sequence Repeat) DNA Axít Deoxyribonucleotide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EN Nguy cấp (Endangered) Genbank Ngân hàng gen quốc tế ISSR Các trình tự lặp lại bên trong (Inter-Simple Sequence Repeat) ITS Internal Transcribed Spacer IUCN Hiệp hội bảo vệ thiên nhiên quốc tế (International Union for Conservation of Nature) MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hoá phân tử (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (Nationa Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor Joining NTS Khoảng trống không đƣợc sao chép (Non Transcribed Spacer) OD Mật độ quan học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) psbA Gen mã hóa protein D1, enzyme tham gia quang hóa II RAPD Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RNA Axít Ribonucleotide RFLP Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SSR Các đoạn lặp lại (Simple Sequence Repeat) tRNA RNA vận chuyển (transfer- RNA) trnF RNA vận chuyển Phenylalanine trnH RNA vận chuyển Histidine trnL RNA vận chuyển Leucine trnT RNA vận chuyển Threonine UV Ánh sáng tử ngoại (Ultraviolet) VQG Vƣờn quốc gia DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách và một số thông tin về mẫu vật nghiên cứu 20 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 2.3. Mã số của 50 trình tự nulcleotide gen trnL thuộc 36 loài trong Genbank sử 22 dụng lập cây phân loại Bảng 3.1. Một số thông số thống kê biến đổi nucleotide khi so sánh giữa 5 loài 42 nghiên cứu Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu của 5 loài gỗ quý 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hệ gen lục lạpcủa hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007) Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên gel agarose 13 15 25 0,9% Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9% Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi psbA - trnH trên gel agarose 0,9% Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi matK - matK trên gel agarose 0,9% Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi trnL - trnL trên gel agarose 0,9% Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng ITS giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu Hình 3.7. Kết quả so sánh trình nucleotide vùng đệm psbA - trnH giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu Hình 3.8. Kết quả so sánh trình nucleotide gen matK giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu Hình 3.9. Kết quả so sánh trình nucleotide gen trnL giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu Hình 3.10. Mô hình 6 loại đột biến nucleotide Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của 5 loài Dalbergia nghiên cứu với 4 gen ITS, trnL, matK và psbA – trnH Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor – Joining của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình tự gen trnL Hình 3.13. Cây hình toả tròn của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình tự gen trnL 27 28 29 29 33 35 37 39 45 50 52 54 Dương Văn Tăng MỞ ĐẦU Chi trắc (Dalbergia) gồm nhiều loài cây thân gỗ có kích thƣớc từ nhỏ đến trung bình, thuộc họ đậu (Febaceae). Đây là chi điển hình của rừng nhiệt đới với khoảng 300 loài. Ở Việt Nam có khoảng 27 loài, phân bố rộng khắp ở các vùng rừng kín từ Bắc vào Nam [13]. Hiện nay, nhiều loài cây gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị khai thác cạn kiệt do có giá trị kinh tế và thƣơng mại cao nhƣ Cẩm lai (Dalbergia oliveri Gamble ex Prain), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis Pierre), Trắc đen (Dalbergia nignescens Kurz), cây Sƣa (Dalbergia tonkinensis Prain), Cọ khẹt (Dalbergia assamica Benth) và Trắc dao (Dalbergia cultrata Grah. ex Benth). Trong đó, ba loài Cẩm lai, Trắc đỏ và Sƣa đã đƣợc ghi vào “Danh Lục Đỏ Việt Nam, 2007” [1] và cũng đã đƣợc Chính phủ Việt Nam quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/6/2006). Mặc dù việc phân loại những loài thuộc chi Trắc ở Việt Nam đã đƣợc thực hiện từ những năm 1875 (Niyomdham et al, 1987), [50] nhƣng đến nay vẫn chƣa có công trình nghiên cứu phân loại nào đƣợc thực hiện có hệ thống chi tiết cho tới loài. Hiện nay, phƣơng pháp phân loại vẫn chủ yếu dựa trên đặc điểm hình thái trƣớc hết là cơ quan sinh sản nên thƣờng gặp khó khăn trong nhiều trƣờng hợp do quá trình biến đổi trung gian về một số đặc điểm. Hơn nữa, trong thực tế, sự biến đổi hình thái theo môi trƣờng sống của một loài đã tạo ra không ít khó khăn cho việc nhận dạng bằng phƣơng pháp hình thái, thậm chí trong một số trƣờng hợp còn có sự nhầm lẫn và sai lệch về vị trí phân loại. Công nghệ sinh học hiện đại hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào của mẫu. Phƣơng pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) sử dụng các dữ liệu về cấu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến hoá giữa các loài sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong 1 Luận văn Thạc sỹ sinh học phạm vi loài. Mặc dù mới ra đời nhƣng phƣơng pháp phân loại học phân tử đã nhanh chóng trở thành một phƣơng pháp nghiên cứu có hiệu quả trong việc nhận dạng taxon mức độ loài. Tuy chƣa thể trở thành phƣơng pháp phân loại chính thống, xong phân loại học phân tử đang là công cụ đắc lực hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại hình thái và là phƣơng pháp phù hợp cho nghiên cứu phân loại học hiện nay (Weiguo et al., 2005; Eric et al., 1992; Jose et al., 2007) [71, 36]. Đối với thực vật hai nhóm gen chính thƣờng đƣợc sử dụng là gen nhân (ITS) và hệ gen lục lạp (cpDNA). So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trƣờng. Vì tính ƣu việt này, đến nay trong ngân hàng Genbank đã lƣu trữ hàng trăm trình tự DNA khác nhau đặc trƣng cho chi Dalbergia, đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác ứng dụng để nghiên cứu phân loại (Benedic et al., 2007; Juschum et al., 2007) [25, 37]. Nhằm ứng dụng phƣơng pháp phân loại phân tử vào phân loại và nhận dạng những loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: “Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia của Việt Nam” với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: - Sử dụng hai vùng gen nhân và vùng gen lục lạp góp phần vào việc phân loại 5 loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị đe doạ tuyệt chủng của Việt Nam. - Góp phần đánh giá nhanh và hữu hiệu tính đa dạng sinh học làm cơ sở cho việc bảo tồn và phục hồi một số loài gỗ quý hiếm ở Việt Nam đồng thời giúp các nhà quản lý và cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết sâu hơn về quan hệ họ hàng ở mức độ taxon và mức độ tiến hoá phân tử. 2 Dương Văn Tăng Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 1.1.1. Vị trí phân loại Dalbergia là một chi lớn thuộc họ đậu (Fabaceae) nằm trong bộ Đậu (Fabales) phân lớp Hoa hồng (Rosidae) thuộc lớp hai lá mầm (Dicotydoneae) ngành thực vật hạt kín (Magnoliophyta). Tên họ trƣớc đây là Leguminosae. Đứng sau họ Orchidaceae và Asteraceae, với khoảng 730 chi và hơn 19400 loài. Chi lớn nhất là Astragalus với hơn 2000 loài, tiếp sau là Acacia với hơn 900 loài và Indigofera với khoảng 700 loài. Các chi lớn khác bao gồm Crotalaria với 600 loài và Mimosa với 500 loài [53,54]. Các loài thuộc họ đậu phân bố khắp thế giới, một số loài là cây nông nghiệp quan trọng, bao gồm đậu tƣơng (Glycine max), đậu Hà Lan (Pisum sativum), đậu nhỏ (Cicer arietinum), lạc (Arachis hypogaea), cây carob (Ceratonia siliqua) và cam thảo (Glycyrrhiza glabra)... Họ đậu đƣợc xếp vào bộ đậu Fabales theo hệ thống phân loại APG III (2009). Họ đậu gồm 3 phân họ (theo hệ thống Cronquist và Dahlgren) : + Mimosoideae: gồm 80 chi và 3200 loài. Hầu hết phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Mỹ, nơi có nhiệt độ ấm áp. + Caesalpinioideae: gồm 170 chi và 2000 loài + Faboideae: gồm 470 chi và 14000 loài Tuy nhiên, sự phân chia của Cronquist và Dahlgren không đƣợc các nhà nghiên cứu DNA cuối thể kỷ XX và đầu thế kỷ XXI ủng hộ. Kết quả nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy phân họ Caesalpinoideae là một paraphyly, nghĩa là các loài trong phân họ này không có cùng nguồn gốc tiến hoá. Ngƣợc lại 2 phân họ Faboideae và Mimosoideae là những monophyly lớn, nghĩa là các loài trong phân họ có cùng nguồn gốc tiến hoá. Tông Cercideae của phân họ Caesalpinioideae có thể là một nhóm chị em với nhóm các loài còn lại của phân họ này. Hơn nữa, một số chi đƣợc xếp vào phân họ 3 Luận văn Thạc sỹ sinh học Caesalpinioideae không đƣợc chấp nhận. Các bằng chứng hoá thạch và phát sinh loài cho thấy họ đậu đƣợc hình thành ở những vùng khô hạn hoặc nửa khô hạn dọc theo con đƣờng biển Tethys ở kỷ thứ ba (Tertiary) của quá trình hình thành địa chất. Họ đậu gồm các cây từ thân gỗ lớn đến các cây bụi, có cụm hoa không rõ ràng, đôi khi tiêu biến thành hoa đơn tính. Hoa có đài hoa (hypanthium) ngắn và noãn đơn với cuống noãn ngắn sau khi thụ phấn sẽ tạo thành quả đƣợc gọi là quả đậu. Lá thƣờng kép mọc so le, có thể chẵn hoặc lẻ, có hình xẻ lông chim, luôn luôn có lá kèm. Lá kèm có dạng hình lá, hình gai hoặc khó nhìn thấy. Mép lá có thể liền hoặc xẻ răng cƣa. Tuyến mật ngoài hoa thƣờng thấy ở những loài thuộc phân họ Mimosoideae và Caesalpinioideae, nó cũng có ở một số loài thuộc phân họ đậu Faboideae [53, 55]. 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý Dalbergia là một chi lớn bao gồm những cây có kích thƣớc trung bình và nhỏ, thân bụi hoặc dây leo, thuộc họ đậu Fabaceae, phân họ Faboideae. Chi này có phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới Trung, Nam Mỹ, Châu Phi, Madagascar và Châu Á. Số lƣợng loài trong chi đến nay vẫn là dấu hỏi và chƣa có câu trả lời chính xác. Theo thống kê của các nhà khoa học trên thế giới, hiện nay ƣớc tính có từ 100 – 600 loài (International Legume Database & Information Service) Nhiều loài trong chi Dalbergia là những cây gỗ quý, có hoa vân đẹp, có giá trị kinh tế và giá trị bảo tồn cao. Một số loài có giá trị trong chi Dalbergia nhƣ hai loài hồng sắc (rosewood), một loài có ở tây bán cầu (Hồng Sắc Brazilian - D. nigra) đƣợc đƣa vào phụ lục I của CITES (Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp). Loài thứ hai là hồng sắc Ấn Độ - D. latifolia, loài này có giá trị kinh tế cao vì gỗ cứng và có vân rất đẹp. Ngoài ra trong chi Dalbergia còn có nhiều loài có giá trị bảo tồn nhƣ: Dalbergia baronii, Dalbergia brownei, Dalbergia cearensis, Dalbergia cochinchinensis, Dalbergia decipularis, Dalbergia ecastaphyllum, Dalbergia frutescens, Dalbergia louvelii, Dalbergia madagascariensis, Dalbergia melanoxylon, Dalbergia nigra, 4 Dương Văn Tăng Dalbergia oliveri, Dalbergia sissoo, Dalbergia stevensonii, Dalbergia tonkinensis, Dalbergia tucarensis, Dalbergia variabilis Ở Việt Nam, chi Dalbergia có khoảng 27 loài, trong đó nhiều loài còn chƣa rõ ràng (chƣa định tên chính xác hoặc còn nghi ngờ). Ba loài Cẩm Lai (Dalbergia oliverri), Trắc đỏ (Dalbergia cochinchinensis) và Sƣa (Dalbergia tonkinensis) là loài đặc hữu và có giá trị bảo tồn cao. Tuy nhiên, những năm gần đây, số lƣợng cá thể của những loài này đã giảm sút nghiêm trọng do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhƣng chủ yếu là do lợi nhuận kinh tế nên 3 loài trên bị khai thác quá mức. Năm 2007, ba loài Cẩm lai, Trắc đỏ, Sƣa đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam - cấp EN A1a, c,d (có nguy cơ tuyệt chủng) (Đặng Ngọc Thanh et al., 2007) [1] và đƣợc Chính phủ Việt Nam quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm. Ngoài ra hai loài Trắc đen (Dalbergia nigresens) và Cọ khẹt (Dalbergia assamica) là những loài gỗ quý có giá trị kinh tế và đang có nguy cơ bị thu hẹp do vậy hai loài này cũng cần đƣợc quan tâm bảo vệ và khai thác một cách hợp lý. 1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth Dalbergia assamica Benth đƣợc Bennth đặt tên vào năm 1852, có tên gọi khác là D. lanceolaria (Thoth, 1983), D. balansae (Prain, 1901). Ở Việt Nam thƣờng gọi là Cọ khẹt, Cọ khiết, Bạt ong, Trắc balansa, Sƣa hạt tròn, Muồng nƣớc, Trắc assam. Cọ khẹt là cây gỗ trung bình, cao từ 12 – 20m. Lá có sóng dài 20 – 25cm; lá phụ 13 – 21, tròn dài 4- 5 x 2-3 cm, đầu tròn hay hơi lõm, gân - phụ rất mảnh, mặt dƣới có lông nằm cuống - phụ 4 – 5 mm. Chùm tụ tán ngắn ở nách lá, cao 10 – 15cm, trục và nhánh có lông mịn; vành trắng; tiểu nhuỵ 5. Nhánh mang trái đen kích thƣớc 5- 7 x 1,2cm, không lông; hột 1 (có thể có 3 – 4 hột), tròn, rộng 12mm. Cọ khẹt là cây ƣa sáng, phát triển nhanh, mọc trong rừng hỗn giao thứ sinh thƣờng xanh hoặc rụng lá, ở độ cao 1500m, trên đất sung tích ven sông suối. Ra hoa vào thời gian từ tháng 5 đến tháng 7, có quả tháng 9 -12 và tồn tại lâu trên cây. 5 Luận văn Thạc sỹ sinh học Ở Việt Nam: Cọ khẹt phân bố ở Lai Châu (Pù Nhung), Lào Cai (Bắc Hà, Phố Lu, Bảo Nhai), Sơn La (Thuận Châu, Sông mã, Mộc Châu), Quảng Ninh (Hà Cối), Vĩnh Phúc, Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Chợ Bờ), Hà Nam (Đại Đồng), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Thanh Hoá (Phong Y), Nghệ An (Quỳ Châu), Hà Tĩnh (Hƣơng Sơn), Quảng Trị (đèo Ailao, Đông Chê), Lâm Đồng (Đơn Dƣơng), Đồng Nai. Trên thế giới: Cọ khẹt chỉ còn ở Ấn Độ, My-an-ma, Trung Quốc, Lào, Căm-puchia và Thái Lan [13, 14, 41, 6]. 1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre Do Pierre đặt tên vào năm 1898. Có tên gọi khác là Dalbergia cambodiana (1898, Pierre), tên thƣờng gọi ở Việt Nam là Trắc đỏ, Trắc bông, Cẩm lai nam, Giầu ca (Gia Rai), Ka rắc (Ba Na), Ka nhoung. Trắc đỏ là cây gỗ trung bình, cao 15 – 30m đƣờng kính 80cm hoặc hơn. Gỗ đỏ sậm, sau đen đi. Lá dài 15 – 20 cm; lá - phụ 7 – 9 mọc nhƣ đối, dài 3 – 5 cm, xoan, có mũi ngắn, không lông, mốc mốc mặt dƣới. Chùm-tụ tán dài 7 -15cm; hoa trắng; đài không lông; tiểu nhuỵ 9. Trái rất mỏng, hẹp, có kích thƣớc 5 – 6 x 1cm, hột 1 – 2, màu nâu. Cây mọc trong rừng rậm nửa rụng lá hoặc rừng thƣa hỗn giao rụng lá, ở độ cao dƣới 800m, ƣa đất sét pha cát có lớp đất sâu. Ra hoa tháng 5 – 8, có quả tháng 9 – 12. Ở Việt Nam Trắc đỏ phân bố ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Dƣơng, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang (VQG Phú Quốc). Trên thế giới Trắc đỏ chỉ có ở Lào, Căm-pu-chia và Thái Lan. Trắc đỏ là loài gỗ quý, thớ mịn, nặng, rất cứng, không bị mối mọt, dùng đóng đồ mộc cao cấp (bàn ghế, salông, sập, giƣờng, tủ), làm nhạc cụ, đồ chạm trổ và hàng mỹ nghệ. Trắc đỏ là cây gỗ quý nên bị khai thác cạn kiệt, số cá thể trƣởng thành giảm 6 Dương Văn Tăng mạnh, hơn nữa nạn phá rừng đã làm cho loài này bị xâm hại nghiêm trọng. Sách Đỏ Việt Nam 2007 đã xếp loài này vào loại nguy cấp EN A1a, c, d. [13, 1, 14, 41, 6] 1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain Do Prain và Gamble đặt tên năm 1897, tên gọi khác là Dalbergia bariensis (Pierre, 1898), Dalbergia dongnaiensis (Pierre, 1898). Tên thƣờng gọi là Cẩm lai, Cẩm lai bà rịa, Cẩm lai đồng nai, Cẩm lai vú, Cẩm lai bông, Cẩm lai mật, Trắc lai. Cẩm lai đƣợc ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN A1a, c, d (đang có nguy cơ rất lớn bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên) Cẩm lai là loài gỗ lớn, cao từ 25 – 30m, đƣờng kính 60 – 80cm, rụng lá mùa khô, gỗ quý, màu đỏ, thớ mịn, nặng, cứng, không bị mối mọt dùng đóng đồ mộc cao cấp. Cây ƣa sáng, mọc trong rừng rậm thƣờng xanh hoặc nửa rụng lá, rừng thƣa hỗn giao rụng lá và rừng thƣa cây họ Dầu, ở độ cao tới 1000m, phát triển mạnh trên đất feralit đỏ nâu và vàng nâu, đất đỏ bazan ẩm, ven suối. Ra hoa tháng 12 – 1 (năm sau), có quả tháng 2 – 4. Ở Việt Nam: Cẩm lai phân bố ở Quảng Trị, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Dƣơng, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu. Trên thế giới: quần thể Cẩm lai chỉ còn ở My-an-ma, Lào, Căm-pu-chia, Thái Lan [1, 13, 41]. 1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain Đƣợc đặt tên bởi Prain, 1901. Tên gọi khác là Dalbergia rimosa (Phamh, 1991). Tên thƣờng gọi là Sƣa, Sƣa trắng, Trắc bắc bộ, Trắc thối. Cây Sƣa cao 15 – 25m, đƣờng kính 40 – 80 cm, gỗ thớ mịn, cứng, thơm, không bị mối mọt, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc cao cấp, làm hàng mỹ nghệ và đồ tiện 7 Luận văn Thạc sỹ sinh học khắc. Mọc rải rác trong rừng rậm thƣờng xanh nguyên sinh và thứ sinh, ở độ cao tới 350–500m, trên đất tốt, sâu, dày. Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 9–11. Ở Việt Nam: cây Sƣa phân bố ở Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Hà Tây, Hoà Bình, Ninh Bình, Nghệ An. Trên thế giới: cây Sƣa chỉ có còn ở Trung Quốc. Với quần thể ngày càng thu hep, cây Sƣa đang có nguy cơ tuyệt chủng cao ngoài thiên nhiên. Cây Sƣa đƣợc ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam, 2007 – cấp EN A1a, c, d. Hiện nay cây Sƣa đang bị “tàn sát” ngoài thiên nhiên do giá trị kinh tế cao và có những thông tin cho rằng ngƣời Trung Quốc dùng gỗ cây Sƣa để làm đồ thờ, chế thuốc chữa ung thƣ dạ dầy và các chủ buôn săn lùng Sƣa với giá 200 triệu đồng/1kg. Chính những nhu cầu “thất thiệt” đã đẩy cây Sƣa phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng rất cao [13, 1, 14, 41]. 1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz Do Kurz đặt tên năm 1875. Tên gọi khác là Dalbergia paniculata (Roxb, 1789) Dalbergia lanceolaria (Thoth, 1987). Tên thƣờng gọi là Trắc đen, Quành quạch. Trắc đen là cây gỗ trung bình, cao 10 – 20m, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc cao cấp, vỏ dùng nhuộm đen. Trắc đen thƣờng mọc rải rác trong rừng thƣa và rừng hỗn giao rụng lá, ở độ cao dƣới 500m. Ra hoa tháng 3–5, có quả tháng 8–12. Ở Việt Nam: Trắc đen phân bố ở Đắk Lắc, Đồng Nai, Biên Hòa, Tây Ninh, Sơn La. Trên thế giới: Trắc đen chỉ có ở My-an-ma, Lào và Thái Lan. Gỗ của loài Trắc đen đƣợc dùng trong xây dựng hay đóng đồ mộc nhƣ giƣờng, tủ, bàn, ghế. Với quần thể hẹp và có giá trị sử dụng, loài này đang bị săn lùng quá mức (Nguyễn Tiến Bân, 2003) [13]. 8 Dương Văn Tăng 1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật Hiện nay, phƣơng pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc chung đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau, thực vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá ..., một số phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ: 1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dƣỡng khi điều kiện môi trƣờng thay đổi. Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái. Đây là phƣơng pháp cổ điển nhƣng hiện nay vẫn đƣợc dùng phổ biến [10]. hạn chế của phƣơng pháp này đã đƣợc ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhƣng có hình thái rất giống nhau và ngƣợc lại. Phƣơng pháp phân loại hình thái thực sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dƣới loài [2]. Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhƣng các tính trạng hình thái thƣờng biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tƣơng đồng là rất khó. Hiện tƣợng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song và tiến hoá ngƣợc dẫn đến các đặc điểm tƣơng tự giữa các loài có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện môi trƣờng giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới. Việc phân biệt đặc điểm tƣơng đồng với đặc điểm tƣơng tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là ở các bậc phân loại thấp. Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác định đƣợc sự tƣơng đồng. Vì vậy hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định. Ƣu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu dài và đã xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật tƣơng đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng. Nhƣng hệ thống học truyền thống có 9 Luận văn Thạc sỹ sinh học nhƣợc điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới loài [2]. 1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh Đến thế kỷ IXX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật có điều kiện phát triển. Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, các nhà phân loại học còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại. Việc sử dụng phƣơng pháp này đã nhận đƣợc các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật. Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng đƣợc những tiêu chuẩn phân loại cho các chi, các loài thuộc họ Labiaceae. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh không đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp nhƣng cho kết quả khá chính xác. Đối với các loài cây gỗ thƣờng sử dụng đặc điểm giải phẫu thân gỗ để định loại, ngƣợc lại các loài thân thảo thƣờng sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để định loại gỗ và các thanh gỗ thành phẩm dùng để xuất khẩu. 1.2.3. Phƣơng pháp hoá học Có nhiều phƣơng pháp phân tích hoá học khác nhau đƣợc sử dụng trong nghiên cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hƣơng, Xá xị, Pơ mu...) dùng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phƣơng pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của 10